Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Podsumowanie

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Streszczenie

Białka błonowe, takie jak receptory i kanały jonowe, podlegają aktywnemu transportowi w neuronach, które są silnie spolaryzowane i złożone morfologicznie. Ten ukierunkowany transport ma fundamentalne znaczenie dla dostarczania, utrzymywania lub usuwania białek synaptycznych.

Super-ecliptic pHluorin (SEP) jest wrażliwą na pH pochodną eGFP, która była szeroko stosowana w obrazowaniu białek błony plazmatycznej w żywych komórkach^1-2. Przy niskim pH protonowanie SEP zmniejsza absorpcję fotonów i eliminuje emisję fluorescencji. Ponieważ większość zdarzeń transportu wewnątrzkomórkowego zachodzi w przedziałach o niskim pH, w których fluorescencja SEP jest wygaszona, sygnał fluorescencyjny z białek znakowanych SEP pochodzi głównie z błony plazmatycznej, gdzie SEP jest wystawiony na środowisko pozakomórkowe o neutralnym pH. Podczas naświetlania o wysokiej intensywności SEP, podobnie jak każdy barwnik fluorescencyjny, ulega nieodwracalnemu uszkodzeniu fotochemicznemu (fotobleachingowi)^3-5. Co istotne, ponieważ niskie pH wygasza absorpcję fotonów, tylko SEP eksponowany na powierzchni może ulec fotobleachingowi, podczas gdy SEP wewnątrzkomórkowy nie jest wpływany przez naświetlanie o wysokiej intensywności^6-10.

FRAP (fluorescence recovery after photobleaching – powrót fluorescencji po fotowybielaniu) białek oznakowanych SEP jest wygodną i potężną techniką oceny dynamiki białek w błonie plazmatycznej. Gdy białka znakowane fluorescencyjnie zostaną poddane fotowybielaniu w obszarze zainteresowania (ROI), powrót fluorescencji następuje w wyniku przemieszczania się niewybielonych białek oznakowanych SEP do wybielonego obszaru. Może to zachodzić poprzez dyfuzję boczną i/lub egzocytozę niepoddanych fotowybielaniu receptorów dostarczanych w wyniku syntezy de novo lub recyklingu (patrz Rys. 1). Można określić frakcję białek nieruchomych i ruchomych, a także zbadać mobilność i kinetykę frakcji dyfuzyjnej w warunkach podstawowych oraz stymulowanych, takich jak aplikacja agonisty lub bodźce aktywacji neuronalnej, np. aplikacja NMDA lub KCl^8,10.

Opisujemy techniki fotowybielania zaprojektowane do selektywnej wizualizacji powrotu fluorescencji przypisywanego egzocytozie. W skrócie, obszar ROI jest fotowybielany raz, analogicznie do standardowych protokołów FRAP, a następnie, po krótkim czasie regeneracji, następuje powtarzalne wybielanie obszarów przyległych. Ten protokół „FRAP-FLIP”, opracowany w naszym laboratorium, był wykorzystywany do charakterystyki transportu receptorów AMPA w kolcach dendrytycznych¹⁰ i może być stosowany w szerokim zakresie badań transportu w celu oceny transportu wewnątrzkomórkowego oraz egzocytozy.

Protokół

1. Hodowla komórkowa, transdukcja wirusowa i ekspresja białek

1. Hodować neurony hipokampa o wysokiej gęstości z embrionów szczura z 18. dnia rozwoju (E18) na szkiełkach podstawkowych pokrytych poli-L-lizyną przez 14-25 dni in vitro (DIV).
2. Od 6 do 24 godzin przed eksperymentami na żywo transdukować komórki atenuowanym wirusem Sindbis zawierającym interesujące białko błonowe, oznakowane super-ecliptic pHluorin (SEP).
3. Dodać medium zawierające pseudowiriony bezpośrednio na szkiełko podstawkowe zawierające 1mL medium warunkującego i przenieść do inkubatora hodowlanego. Miano oraz czas ekspresji białka po transdukcji wirusowej będą się różnić w zależności od partii wirusa i powinny zostać określone dla każdej partii przed rozpoczęciem eksperymentów na żywych komórkach.

