Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Podsumowanie

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Streszczenie

Rozwój i utrzymanie immunosupresyjnych regulacyjnych limfocytów T (Tregs) CD4⁺ przyczyniają się do tolerancji obwodowej niezbędnej do zachowania homeostazy immunologicznej w obliczu ogromnej ilości antygenów własnych i komensalnych w organizmie człowieka i na jego powierzchni. Zaburzenia równowagi między komórkami Tregs a zapalnymi konwencjonalnymi limfocytami T mogą prowadzić do immunopatologii lub nowotworów. Choć terapeutyczna iniekcja komórek Tregs okazała się skuteczna w mysich modelach colitis¹, cukrzycy typu I², reumatoidalnego zapalenia stawów oraz choroby przeszczep przeciw gospodarzowi,⁴ kilka fundamentalnych różnic w biologii komórek Treg u ludzi i myszy⁵ do tej pory uniemożliwiało zastosowanie kliniczne. Brak odpowiedniej liczby, czystości, stabilności oraz specyficzności homingu terapeutycznych komórek Tregs wymusił stworzenie dynamicznej platformy rozwoju ludzkich komórek Treg, która pozwoliłaby zoptymalizować warunki ich ekspansji ex vivo⁶.

Opisujemy tutaj metodę różnicowania indukowanych limfocytów T regulatorowych (iTregs) z krwi obwodowej jednego dawcy człowieka, którą można podzielić na cztery etapy: izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej, selekcję magnetyczną limfocytów T CD4⁺, hodowlę komórkową in vitro oraz sortowanie komórek metodą FACS (fluorescence activated cell sorting) w celu wyodrębnienia subpopulacji limfocytów T. Ponieważ charakterystyczny dla Treg czynnik transkrypcyjny forkhead box P3 (FoxP3) jest u ludzi czynnikiem indukowanym aktywacją⁷ i nie istnieje inny unikalny marker, do identyfikacji limfocytów T o aktywności supresyjnej należy zastosować kombinacyjny panel markerów. Po sześciu dniach hodowli komórki w naszym systemie mogą zostać podzielone na naiwne limfocyty T, limfocyty T pamięci lub iTregs na podstawie względnej ekspresji CD25 i CD45RA. Ze względu na to, że limfocyty T pamięci i naiwne wykazują różne raportowane wymagania dotyczące polaryzacji oraz różną plastyczność⁸, wstępne sortowanie początkowej populacji limfocytów T na subpopulacje CD45RA⁺ i CD45RO⁺ może posłużyć do zbadania tych różnic. Zgodnie z innymi doniesieniami, nasze iTregs CD25^HiCD45RA^- wykazują wysoką ekspresję FoxP3⁹ , GITR i CTLA-4¹¹ oraz niską ekspresję CD127¹² . Po przeprowadzeniu sortowania FACS każdej populacji, uzyskane komórki można wykorzystać w teście supresji, który ocenia względną zdolność do hamowania proliferacji autologicznych limfocytów T znakowanych karboksyfluoresceiną sukcynimidyloestrem (CFSE).

Protokół

1. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) człowieka z warstwy buffy coat

