Progresywny stosunek reagowania na smaczne pokarmy o wysokiej zawartości tłuszczu i cukru u myszy

*Najważniejsze kroki.

1. Sprzęt i oprogramowanie

1. Szkolenie i testowanie odbywa się w komorach obsługi myszy wyposażonych w dwie ultralekkie, wysuwane dźwignie¹ umieszczone po obu stronach pojemnika na żywność (patrz tabela 1). Nad każdą dźwignią znajduje się lampka bodźcowa, a w górnej części klatki znajduje się światło domowe. Dozownik pelletu znajduje się na zewnątrz komory. Każda komora umieszczona jest w kabinie wyciszającej z wentylatorem. Komory są podłączone do komputera PC z oprogramowaniem MedPC IV za pośrednictwem szafy interfejsu "Smart Control".

Uwaga: Gdy ultralekkie dźwignie nie są dostępne, zaleca się użycie szturchnięcia nosa jako odpowiedzi instrumentalnej w badaniach na myszach. Jednak przy obu dostępnych opcjach sugerujemy wybór ultralekkich dźwigni jako bardziej wiarygodnej miary motywacji, biorąc pod uwagę, że reakcje szturchania nosem mogą być wywołane przez eksploracyjne wąchanie.

2. Programy MedPC używane do uruchamiania zadań operantowych są napisane w kodzie notacji Medstate, którego użytkownik może się nauczyć za pomocą dostarczonej instrukcji programowania. Programowanie zapewnia użytkownikowi elastyczność w zakresie modyfikowania istniejących kodów lub generowania unikalnych parametrów eksperymentalnych. Niektóre kody można uzyskać bezpłatnie z Med Associates "Medstate Notation Repository" http://www.mednr.com. Dodatkowe kody można zakupić w Med Associates.

2. Aklimatyzacja myszy i ograniczenie jedzenia

1. Po przybyciu myszy są trzymane w grupach przez co najmniej 10 dni, aby zaaklimatyzować się do odwróconego 12-godzinnego cyklu światła/ciemności i mają zapewniony dostęp ad libitum do standardowej karmy i wody. W naszym przypadku używamy dorosłych myszy C57BL/6 zakupionych od Charles River (St. Constant, QC). Wszystkie manipulacje i eksperymenty behawioralne na myszach są wykonywane podczas ciemnego cyklu. Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami CRCHUM.
2. Myszy są następnie trzymane w osobnych pomieszczeniach, a ich pożywienie jest ograniczane (70% ich dziennego spożycia pokarmu), dopóki nie osiągną 90-95% masy ciała podczas swobodnego karmienia, aby ułatwić nabycie reakcji na naciśnięcie dźwigni. Myszy otrzymały swój dzienny limit pożywienia w klatce domowej po zakończeniu sesji. Po osiągnięciu 5-10% utraty wagi, dzienny przydział pokarmu jest dostosowywany tak, aby ustabilizować dolną masę ciała na pozostałą część okresu treningowego. Gdy myszy osiągną kryteria absorpcji (patrz poniżej), są ponownie umieszczane w harmonogramie karmienia ad libitum. Myszy odzyskują utraconą masę ciała w ciągu około 3-4 dni.
3. Myszy są obsługiwane w pomieszczeniu testowym przez 3 kolejne dni przed pierwszą sesją treningową. Dzień przed rozpoczęciem treningu 10-15 granulek o wysokiej zawartości tłuszczu i cukru (HFHS) umieszcza się w klatce domowej, aby zapobiec potencjalnemu wpływowi neofobii pokarmowej na wydajność operacyjną. Używamy 20 mg HFHS, bezpyłowych, precyzyjnych granulek spożywczych (dostępne również 14 mg) zawierających 48,9% Kcal w postaci tłuszczu (Bio Serv, Frenchtown, NJ).

