Niniejszy raport szczegółowo opisuje protokół wykorzystany do pomiaru efektów nagradzających wysokotłuszczowej diety u myszy z wykorzystaniem zadania warunkowania sprawczego o stosunku progresywnym.
Artykuł metodologiczny
Reagowanie w schemacie progresywnego stosunku wzmocnień dla smakołyków o wysokiej zawartości tłuszczów i cukrów u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Produkty spożywcze bogate w tłuszcze i cukry w znacznym stopniu przyczyniają się do przejadania i rosnącego wskaźnika otyłości. Spożywanie smacznych pokarmów może wywoływać efekt nagrody, który wzmacnia powiązania między działaniem a rezultatem i utrwala przyszłe zachowania ukierunkowane na pozyskiwanie tych produktów. Rosnące dowody na to, że efekty nagrody związane z żywnością o wysokiej gęstości energetycznej odgrywają kluczową rolę w przejadaniu i rozwoju otyłości, zwiększyły zainteresowanie badaniem genów, cząsteczek i obwodów neuronalnych modulujących nagrodę żywieniową1,2. Wpływ nagrody różnych bodźców można badać, mierząc gotowość do wysiłku w celu ich uzyskania, na przykład w zadaniach warunkowania instrumentalnego3. Instrumentalne modele nagrody żywieniowej mierzą nabyte i dobrowolne reakcje behawioralne ukierunkowane na zdobycie pożywienia. Powszechnie stosowaną miarą siły nagrody jest procedura instrumentalna znana jako schemat wzmocnień o progresywnym stosunku (PR – progressive ratio).4,5 W zadaniu PR od badanego wymaga się wykonania coraz większej liczby reakcji instrumentalnych dla każdej kolejnej nagrody. Pionierskie badanie Hodos (1961) wykazało, że liczba reakcji wykonanych w celu uzyskania ostatniej nagrody, określana jako punkt przełamania (breakpoint), służy jako wskaźnik siły nagrody4. Podczas gdy procedury instrumentalne mierzące wyłącznie zmiany w tempie reakcji nie pozwalają oddzielić zmian siły nagrody od zmian w wydajności wykonawczej, punkt przełamania wynikający ze schematu PR jest dobrze zwalidowaną miarą efektów nagrody żywieniowej. Zadanie PR było szeroko stosowane do oceny wpływu nagrody narkotyków oraz pokarmów u szczurów (np.6-8), ale w mniejszym stopniu u myszy9. Zwiększone wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy oraz modeli myszy z otyłością indukowaną dietą zwiększyło zapotrzebowanie na behawioralne miary nagrody żywieniowej u myszy. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy materiały i procedury wykorzystywane do uczenia myszy reagowania (naciskania dźwigni) w celu otrzymania wysokotłuszczowych i wysokocukrowych peletów spożywczych w schemacie wzmocnień PR. Wykazujemy, że progi reakcji w punkcie przełamania wzrastają po krótkotrwałym głodzeniu i spadają po obwodowym podaniu hormonu anorektycznego leptyny, co tym samym potwierdza zasadność stosowania tego instrumentalnego paradygmatu żywieniowego u myszy.
Protokół
*Najważniejsze etapy.
1. Sprzęt i oprogramowanie
- Trening i testowanie przeprowadzane są w operantowych komorach dla myszy wyposażonych w dwie ultra-lekkie, chowane dźwignie1 umieszczone po obu stronach otworu na pokarm (patrz Tabela 1). Nad każdą dźwignią znajduje się lampka sygnalizacyjna, a na górze klatki lampka oświetlająca. Dystrybutor peletu znajduje się na zewnątrz komory. Każda komora jest umieszczona w wyciszającej kabinie z wentylatorem. Komory są połączone z komputerem PC z oprogramowaniem MedPC IV za pomocą szafki interfejsu „Smart Control”.
Uwaga: W przypadku braku dźwigni ultralekkich zaleca się stosowanie kontaktu nosem (nose-poke) jako reakcji operacyjnej w badaniach nad myszami. Jednakże, przy dostępności obu opcji, sugerujemy wybór dźwigni ultralekkich jako bardziej wiarygodnego miernika motywacji, ponieważ reakcje kontaktu nosem mogą być wyzwalane przez węszenie eksploracyjne.
- Programy MedPC wykorzystywane do przeprowadzania zadań operacyjnych są napisane w kodzie notacji Medstate, którego użytkownik może nauczyć się z pomocą dostarczonego podręcznika programowania. Programowanie zapewnia użytkownikowi elastyczność w modyfikowaniu istniejących kodów lub generowaniu unikalnych parametrów eksperymentalnych. Niektóre kody można uzyskać bezpłatnie z „Medstate Notation Repository” firmy Med Associates pod adresem http://www.mednr.com. Dodatkowe kody można zakupić od firmy Med Associates.