1. Nabyć jedną jednostkę warstwy leukocytarnej (buffy coat) ze szpitala lub pobliskiego centrum krwiodawstwa. Nasze centrum krwiodawstwa dostarcza około 40-60 mL warstwy leukocytarnej na jednostkę pobraną od zdrowych dawców krwi.
2. Wlać krew do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 500 mL zawierającej sterylny PBS w celu rozcieńczenia warstwy leukocytarnej. Końcowa objętość PBS + warstwy leukocytarnej powinna wynosić 250 mL.
3. Napełnić dziesięć stożkowych probówek o pojemności 50 mL, wlewając do każdej 20 mL roztworu Lymphoprep.
4. Ostrożnie nanieść 25 mL rozcieńczonej warstwy leukocytarnej na powierzchnię roztworu Lymphoprep, dbając o to, aby nie zmieszać go z warstwą naddaną.
5. Wirować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy 500 x g. Należy upewnić się, że hamulec wirówki jest wyłączony, aby nie zakłócić frakcji limfocytów.
6. Zebrać PBMC za pomocą pipety z granicy rozdziału między warstwą Lymphoprep a warstwą osocza. Odessać osocze, pozostawiając około 1 mL nad warstwą leukocytarną zawierającą PBMC. Użyć pipety 10 mL, aby przenieść PBMC do nowej probówki 50 mL.
7. Przemyć komórki dwukrotnie PBS, a następnie resuspendować je w 50 mL zimnego RPMI w celu policzenia na hemocytometrze. Typowa wydajność wynosi 8 x 10⁸ - 1 x 10⁹ PBMC.

Procedurę tę można przeskalować dla mniejszych objętości krwi. Rozcieńczenie próbek krwi pełnej wynosi 1:1 w PBS.

2. Magnetyczna selekcja negatywna całkowitych limfocytów T CD4⁺, naiwnych limfocytów T CD4⁺ CD45RA⁺ lub limfocytów T pamięci CD4⁺ CD45RO⁺ z PBMC przy użyciu zestawów do wzbogacania EasySep (Stem Cell Technologies)

Kroki należy wykonać dla 1 x 10⁸ do 4,25 x 10⁸ PBMC.

1. Resuspenduj PBMC do końcowego stężenia 5 x 10⁷ na mL w PBS zawierającym 2% FBS i 1mM EDTA. Przenieś komórki do nowej polipropylenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 mL.
   1. Izolacja całkowitej populacji ludzkich limfocytów T CD4⁺ metodą selekcji negatywnej: dodaj koktajl przeciwciał do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4⁺ (50 μL na mL PBMC), wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Izolacja ludzkich naiwnych limfocytów T metodą selekcji negatywnej: dodaj 50 μL przeciwciała anty-CD45RO na mL zawiesiny komórek PBMC, wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj koktajl wzbogacający dołączony do zestawu (50 μL na mL PBMC), wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   3. Izolacja ludzkich limfocytów T pamięci metodą selekcji negatywnej: dodaj koktajl przeciwciał do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4⁺ pamięci (50 μL na mL PBMC), wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Dokładnie wymieszaj cząsteczki magnetyczne, aby równomiernie rozprowadzić je w roztworze. Nie mieszaj nanocząsteczek z zestawu do izolacji limfocytów naiwnych na wirówce typu vortex.
3. Dodaj cząsteczki magnetyczne (100 μL na mL PBMC dla selekcji całkowitej populacji CD4⁺ i naiwnych limfocytów T, 50 μL na mL PBMC dla selekcji limfocytów T pamięci). Wymieszaj, delikatnie pipetując 2-3 razy, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut w przypadku selekcji naiwnych limfocytów T lub przez 5 minut dla selekcji limfocytów pamięci lub całkowitej populacji T CD4⁺.
4. Dodaj PBS zawierający 2% FBS i 1 mM EDTA, aby zwiększyć objętość do 10 mL na probówkę. Wymieszaj, delikatnie pipetując 2-3 razy, a następnie umieść niezatykaną probówkę w srebrnym magnesie EasySep na 5, 10 lub 2,5 minuty odpowiednio dla całkowitych limfocytów T CD4⁺, naiwnych oraz limfocytów pamięci.
5. Trzymając probówkę w magnesie EasySep, przelej ciecz do nowej probówki 50 mL, aby wyizolować pożądane komórki.
6. Powtórz kroki 2.5 i 2.6 w celu uzyskania lepszej wydajności odzysku.