2. Obrazowanie żywych komórek metodą FRAP-FLIP

1. Przygotowanie sprzętu
   1. Przenieś szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania konfokalnego mikroskopu Zeiss Axiovert LSM 510 META. Aby zminimalizować wahania mocy podczas obrazowania, upewnij się, że mikroskop był włączony przy 100% mocy lasera przez co najmniej 20 min przed rozpoczęciem pomiarów.
   2. Natychmiast zastąp pożywkę hodowlaną podgrzanym wcześniej (37 °C) roztworem do rejestracji zewnątrzkomórkowej zawierającym 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukozy, 1,5 mM CaCl₂, 1,5 mM MgCl₂, 20-25 mM HEPES (pH skorygowane do 7,4 za pomocą NaOH) i umieść komorę na podgrzanym stole (37 °C) mikroskopu Zeiss Axiovert.
      
      Upewnij się, że osmolarność roztworu do rejestracji zewnątrzkomórkowej jest dostosowana do wartości w granicach 10 mOsM od Twojej pożywki hodowlanej. Przy założeniu, że w czasie trwania eksperymentu nie wystąpi znaczące parowanie, ten roztwór niezależny od CO₂ jest odpowiedni do krótkich eksperymentów (<10 h). Zaleca się uzupełnienie go o 1-2 mM wodorowęglanu sodu.
2. Określenie parametrów akwizycji obrazu
   1. W pierwszej kolejności zidentyfikuj neuron wykazujący ekspresję interesującego białka rekombinowanego i ustaw ostrość.
   2. Przy użyciu obiektywu olejowego 63X wykonaj obraz całej komórki, stosując wzbudzenie światłem lasera 488 nm przy niskiej mocy lasera. Aby zminimalizować fotobleaching, zastosuj szybką prędkość nominalną (7-9) i niską rozdzielczość pikseli (512-512), utrzymując całkowity czas skanowania <1 s.
   3. Wybierz fragment dendrytu do obrazowania i powiększ go, aby uchwycić klatkę zawierającą ROI (~1,5-2,5 x zoom optyczny). Jeśli to możliwe, upewnij się, że pole widzenia zawiera kilka wypustek, tak aby można było uzyskać pomiary z dendrytów referencyjnych w celu ustalenia, czy występuje nieswoisty fotobleaching wynikający z akwizycji.
   4. Dostosuj filtry, pinhole, prędkość skanowania i wzmocnienie detektora, aby uzyskać maksymalną fluorescencję przy minimalnym wzbudzeniu laserowym, ale z ograniczoną saturacją. Zaleca się dużą średnicę pinhole, aby zmaksymalizować zbieranie fotonów (2 μm jest odpowiednie dla kolców i dendrytów trzeciorzędowych). Wzmocnienie detektora powinno być wystarczająco silne, aby wykrywać niewielkie przyrosty fluorescencji, tak aby pierwsze obrazy, przed fotobleachingiem, nie przekraczały 10% nasyconych pikseli.
   5. Zapisz tę konfigurację, aby była używana w fazach przed/po fotobleachingu oraz w fazie regeneracji w trakcie eksperymentu.
   6. Następnie zdefiniuj obszary fotobleachingu; wybierz ROI dla początkowego fotobleachingu oraz obszary flankujące dla późniejszej fazy powtarzalnego fotobleachingu. Upewnij się, że obszary flankujące są wystarczająco szerokie, aby zapobiec regeneracji poprzez dyfuzję między skanami (zazwyczaj 5 μm, patrz Rys. 2).
   7. Dostosuj parametry bleachingu dla obu ROI fotobleachingu. Początkowy fotobleaching powinien być szybki (0,1-0,5 s) i wymagać od 1 do 5 iteracji, w zależności od zoomu optycznego i objętości ROI. Dla obszarów flankujących wzbudzenie laserowe należy dostosować tak, aby zapewnić ciągły fotobleaching tych obszarów, ale bez uszkodzeń fototoksycznych.
   8. Jako wytyczną stosujemy 100% wzbudzenia laserowego dla początkowego fotobleachingu i 10% dla fazy powtarzalnego fotobleachingu.
3. Akwizycja obrazu
   1. Po ustawieniu wszystkich parametrów przeprowadź eksperyment FRAP-FLIP jako sekwencję obrazów time-lapse o zmiennym czasie, zgodnie z poniższymi 4 blokami:
      