3. Trening operacyjny

1. Myszy są początkowo szkolone do naciskania dźwigni zgodnie ze schematem wzmacniania o stałym stosunku (FR)-1, przy czym pojedyncze naciśnięcie dźwigni powoduje dostarczenie granulki żywności do pojemnika. Tylko jedna dźwignia jest oznaczona jako "aktywna" (wyzwalająca dostarczanie nagrody w postaci jedzenia), a przydział prawej i lewej dźwigni jest równoważony między myszami. Ważne jest, aby dodać co najmniej 5-sekundowy limit czasu (TO) do harmonogramu FR1 (FR1/TO-5), podczas którego dodatkowe naciśnięcie dźwigni nie powoduje dostarczenia granulki żywności. Ten okres TO daje myszom czas na spożycie granulki pokarmu, jednak dłuższe przerwy mogą być stosowane, jeśli eksperymentator uważa, że jest to konieczne dla ich modelu mysiego. Każda sesja treningowa FR trwa 1 godzinę lub po dostarczeniu 50 granulek.
2. *Kryteria pozyskiwania: Kryteria stosowane do określenia nabycia odpowiedzi na działanie w oparciu o żywność obejmują: (1) minimalną liczbę aktywnych odpowiedzi i zdobytych nagród; (2) miara dyskryminacji między aktywnymi i nieaktywnymi dźwigniami oraz (3) stabilność wyników między sesjami. Myszy wykazujące dyskryminację ≥3:1 dla aktywnej i nieaktywnej dźwigni i uzyskujące ≥ 20 nagród na sesję w ciągu trzech kolejnych sesji są uważane za spełniające kryterium akwizycji¹⁰. Zaobserwowaliśmy, że większość (~75%) myszy C57BL6 wymaga około 7-10 dni treningu, aby spełnić kryteria akwizycji. Myszy, które do tego czasu nie osiągną kryteriów nabycia, przechodzą dalsze szkolenie przez dodatkowe 5-7 dni. Wykluczamy myszy z testów (~5% przypadków), gdy nie ma postępów do dodatkowego 5. dnia treningowego. Ważne jest, aby pamiętać, że upośledzone nabywanie substancji może być wynikiem pewnych interwencji farmakologicznych i genetycznych i dlatego powinno być udokumentowane.
3. Po trzech kolejnych sesjach uzyskiwania ≥ 20 granulek, harmonogram zostaje zwiększony do FR5/TO-5 sekund, w których 5 aktywnych naciśnięć dźwigni uruchamia dostarczanie granulek żywności. Szkolenie na grafiku FR5 trwa trzy dni.
4. *Myszy są następnie szkolone w harmonogramie wzmacniania według progresywnego współczynnika (PR). Harmonogram współczynnika odpowiedzi podczas testów PR można obliczyć zgodnie z Richardsonem i Robertsem (1996)¹¹ przy użyciu następującego wzoru (zaokrąglonego do najbliższej liczby całkowitej):
   = [5e ^(R*0,2)] - 5
   gdzie R jest równe liczbie już zdobytych nagród w postaci żywności plus 1 (tj. następny wzmacniacz). Tak więc liczba odpowiedzi wymaganych do zdobycia nagrody w postaci jedzenia jest zgodna z kolejnością: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 i tak dalej. Ostatnim ukończonym współczynnikiem jest punkt przerwania.
5. Sesja PR trwa maksymalnie 1 godzinę. Nienaciśnięcie dźwigni w dowolnym okresie 10 minut skutkuje zakończeniem sesji. Wydajność w harmonogramie PR wzmocnienia jest uważana za stabilną, gdy liczba nagród zdobytych w 1-godzinnej sesji odchyla się o ≤10% przez co najmniej 3 kolejne dni.

4. Testowanie i walidacja progresywnych proporcji

1. Aby zweryfikować reagowanie operacyjne utrzymywane przez żywność w zadaniu PR, można ocenić punkt przerwania reagowania po manipulacjach, o których wiadomo, że modulują nagrodę za jedzenie. Stosunkowo łatwym do przeprowadzenia testem jest deprywacja pokarmowa, która zwiększy stan motywacyjny myszy do jedzenia, a tym samym zwiększy punkty graniczne. Myszy muszą najpierw zostać przetestowane w zadaniu PR w okresie karmienia ad libitum, aż do osiągnięcia stabilnej, wyjściowej wydajności. Dzień po ostatnim dniu "bazowym" pokarm jest usuwany z klatki domowej, a myszy są następnie testowane w zadaniu PR 24 godziny po rozpoczęciu postu.
2. Zbadaliśmy również, czy obwodowe podawanie hormonu anorektycznego leptyny miałoby odwrotny wpływ na progi punktu granicznego. Leptyna (A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, NIDDK) została rozpuszczona w sterylnym PBS. Badanie PR przeprowadzono po wstrzyknięciu IP PBS jednego dnia, a następnie po wstrzyknięciu leptyny (5 mg/kg) następnego dnia. Leptyna została wstrzyknięta na godzinę przed badaniem PR. Punkty przerwania porównano za pomocą sparowanego testu t (GraphPad Prism).

5. Reprezentatywne wyniki

Podczas testowania zdolności osób pozbawionych jedzenia do modulowania punktów granicznych reagujących na harmonogram PR wzmocnienia, spodziewamy się znacznego zwiększenia punktów przerwania, jak pokazano na rysunku 1. W tym eksperymencie 24-godzinny okres deprywacji żywności spowodował ~3,6-krotny wzrost punktów granicznych w porównaniu z tymi uzyskanymi w stanie wyjściowym swobodnego żywienia, co sugeruje, że deprywacja żywności zwiększa satysfakcjonujące efekty jedzenia. W przeciwieństwie do tego, obwodowe podanie hormonu anorektycznego leptyny (5 mg/kg, IP) na godzinę przed badaniem powinno zmniejszyć punkt graniczny odpowiedzi, jak pokazano na rycinie 2.

Rysunek 1. Post zwiększa satysfakcjonujące efekty jedzenia. 24-godzinny post istotnie zwiększył punkty przerwania w harmonogramie przyrostowego współczynnika (PR) wzmocnienia u myszy (n = 4). Średnia±SEM; *P<.05.

Rysunek 2. Leptyna zmniejsza nagrodę w postaci pożywienia u myszy. Podawanie leptyny obwodowej (5 mg/kg) obniżało progi granicznej odpowiedzi PR u myszy (n=4). Średnia±SEM; *P<0,05.

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez Med Associates, Inc.