3. Warunki hodowli komórkowej w celu indukcji limfocytów T regulatorowych

1. Dzień przed wykonaniem kroków 1 i 2, pokryj płytki do hodowli tkanek, rozcieńczając najpierw przeciwciało anty-CD3 (klon OKT3) do stężenia 1 μg/mL w sterylnym PBS. W przypadku płytki 6-dołkowej dodaj 2 mL PBS + anty-CD3 na dołek, dla płytki 12-dołkowej dodaj 1 mL, a dla płytki 24-dołkowej dodaj 500 μL na dołek. Przechowuj pokrytą płytkę w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Przygotuj pożywkę do polaryzacji, dodając 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny oraz 50 μM β-merkaptoetanolu do pożywki RPMI-1640 uprzednio uzupełnionej o 2,06 mM Glutamax-I i 25 mM bufor HEPES. Następnie dodaj 2 ng/mL TGF-β oraz 5 ng/mL IL-2. Na tym etapie do pożywki można dodać interesujące badacza ligandy lub inhibitory. Resuspenduj komórki z kroku 2 do stężenia 2 x 10⁶ komórek/mL w pożywce do polaryzacji.
3. Podgrzej płytki do temperatury 37 °C i odessaj PBS z dołków pokrytych anty-CD3 przed dodaniem komórek. Dodaj 4 mL zawiesiny komórkowej na dołek dla płytki 6-dołkowej, 2 mL komórek dla płytki 12-dołkowej lub 1 mL komórek dla płytki 24-dołkowej. Puste dołki wypełnij PBS, aby ograniczyć odparowywanie pożywki. Inkubuj przez 3 dni w temperaturze 37 °C / 5% CO₂.
4. W 3. dniu po wysianiu, odwiruj płytkę w wirówce przez 5 minut przy 500 x g. Nie naruszając osiadłych na dnie płytki limfocytów T, usuń połowę pożywki i zastąp ją świeżą pożywką. Alternatywnie, jeśli w dołku pojawi się zbyt duże zagęszczenie komórek (stężenie powyżej 3 x 10⁶/mL), podziel objętość po równo do drugiej płytki pokrytej anty-CD3 i uzupełnij świeżą pożywką do objętości pierwotnej. Inkubuj przez kolejne dwa do trzech dni w temperaturze 37 °C / 5% CO₂.

4. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) trzech populacji limfocytów T

1. Przygotować bufor płuczący do FACS, dodając 0,5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 2 mM EDTA do sterylnego PBS. Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C w celu schłodzenia.
2. Usunąć komórki z dołków hodowli komórkowej i przepłukać każdy dołek 2 mL PBS, aby zapewnić całkowity odzysk komórek. Przenieść wszystkie komórki do 50 mL polipropylenowych probówek i wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru w celu określenia gęstości komórek.
4. Do czterech oddzielnych 5 mL polistyrenowych probówek z dnem okrągłym, przeznaczonych do kontroli kompensacji, przenieść od 3-5 x 10⁵ komórek na probówkę. Pozostałe komórki przenieść do 50 mL polipropylenowych probówek, nie przekraczając liczby 35 x 10⁶ komórek na probówkę.
5. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać medium. Komórki przeznaczone do sortowania resuspendować w 90 μL zimnego buforu płuczącego na każde 1 x 10⁶ komórek. Probówki do kontroli kompensacji resuspendować w 100 μL zimnego buforu płuczącego.
6. Do komórek przeznaczonych do sortowania dodać 2 μL przeciwciał anti-CD25-PE, 3 μL anti-CD45RA-PE-Cy5 oraz 1 μL anti-CD127-APC na każde 1 x 10⁶ komórek. Do pierwszej probówki kontroli kompensacji nie dodawać przeciwciał, do drugiej dodać 2 μL anti-CD25-PE, do trzeciej 3 μL anti-CD45RA^-PE-Cy5, a do czwartej 1 μL anti-CD127-APC. Inkubować wszystkie probówki na lodzie przez 45 minut w ciemności.
7. Dodać 10 mL zimnego buforu płuczącego do komórek przeznaczonych do sortowania oraz 1 mL do probówek kontroli kompensacji. Wirować wszystkie komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
8. Odessać bufor i resuspendować komórki do stężenia 1 x 10⁷ komórek na mL buforu płuczącego. Przed filtrowaniem przez 40 μM nylonowy sitko do komórek dodać 1,5 μL DNase II na mL komórek. Przenieść komórki do kilku 5 mL polipropylenowych probówek z dnem okrągłym, nie przekraczając objętości 3,5 mL na probówkę. Komórki do kontroli kompensacji resuspendować w 300 μL buforu płuczącego.
9. Ustawić kompensację w cytometrze przepływowym MoFlo, aby zminimalizować detekcję krzyżową przez filtry PE, APC i PE-Cy5. Ustawić bramki w celu sortowania iTregs (komórki CD25^HiCD127^-/LOWCD45RA^-), naiwnych limfocytów T (CD25-CD45RA⁺) oraz limfocytów T pamięci (CD25^-CD45RA^-) do 5 mL polistyrenowych probówek z dnem okrągłym zawierających 1 mL surowicy cielęcej noworodka.