      BLOK 1: 3-10 obrazów bazowych przed bleachingu, przy niskiej mocy lasera, bez opóźnienia czasowego
      BLOK 2: Fotobleaching centralnego ROI przy pełnej mocy lasera, 1-5 iteracji
      BLOK 3: 3-10 obrazów regeneracji po bleachingu
      BLOK 4: Powtarzalny fotobleaching obszarów flankujących przy średniej mocy lasera z przechwytywaniem obrazu w typowym odstępie czasu od 1 do 5 s, w zależności od szybkości regeneracji badanego białka.
   2. Na koniec zastąp roztwór do rejestracji zewnątrzkomórkowej roztworem buforowanym do pH 6 zawierającym 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukozy, 1,5 mM CaCl₂, 1,5 mM MgCl₂, 20-25 mM MES (aby wygasić fluorescencję) lub uzupełnionym o 50 mM NH4Cl zawierającym 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukozy, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (aby ujawnić białka w wewnątrzkomórkowych magazynach o niskim pH), (patrz Rys. 2).
   3. Zbierz co najmniej 10 do 20 zestawów danych dla każdego białka rekombinowanego, aby umożliwić analizę statystyczną. Aby uniknąć błędnych wyników, upewnij się, że warunki obrazowania są spójne we wszystkich powtórzeniach. Odrzuć wszelkie zestawy danych, w których zaobserwowano niepełny bleaching, znaczny dryft płaszczyzny ogniskowej lub fototoksyczne uszkodzenie komórek.

3. Analiza danych

1. Otwórz obrazy w programie ImageJ.
2. Wyrównaj stosy obrazów, aby uwzględnić niewielkie fluktuacje w płaszczyźnie xy, które mogły wystąpić w trakcie serii czasowej, korzystając z wtyczki Stackreg (plugins → stackreg → transformation: rigid body → ).
3. W przypadku obrazów wykonanych konfokalnym mikroskopem Zeiss, użyj wtyczki LSM Toolbox, aby wyeksportować wartości czasu do pliku tekstowego (plugins → LSM Toolbox → Show LSM Toolbox → → ), a następnie zaimportuj te wartości do arkusza analizy.
4. Aby zmierzyć fluktuacje fluorescencji podczas eksperymentu FRAP-FLIP, podziel segment poddanego fotowybielaniu na poszczególne regiony pikseli (~20 pikseli) i zmierz średnią fluorescencję tych ROI w każdym punkcie czasowym (F). Aby szybko uzyskać te wartości, zaznacz wiele ROI za pomocą narzędzia analitycznego „ROI Manager” w programie ImageJ (Analyze → Tools → ROI Manager) i odczytaj średnią fluorescencję na piksel, korzystając z polecenia „Plot Z-axis profile” (Image → Stacks → Plot Z-axis profile).
5. Powtórz ten krok, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w tle, w regionie niefluorescencyjnym.
6. Znormalizuj intensywność fluorescencji w każdym punkcie czasowym, odejmując wartości tła w celu usunięcia szumu eksperymentalnego, a następnie podziel wszystkie wartości przez średnią pomiarową linii bazowej przed fotowybielaniem.
7. Zmierz intensywność fluorescencji w sąsiednich dendrytach niepoddanych fotowybielaniu, aby ocenić poziom nieswoistego fotowybielania podczas akwizycji. Korekta o nieswoiste fotowybielanie jest niewskazana przy interpretacji danych „FRAP-FLIP” i należy jej unikać, jeśli to możliwe.
8. Aby obliczyć, czy w danym ROI nastąpiła istotna regeneracja, odejmij średnią z ostatnich 5-10 pomiarów sekwencji od średniej z pierwszych 5-10 pomiarów (ΔF) i określ istotność statystyczną. Skategoryzuj ROI regenerujące się i nieregenerujące się, aby ocenić wzorzec egzocytozy (np. miejsca intensywnej egzocytozy – hotspots lub regeneracja kolca względem trzonu).

4. Reprezentatywne wyniki

Wynik typowego eksperymentu FRAP-FLIP przedstawiono na Ryc. 2. W tym przypadku neuron wykazujący ekspresję podjednostki GluA2 receptora glutaminianowego typu AMPA, znakowanej SEP, został selektywnie wybielony fotochemicznie wzdłuż odcinka dendrytu. Ryc. 2.A ilustruje obrazowany obszar dendrytu i wskazuje ROI wybrane do fotowybielania (obszary w białych ramkach). Duży obszar w białej ramce został wybielony raz, po czym nastąpiło powtarzalne wybielanie sąsiadujących obszarów w ramkach, zaznaczonych niebieskimi strzałkami dwustronnymi. Czerwona strzałka wskazuje mierzone ROI, przedstawione w dużym powiększeniu na dolnych panelach.