2. Aklimatyzacja myszy i restrykcje żywieniowe
- Po przyjeździe myszy są trzymane w grupach przez co najmniej 10 dni w celu aklimatyzacji do odwróconego 12-godzinnego cyklu światło/ciemność, z zapewnionym dostępem ad libitum do standardowej karmy i wody. W naszym przypadku stosujemy dorosłe myszy C57BL/6 zakupione od Charles River (St. Constant, QC). Wszystkie manipulacje z myszami oraz eksperymenty behawioralne są przeprowadzane podczas cyklu ciemnego. Wszystkie procedury obejmujące wykorzystanie zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami CRCHUM.
- Następnie myszy są trzymane pojedynczo i poddawane restrykcji pokarmowej (70% dziennego spożycia pokarmu) do momentu osiągnięcia 90-95% masy ciała z okresu swobodnego żywienia, aby ułatwić nabycie reakcji naciskania dźwigni. Myszy otrzymują dzienną porcję pokarmu w klatce domowej po zakończeniu sesji. Po osiągnięciu utraty masy ciała na poziomie 5-10%, dzienna przydzielona ilość pokarmu jest korygowana, aby ustabilizować niższą masę ciała na resztę okresu treningowego. Po spełnieniu przez myszy kryteriów nabycia (patrz poniżej), zostają one przywrócone do schematu żywienia ad libitum. Myszy odzyskują utraconą masę ciała w ciągu około 3-4 dni.
- Przez 3 kolejne dni przed pierwszą sesją treningową myszy są oswajane w pomieszczeniu testowym. W dniu poprzedzającym rozpoczęcie treningu do klatki domowej wprowadza się 10-15 granulek wysokotłuszczowych i wysokocukrowych (HFHS), aby zapobiec potencjalnemu wpływowi neofobii pokarmowej na wyniki w warunkowaniu operacyjnym. Stosujemy beztłuszczowe, precyzyjne granulki pokarmowe HFHS o masie 20 mg (dostępne również 14 mg), w których 48,9% Kcal stanowi tłuszcz (Bio Serv, Frenchtown, NJ).
3. Trening operantowy
- Myszy są początkowo trenowane w naciskaniu dźwigni w schemacie wzmocnienia o stałym stosunku (FR)-1, w którym pojedyncze naciśnięcie dźwigni powoduje podanie granulatu pokarmowego do pojemnika. Tylko jedna dźwignia jest wyznaczona jako „aktywna” (wyzwalająca podanie nagrody pokarmowej), a przydział dźwigni prawej i lewej jest zrównoważony pomiędzy myszami. Ważne jest wprowadzenie co najmniej 5-sekundowego czasu oczekiwania (timeout, TO) do schematu FR1 (FR1/TO-5), podczas którego dodatkowe naciskanie dźwigni nie skutkuje podaniem granulatu pokarmowego. Okres TO pozwala myszom na zjedzenie granulatu, jednak można zastosować dłuższe czasy oczekiwania, jeśli eksperymentator uzna to za konieczne dla danego modelu mysiego. Każda sesja treningowa FR trwa 1 godzinę lub do momentu podania 50 granulatów.
- *Kryteria nabycia: Kryteria stosowane do określenia nabycia warunkowej odpowiedzi operantowej podtrzymywanej pokarmem obejmują: (1) minimalną liczbę reakcji aktywnych i otrzymanych nagród; (2) miarę rozróżniania między dźwignią aktywną a nieaktywną oraz (3) stabilność wyników między sesjami. Za spełnienie kryteriów nabycia uznaje się myszy wykazujące rozróżnienie ≥3:1 dla dźwigni aktywnej względem nieaktywnej i otrzymujące ≥ 20 nagród na sesję przez trzy kolejne sesje10. Zaobserwowaliśmy, że większość (~75%) myszy C57BL6 wymaga około 7-10 dni treningu, aby spełnić kryteria nabycia. Myszy, które do tego czasu nie osiągną kryteriów nabycia, przechodzą dalszy trening przez dodatkowe 5-7 dni. Wykluczamy myszy z testów (~5% przypadków), gdy brak jest postępów do piątego dodatkowego dnia treningowego. Należy pamiętać, że upośledzone nabycie reakcji operantowej może być wynikiem określonych interwencji farmakologicznych i genetycznych, a zatem powinno zostać udokumentowane.
- Po trzech kolejnych sesjach uzyskania ≥ 20 granulatów, schemat jest zwiększany do FR5/TO-5 sekund, w którym 5 aktywnych naciśnięć dźwigni wyzwala podanie granulatu pokarmowego. Trening w schemacie FR5 trwa trzy dni.