5. Test supresji

1. Przygotować pożywkę do testu supresji, dodając do AIM-V 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 5 ng/mL IL-2 oraz 2 ng/mL TGF-β.
2. W dniu przeprowadzenia testu oczyścić heterologiczne limfocyty T CD4⁺ z warstwy leukocytarnej (buffy coat), zgodnie z instrukcjami w krokach 1 i 2. Będą one stanowić komórki docelowe w teście supresji i nie zawierają komórek Treg CD25⁺, co przedstawiono na Rysunku 2, dzień 0.
3. Znakować komórki za pomocą zestawu CellTrace zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem zastosowania jedynie 1 μL roztworu stokowego 5 mM na 1 mL komórek zamiast 2 μL. Chroniąc przed bezpośrednim światłem, dodać 18 μL DMSO dostarczonego w zestawie CellTrace do jednej fiolki CFSE, aby przygotować roztwór stokowy 5 mM. Resuspendować wymaganą liczbę komórek docelowych (maksymalnie 1 x 10⁷) w podgrzanym PBS + 0,1% (w/v) BSA do stężenia końcowego 1 x 10⁶ komórek/mL. Dodać 1 μL 5 mM CFSE na 1 mL komórek i inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 5 objętości kompletnego, lodowatego RPMI z 10% FBS, aby przerwać barwienie, i inkubować na lodzie przez 5 minut. Przemyć komórki dwukrotnie zimnym kompletnym RPMI i resuspendować 1 x 10⁵ komórek w 100 μL pożywki do testu supresji.
4. Kuleczki kontrolne supresji Treg (Treg suppression inspector beads) znajdują się w stężeniu stokowym 2 x 10⁷ kuleczek/mL. Odwirować liczbę kuleczek równą całkowitej liczbie komórek na eksperyment poprzez szybkie wirowanie w probówce typu Eppendorf. Przemyć kuleczki raz w RPMI i ponownie odwirować. Po odessaniu RPMI resuspendować kuleczki w taki sposób, aby odpowiednia liczba kuleczek na dołek znajdowała się w 8 μL pożywki do testu supresji.
5. Do 96-dołkowej płytki hodowlanej z okrągłym dnem dodać komórki znakowane CFSE (1 x 10⁵ komórek/mL), kuleczki kontrolne oraz spolaryzowane i posortowane komórki (1 x 10⁵ komórek/mL) w świeżej pożywce do testu supresji, zachowując pożądany stosunek komórek docelowych (znakowanych CFSE) do efektorowych (posortowanych) w końcowej objętości 200 μL. Wszystkie warunki należy ustawić w trzech powtórzeniach.
6. Przygotować pierwszy z dwóch wariantów kontrolnych, dodając do każdego dołka 100 μL komórek znakowanych CFSE, 8 μL kuleczek kontrolnych oraz 1 x 10⁵ świeżych, nieznakowanych komórek w 92 μL pożywki do testu supresji. Drugą kontrolę przygotować z tymi samymi komponentami komórkowymi, ale bez kuleczek kontrolnych Treg.
7. Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C / 5% CO₂ przez pięć dni.
8. W ciemności zebrać komórki z każdego dołka za pomocą pipety i umieścić w 5 mL polistyrenowej probówce z okrągłym dnem. Wirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać pożywkę i resuspendować w 300 μL zimnego buforu do mycia FACS z kroku 4. Przeanalizować pierwsze 3 x 10⁴ zdarzeń CFSE⁺ z bramki żywych limfocytów reprezentujących komórki docelowe na histogramie za pomocą oprogramowania Cell Quest.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład pseudokolorowych wykresów kropkowych z cytometrii przepływowej w pięciodniowym przebiegu czasowym, monitorujących różnicowanie iTreg na podstawie względnej koekspresji CD25 z FoxP3, CTLA-4 i CD45RA, przedstawiono na Rysunku 2. Histogram na Rysunku 3 obrazuje pomyślny test supresji, w którym posortowane iTreg (komórki CD25^HiCD45RA^- CD127^-/LOW) są jedyną subpopulacją z pięciodniowej hodowli, która nabyła zdolności regulacyjnych/supresyjnych. Rysunek 4 przedstawia indukcję Tregs z puli naiwnych limfocytów T (panele górne) oraz puli pamięciowych limfocytów T (panele dolne) po pięciodniowej hodowli w standardowym medium do iTreg. Barwienie początkowych komórek CFSE wykazuje, że zarówno naiwne (panel prawy górny), jak i pamięciowe limfocyty T (panel prawy dolny) różnicują się w iTreg (komórki o najwyższej ekspresji FoxP3) dopiero po kilku rundach podziałów komórkowych.