Rys. 2.B przedstawia intensywność fluorescencji w zmierzonym ROI w czasie trwania eksperymentu. W tym przykładzie, po początkowym fotowybieleniu, zarejestrowano minutowy okres regeneracji, aby umożliwić niewybielonym receptorom przedostanie się do ROI poprzez dyfuzję boczną. Gdy regiony flankujące zostaną poddane fotowybieleniu, sygnał fluorescencji z tej wysoce ruchliwej frakcji receptorów zostaje odcięty od regionu centralnego, a receptory znajdujące się wewnątrz tego regionu ulegają rozcieńczeniu. Przyrost fluorescencji (ΔF) obserwowany podczas sekwencji „FLIP” można zatem przypisać insercji SEP-GluA2 w trzonie dendrytycznym. Płukanie niskim pH oraz dodanie pH 7.4 + NH4Cl potwierdzają odpowiednio, że mierzona fluorescencja pochodzi z białek powierzchniowych, i ujawniają proporcję wewnątrzkomórkowych, sekwestrowanych białek w zmierzonym ROI.

W przeciwieństwie do metody FRAP, niniejsza metodologia izoluje powrót fluorescencji wynikający z egzocytozy, co prowadzi do znacznego obniżenia poziomu regeneracji fluorescencji w regionie poddanym fotobleachingowi. Do tej pory nie opracowano wiarygodnego modelu matematycznego do dopasowania i analizy krzywych regeneracji zarejestrowanych przy użyciu tej techniki selektywnego wybielania. Możliwe jest jednak dopasowanie krzywej regeneracji za pomocą funkcji monoeksponencjalnej:

F_(t)=A_s - A₀e^(-t/τ)

Gdzie F_(t) to fluorescencja w czasie t, A_s to wartość stanu stacjonarnego, A₀ to przesunięcie w czasie 0, a τ to stała czasowa. Wzrost regeneracji jest ustalony z określoną szybkością w celu osiągnięcia równowagi, odpowiadającej stanowi stacjonarnemu między insercją a dyfuzją. Co ważne, stała czasowa wyznaczona z tej analizy nie odzwierciedla stałej czasowej egzocytozy i może być stosowana wyłącznie do porównawczych analiz dla pojedynczego białka.

Ponadto oczekiwany wzór powrotu fluorescencji prawdopodobnie zostanie zaobserwowany w subdomenach wzdłuż obszaru poddanego fotoblaknięciu. Analiza małych ROI w obrębie segmentu poddanego fotoblaknięciu może być niezbędna do ujawnienia „gorących punktów” (hotspots) egzocytozy; zaleca się analizowanie obszarów o porównywalnej długości, ponieważ zmienność gęstości tych punktów w obrębie dendrytu wpłynie na obliczoną szybkość.

Rys. 3 przedstawia rozszerzenie tego protokołu, w którym fotowyblaknięcie zastosowano do dużego ROI przekroju z wieloma dendrytami w polu widzenia, a następnie przeprowadzono selektywne, powtarzalne wyblaknięcie tylko jednego dendrytu. Podejście to umożliwia równoległe pozyskiwanie tradycyjnych danych „FRAP” i „FRAP-FLIP”. W tym przykładzie neurony hipokampa zostały zainfekowane podjednostką receptora glutaminianu z klasy kainianowej: SEP-tagged GluK2. Przed obrazowaniem neurony te poddano działaniu cykloheksymidu (2 h przy 200μg/ml), aby zablokować syntezę białek. W związku z tym odzyskiwanie fluorescencji w odpowiednich mierzonych ROI (Rys. 3.B) ujawnia proporcję odzyskiwania wynikającą z dyfuzji bocznej i recyklingu w standardowym dendrycie FRAP w porównaniu z samym recyklingiem w dendrycie poddanym protokołowi „FRAP-FLIP”. Porównując wartości ΔF z krzywych odzyskiwania FRAP i „FRAP-FLIP”, można wywnioskować względne wkłady recyklingu (ΔF_rec = 11,05%) w stosunku do dyfuzji bocznej (ΔF_diff = 9,35%). W przeciwieństwie do Rysunku 2, odzyskiwanie nie utrzymuje stałego poziomu, lecz ze względu na zahamowanie syntezy białek wykazuje przejściowy wzrost, a następnie spadek sygnału, co odpowiada wyczerpaniu dostępnej puli receptorów (obserwowany spadek o około 20% w okresie rejestracji).