- *Następnie myszy są trenowane w schemacie wzmocnienia o stosunku progresywnym (PR). Schemat stosunku reakcji podczas testów PR można obliczyć zgodnie z metodą Richardsona i Robertsa (1996)11, stosując następujący wzór (zaokrąglony do najbliższej liczby całkowitej):
= [5e (R*0.2)] - 5
gdzie R jest równe liczbie nagród pokarmowych już zdobytych plus 1 (tj. kolejny wzmocniacz). Zatem liczba reakcji wymaganych do otrzymania nagrody pokarmowej następuje w kolejności: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 i tak dalej. Ostatni ukończony stosunek stanowi punkt przełamania (breakpoint). - Sesja PR trwa maksymalnie 1 godzinę. Brak naciśnięcia dźwigni w dowolnym 10-minutowym odstępie czasu skutkuje zakończeniem sesji. Wyniki w schemacie wzmocnienia PR uznaje się za stabilne, gdy liczba nagród zdobytych w jednej godzinnej sesji odchyla się o ≤10% przez co najmniej 3 kolejne dni.
4. Testy progresywnego stosunku i walidacja
- Aby zwalidować utrzymywane przez pożywienie reagowanie operacyjne w zadaniu PR, można ocenić reagowanie w punkcie przełamania (breakpoint) po manipulacjach znanych z modulowania nagrody pokarmowej. Stosunkowo łatwym do przeprowadzenia testem jest deprywacja pokarmowa, która zwiększy stan motywacyjny myszy względem pokarmu, a tym samym podniesie punkty przełamania. Myszy muszą zostać najpierw przetestowane w zadaniu PR podczas okresu karmienia ad libitum, aż do osiągnięcia stabilnych wyników bazowych. Dzień po ostatnim dniu „bazowym” pokarm zostaje usunięty z klatki domowej, a następnie myszy są testowane w zadaniu PR 24 godziny po rozpoczęciu postu.
- Zbadaliśmy również, czy obwodowe podanie anoreksyjnego hormonu leptyny wywrze przeciwny wpływ na progi punktu przełamania. Leptynę (A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, NIDDK) rozpuszczono w sterylnym PBS. Testowanie PR przeprowadzono po wstrzyknięciu PBS drogą IP jednego dnia, a następnie po wstrzyknięciu leptyny (5 mg/kg) następnego dnia. Leptynę wstrzykiwano na godzinę przed testem PR. Punkty przełamania porównano za pomocą testu t dla prób zależnych (GraphPad Prism).
5. Reprezentatywne wyniki
Podczas badania zdolności deprywacji pokarmowej do modulowania odpowiedzi w punkcie przełamania (breakpoint) w schemacie wzmacniania PR, spodziewamy się znaczącego wzrostu punktów przełamania, jak pokazano na Rysunku 1. W tym eksperymencie 24-godzinny okres deprywacji pokarmowej spowodował ok. 3,6-krotny wzrost punktów przełamania w porównaniu z wynikami uzyskanymi w bazowym stanie swobodnego żywienia, co sugeruje, że deprywacja pokarmowa zwiększa efekty nagradzające pokarmu. W przeciwieństwie do tego, obwodowe podanie hormonu anorektycznego leptyny (5 mg/kg, IP) na godzinę przed testem powinno zmniejszyć odpowiedź w punkcie przełamania, jak pokazano na Rysunku 2.
Rysunek 1. Głodówka zwiększa efekty nagradzające pożywienia. 24 h głodówki znacząco zwiększyły punkty przełomowe w harmonogramie wzmocnień o progresywnym stosunku (PR) u myszy (n=4). Średnia±SEM; *p<.05.
Rycina 2. Leptyna zmniejsza nagrodę pokarmową u myszy. Obwodowe podanie leptyny (5 mg/kg) obniżyło progi odpowiedzi punktu przełamania PR u myszy (n=4). Średnia±SEM; *p<0.05.
Dyskusja
Zadania warunkowania instrumentalnego stanowią skuteczną metodę oceny zmian w motywacyjnych właściwościach pokarmu. Procedury eksperymentalne szczegółowo opisane w niniejszym artykule umożliwiają wytrenowanie myszy w naciskaniu dźwigni w celu otrzymania nagrody pokarmowej oraz stabilne reagowanie w schemacie wzmocnień PR.