Rycina 1. Schemat procedury eksperymentalnej. PBMC są izolowane z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą centryfugacji gradientowej przed magnetyczną selekcją negatywną limfocytów T CD4⁺CD25^-. Po pięciu do sześciu dniach hodowli komórki są poddawane analizie FACS i inkubowane wspólnie z heterologicznymi komórkami docelowymi znakowanymi CFSE w celu pomiaru aktywności supresyjnej.

Rycina 2. Oczyszczone ludzkie pierwotne limfocyty T CD4⁺CD25^- są hodowane w pożywce do iTreg. Alikwoty komórek pobiera się bezpośrednio po izolacji (dzień 0) oraz w dniach 1, 3 i 5 hodowli komórkowej w celu monitorowania progresji markerów CD45RA, FoxP3, CTLA-4 i CD25. Profil iTreg odpowiada fenotypowi CD45RA^-, FoxP3^Hi, CTLA-4^Hi i CD25^Hi (wyróżniono w oknie na wykresie).

Rycina 3. Oczyszczone komórki CD4⁺ oznakowane CFSE (1 x 10⁵/dołek) hodowane są z Treg suppression inspector beads w obecności posortowanych naiwnych komórek T, komórek pamięci lub iTregs (3 x 10⁴/dołek). Po pięciu dniach komórki są zbierane, a profil CFSE barwionych komórek analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. Obecność komórek iTreg całkowicie znosi proliferację limfocytów T CD4⁺. Liczby wskazują procent komórek oznakowanych CFSE, które uległy podziałowi.

Rycina 4. Oczyszczone ludzkie pierwotne naiwne (CD4⁺CD25^-CD45RA⁺) i pamięciowe (CD4⁺CD25^-CD45RO⁺) limfocyty T są barwione CFSE i hodowane w medium do iTreg. Po pięciu dniach przeprowadzono fenotypowanie komórek i oszacowano tempo podziałów komórkowych. Jak wskazano na Rycynie 2, podzbiór iTreg zróżnicowany z obu populacji odpowiada fenotypowi CD45RA^-CD25^Hi FoxP3^Hi oraz CTLA-4^Hi (dwóch ostatnich nie pokazano). Porównawcze profile barwienia CFSE identyfikują iTregi (tutaj jako limfocyty T o najwyższej ekspresji FoxP3) jako komórki o największej zdolności do proliferacji podczas pięciodniowej hodowli.