Rysunek 1. Schemat zasad protokołów FRAP i FRAP-FLIP. Schemat ten ilustruje wyniki standardowego protokołu FRAP w porównaniu z protokołem „FRAP-FLIP” z wykorzystaniem receptorów znakowanych SEP. Odzyskiwanie fluorescencji w tradycyjnym FRAP pokazano po lewej stronie. Zmierzony powrót fluorescencji w centralnym ROI przypisuje się kombinacji dyfuzji bocznej niewybielonych receptorów znakowanych SEP spoza wybielonego ROI oraz wbudowywania receptorów poprzez recykling i/lub egzocytozę de novo do trzonu dendrytu. W przeciwieństwie do tego, powtarzalne wybielanie flankujących ROI przedstawione po prawej stronie pokazuje, jak ten zmodyfikowany protokół „FRAP-FLIP” wycisza odzyskiwanie fluorescencji wynikające z dyfuzji bocznej. W związku z tym każdy zmierzony powrót fluorescencji można przypisać bezpośredniemu wbudowywaniu w ROI.

Rycina 2. Wbudowywanie SEP-GluA2 w błonę plazmatyczną w obrębie trzonu dendrytu

A) Neuron hipokampa wykazujący ekspresję SEP-GluA2, selektywnie wybielony fotochemicznie wzdłuż odcinka dendrytu. Schemat ilustruje obrazowany odcinek dendrytu, natomiast panel w lewym górnym rogu wyróżnia obszary ROI wybrane do wybielania. Duży obszar zaznaczony białą ramką został wybielony raz, po czym nastąpiło powtarzalne wybielanie sąsiadujących obszarów w ramkach, zaznaczonych niebieskimi strzałkami dwukierunkowymi. Ten panel przedstawia dendryt przed wybielaniem fotochemicznym. Czerwona strzałka wskazuje pomiarowy obszar ROI, pokazany w dużym powiększeniu w dolnych panelach. B) przedstawia intensywność fluorescencji w pomiarowym ROI w czasie trwania eksperymentu, wykreśloną jako poziom szarości w ROI (brak normalizacji). Czarna strzałka wyróżnia punkt czasowy początkowego wybielania fotochemicznego, a zielona strzałka wskazuje początek powtarzalnego wybielania. ΔF oznacza wzrost fluorescencji zaobserwowany w okresie regeneracji, wynikający z wbudowania SEP-GluA2 w trzon dendrytu. Następujące po tym przemycia w niskim pH oraz w pH 7,4 + NH₄Cl potwierdzają, że odzyskana fluorescencja odnosi się do receptorów eksponowanych na powierzchni.

Rycina 3. Recykling i dyfuzja boczna w porównaniu z recyklingiem SEP-GluK2 na trzpieniu dendrytu po zastosowaniu cykloheksymidu

A) Neuron hipokampa wykazujący ekspresję SEP-GluK2, poddany selektywnemu fotoblaknięciu z zastosowaniem równoległych protokołów regeneracji FRAP oraz „FRAP-FLIP”, przeprowadzonych w osobnych ROI dendrytów. Neuron ten został poddany wstępnej obróbce cykloheksymidą w celu zablokowania syntezy białek (2 h w stężeniu 200 μg/ml). Schemat przedstawia obrazowany fragment dendrytu, natomiast panel po lewej stronie wyróżnia ROI wybrane do fotoblaknięcia. Duży obszar w białej ramce został poddany jednorazowemu fotoblaknięciu, po czym nastąpiło powtarzalne fotoblaknięcie sąsiednich obszarów w ramkach, wyłącznie w dolnym dendrycie, zaznaczonych niebieskimi strzałkami dwukierunkowymi. Panel ten pokazuje dendryty przed fotoblaknięciem. Czerwone strzałki wskazują ROI przedstawione w dużym powiększeniu w części B), ilustrując regenerację fluorescencji w tradycyjnym protokole FRAP w porównaniu z protokołem „FRAP-FLIP”. Porównanie poziomów intensywności fluorescencji w późnej fazie regeneracji (trzecie panele) wykazuje wkład dyfuzji bocznej i recyklingu w zestawieniu z samym recyklingiem. Część C) przedstawia intensywność fluorescencji w pomierzonych ROI w czasie trwania eksperymentu, wykreśloną jako znormalizowane wartości intensywności. Czarna strzałka zaznacza moment początkowego fotoblaknięcia, a zielona strzałka wskazuje początek powtarzalnego fotoblaknięcia. ΔF_rec oznacza przejściową regenerację wynikającą z recyklingu receptorów, określoną dla dendrytu FRAP/FLIP, natomiast ΔF _diff mierzy wkład dyfuzji bocznej SEP-GluK2 do trzonu dendrytu w ROI „tylko FRAP”. Po przejściowym wzroście następuje stopniowy spadek sygnału, odpowiadający wyczerpywaniu się dostępnych receptorów w wyniku działania cykloheksymidy. Następujące po tym przemycia w niskim pH oraz w pH 7.4 + NH₄Cl potwierdzają, że odzyskana fluorescencja odnosi się do receptorów eksponowanych na powierzchni.