Pomiar ilości spożytego pokarmu nie dostarcza takich samych wyników, jak miary odpowiedzi oparte na wysiłku, ponieważ nie wszystkie czynniki wpływające na przyjmowanie pokarmu modulują efekty nagradzające jedzenia. Na przykład wyczerpanie dostępnej glukozy poprzez obwodowe podanie 2-deoxyglucose u szczurów zwiększa ilość spożytego pokarmu dostępnego swobodnie, ale nie zmienia punktów przełamania (break points) w zadaniu PR dla pokarmu12. Reagowanie w punkcie przełamania PR może również odzwierciedlać zmiany w jakości nagród pokarmowych. Na przykład punkty przełamania są dodatnio skorelowane z koncentracją sacharozy, co dowodzi, że motywacja do spożycia sacharozy wzrasta w sposób zależny od słodkiego smaku8. Tutaj wykazujemy, że 24-godzinny głód u myszy znacznie zwiększa punkty przełamania PR dla pokarmu HFHS. Z kolei stwierdziliśmy, że obwodowe podanie anorektycznego hormonu leptyny znacząco zmniejsza punkty przełamania dla pokarmu HFHS u myszy. Wyniki te są spójne z wcześniej raportowanym działaniem głodzenia i leptyny na progi nagrody u szczurów12-14.
Podczas stosowania tego protokołu należy pamiętać, że nabycie warunkowej odpowiedzi operantowej podtrzymywanej pokarmem jest znacząco usprawniane przez regularne treningi (co 1-2 dni) oraz przez zwiększenie stanu motywacyjnego myszy poprzez zastosowanie reżimu ograniczenia dostępu do pokarmu. Ponadto, zapewnienie, że myszy wykazują relatywnie stabilną odpowiedź w ramach jednego schematu wzmocnień przed przejściem do bardziej złożonych schematów (np. z FR1 na FR5), jest kluczowe dla zminimalizowania zmienności wyników podczas testowania. Pomimo zastosowania tych kroków, nie jest rzadkością uzyskanie pewnej zmienności, zwłaszcza pomiędzy poszczególnymi myszami. Z tego powodu wysoce zaleca się stosowanie projektu wewnątrzobiektowego (z pomiarami powtarzanymi), jeśli jest to możliwe, aby wyeliminować zmienność międzyobiektową. Chociaż testowanie wewnątrzobiektowe nie jest możliwe w przypadku badania trwałych modyfikacji genetycznych (np. myszy z nokautem w porównaniu z myszami kontrolnymi), można je wykorzystać do badania wpływu leków, uszkodzeń lub ostrych manipulacji genetycznych (np. optogenetycznych).
Otyłość oraz choroby z nią związane stanowią narastający problem, co zwiększyło pilną potrzebę zidentyfikowania zaangażowanych w nie cząsteczek i szlaków neuronalnych. Narastające dowody podkreślają istotną rolę obwodów nagrody w mózgu w zapotrzebowaniu na jedzenie, zwiększeniu spożycia kalorii oraz przybieraniu na wadze. Zadanie PR jest cennym narzędziem do pomiaru wpływu manipulacji neurobiologicznych, genetycznych lub farmakologicznych na efekty nagradzające jedzenia.
Oświadczenia
Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez Med Associates, Inc.
Podziękowania
Projekt ten był wspierany przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (355881) oraz Canadian Foundation for Innovation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komory operacyjne dla myszy |  Med Associates, Inc. | ENV-009A | Med Associates Inc. skrytka pocztowa 319 St. Albans, Vermont 05478, USA Tel.: (802) 527-2343 |
| Inteligentny panel sterowania połączeniami z 8 wejściami/16 wejściami | Med Associates, Inc. | SG-716B | |
| Ultralekka chowana dźwignia do myszy | Med Associates, Inc. | ENV-312 | |
| Dozownik do peletu | Med Associates, Inc. | ENV-203 | |
| Oświetlenie ogólne | Med Associates, Inc. | ENV-215 | |
| Bodziec świetlny | Med Associates, Inc. | ENV-221 | |
| Bezpylna precyzyjna waga 20 mg do próbek wysokotłuszczowych & granulaty o wysokiej zawartości cukru | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv One 8th Street, Suite 1 Frenchtown, NJ 08825, USA Telefon: (800)-996-9908 |
| Tabela 1. Specjalistyczny sprzęt i materiały |
Bibliografia
- Fulton, S. Appetite and reward. Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).
- Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals. International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).
- Skinner, B. F. The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis. , Appelton-Century. (1938).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Hodos, W., Kalman, G. Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance. J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).
- Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review. Psychopharmacology. , 139-169 (1998).
- Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat. Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).
- Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia. Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).
- Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule. Peptides. 27, 2829-2835 (2006).
- Haluk, D. M., Wickman, K. Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice. Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).
- Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior. Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).
- Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. Modulation of brain reward circuitry by leptin. Science. 287, 125-128 (2000).
- Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats. Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).
Przedruki i uprawnienia