Dyskusja

Choć transfer komórek Treg daje ogromne nadzieje terapeutyczne w walce z autoimmunizacją, odrzucaniem przeszczepów oraz innymi zaburzeniami o podłożu immunologicznym lub zapalnym, nie opracowano jeszcze metod ich efektywnego generowania i stabilnego utrzymania. Ponieważ tylko 1-5% krążących ludzkich limfocytów T to komórki Treg, ich kontrolowana ekspansja i różnicowanie pozwalają przezwyciężyć ten niedobór, który stanowi główną przeszkodę we wdrażaniu komórek Treg do praktyki klinicznej. Z drugiej strony, jak wyciągnięto...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lymphoprep	Axis-Shield	1114547	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Stołowa wirówka chłodząca	Eppendorf	5810R
Hemocytometr Bright-Line	Hausser Scientific	3110
EasySep Human CD4+ Zestaw do wzbogacania limfocytów T	Technologie komórek macierzystych	19052
EasySep Human Memory CD4+ Zestaw do wzbogacania limfocytów T	Technologie komórek macierzystych	19157
EasySep Human Naïve CD4+ Zestaw do wzbogacania limfocytów T	Technologie komórek macierzystych	19155
Magnes Big Easy EasySep	Technologie komórek macierzystych	18001	Srebro
Probówki polistyrenowe o okrągłym dnie o pojemności 5 ml	BD Biosciences	352008
Probówki wirówkowe z polipropylenu 15 ml	VWR international	89004-368
Probówki polipropylenowe o okrągłym dnie 14 ml	BD Biosciences	352059
Probówki wirówki z polipropylenu 50 ml	VWR international	89004-364
Ludzki przeciwciało anty-CD3	Bio X Cell	BE0001-2	Klon: OKT3
24-dołkowa polistyrenowa płytka do hodowli komórek	BD Biosciences	353047
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej z okrągłym dnem	Greiner Bio-One	650180
pożywka RPMI 1640 z Glutamax-I i buforem HEPES	GIBCO, by Life Technologies	72400
płodowa surowica bydlęca (FBS)	GIBCO, by Life Technologies	16000
β-merkapt-–etanol	Sigma-Aldrich	M7522
Rekombinowany ludzki TGF-β1	eBioscience	14-8348-62
Rekombinowana ludzka IL-2	eBioscience	14-8029-63
Seryjna albumina bydlęca (BSA)	MP Biomedicals	810531
0,5 M EDTA	Amresco	E177
przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD25-PE	Miltenyi Biotec	130-091-024	Klon: 4E3
przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD45RA-PE-Cy5	eBioscience	15-0458-42	Klon: HI100
Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD127-APC	Miltenyi Biotec	130-094-890	Klon: MB15-18C9
DNaza II	MP Biomedicals	190370
Cytometr przepływowy MoFlo	Beckman Coulter Inc.
Oprogramowanie FlowJo	Tree Star, Inc.
Oprogramowanie Cell Quest Pro	BD Biosciences
Surowica z noworodka cielęcia	GIBCO, by Life Technologies	16010
L-glutamina	GIBCO, by Life Technologies	25030
AIM-V	GIBCO, by Life Technologies	0870112
Zestaw do badania proliferacji komórek CellTrace CFSE	Invitrogen	C34554
Kuleczki do badania supresji komórek Treg	Miltenyi Biotec	130-092-909
penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140
40 μSito nylonowe średniej wielkości do odcedzania komórek	BD Biosciences	352340