Dyskusja

Opisujemy innowacyjną strategię wizualizacji komponentów transportu białek błony plazmatycznej. Kombinatoryczne podejście łączące techniki fotoblaknięcia z białkami znakowanymi SEP umożliwia selektywną ocenę zdarzeń insercji do błony plazmatycznej. Dzięki ciągłemu fotoblaknięciu białek błonowych w obszarach flankujących podczas procesu regeneracji, metoda „FRAP-FLIP” pozwala ocenić wkład transportu pęcherzykowego w odzyskiwanie fluorescencji. To nowe podejście umożliwia bezpośrednią rejestrację insercji białek do błony, co pozwala na określenie zarówno liczby podkompartmentów, w których zaobserwowano regenerację, jak i amplitudy tej regeneracji (ΔF) w stanie stacjonarnym. Ponadto porównanie metody FRAP z i bez zastosowania FLIP pozwala obliczyć proporcję regeneracji przypisywalną dyfuzji bocznej.

Ponadto, w tym samym eksperymencie, podczas procesu regeneracji można jakościowo ocenić obszary dendrytu, które nie zostały poddane fotowybielaniu i sąsiadują z flankującymi je obszarami wybielonymi; utrata fluorescencji zaobserwowana w tych regionach będzie wynikać z dyfuzji bocznej fotowybielonych receptorów do tych niewybielonych segmentów dendrytu.

Ten protokół selektywnego fotoblakowania może być wykorzystany do badania różnych procesów transportu wewnątrzkomórkowego, takich jak charakterystyka egzocytozy w błonie plazmatycznej w określonych podobszarach (na przykład w dendrytach lub kolcach dendrytycznych) lub ocena wkładu dyfuzji bocznej w stosunku do insercji poprzez prowadzenie równoległych protokołów FRAP i „FRAP-FLIP” wzdłuż sąsiednich dendrytach (Rys. 3).

Należy wyraźnie zaznaczyć, że mimo przedstawienia konkretnych wytycznych, każde laboratorium będzie musiało zoptymalizować parametry obrazowania w zależności od konkretnych preparatów i sprzętu. Co istotne, wszystkie receptory powierzchniowe w ROI muszą zostać poddane fotoblakowaniu, niezależnie od płaszczyzny ogniskowej osi z, jednak bez powodowania istotnych uszkodzeń fototoksycznych lub niespecyficznego fotoblakowania. Użytkownicy powinni zachować ostrożność podczas stosowania tego protokołu w obrębie somy komórki, ponieważ wysoki odsetek wewnątrzkomórkowych przedziałów o stosunkowo niskim pH zazwyczaj skutkuje wysoką fluorescencją tła w tych obszarach. Ponadto, choć wykazaliśmy, w jaki sposób technika ta może być stosowana na różne sposoby, przed rozpoczęciem eksperymentów z selektywnym fotoblakowaniem nowego konstruktu z tagiem SEP, zalecamy przeprowadzenie wstępnej charakterystyki tagowanych receptorów, zgodnie z opisem Ashby i wsp.².

Podsumowując, metoda ta stanowi potężną i wszechstronną adaptację standardowego protokołu FRAP, umożliwiając ocenę zdarzeń wstawiania w błonie plazmatycznej w czasie zbliżonym do rzeczywistego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szklane szkiełka nakrywkowe 24mm	VWR international	631-0161
Poly-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P2636	1mg/ml w buforze boranowym do powlekania szkiełek
pożywka Neurobasal	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% w pożywce do wysiewu i hodowli neuronów
Penicylina Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781	1% w pożywce do wysiewu i hodowli neuronów
L-Glutamina	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM w pożywce do wysiewu/hodowli
surowica konia	Biosera	DH-291H	10% wyłącznie w pożywkach do wysiewu neuronów
wektor klonujący pSIN ReP5	Invitrogen	K75001	do produkcji wirusa Sindbis
system konfokalny LSM510 META	Carl Zeiss, Inc.
oprogramowanie Image J	National Institutes of Health		oprogramowanie open access. Wszystkie opisane tutaj wtyczki są dostępne pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/