Opisano metodę pomiaru ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w okresie embrionalnym i neonatalnym. Ciśnienie mierzy się poprzez wprowadzenie igły połączonej z przetwornikiem wypełnionym cieczą do LV pod kontrolą ultradźwięków. Podczas realizacji protokołu eksperymentalnego należy zadbać o utrzymanie prawidłowej funkcji serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ciśnienie krwi znacząco wzrasta podczas rozwoju embrionalnego i ponatalnego u zwierząt kręgowców. U myszy przepływ krwi jest po raz pierwszy wykrywalny około 8,5 dnia embrionalnego (E)1. Skurczowe ciśnienie w lewej komorze (LV) wynosi 2 mmHg w E9,5 oraz 11 mmHg w E14,52. Na tych środkowych etapach rozwoju embrionalnego LV jest wyraźnie widoczna przez ścianę klatki piersiowej, co umożliwia inwazyjne pomiary ciśnienia, ponieważ żebra i skóra nie są w pełni rozwinięte. Między E14,5 a narodzinami (około E21) do obrazowania LV należy stosować metody obrazowania. Po urodzeniu średnie ciśnienie tętnicze wzrasta od 30 do 70 mmHg między 2. a 35. dniem ponatalnym (P)3. Po P20 ciśnienie tętnicze można mierzyć za pomocą cewników półprzewodnikowych (np. Millar lub Scisense). Przed P20 cewniki te są zbyt duże dla rozwijających się tętnic myszy, dlatego ciśnienie tętnicze musi być mierzone za pomocą specjalnie przygotowanych, wyciąganych cewników plastikowych podłączonych do przetworników ciśnienia wypełnionych cieczą3 lub szklanych mikropipet podłączonych do serwomechanicznych przetworników ciśnienia zerującego4.
Nasze ostatnie badania wykazały, że największy wzrost ciśnienia tętniczego u myszy występuje w okresie od późnego embrionalnego do wczesnego postnatalnego5-7. Ten znaczny wzrost ciśnienia tętniczego może wpływać na fenotyp komórek mięśni gładkich (SMC) w rozwijających się tętnicach i wywoływać istotne zdarzenia mechanotransdukcyjne. W przypadku chorób ludzkich, w których właściwości mechaniczne rozwijających się tętnic są upośledzone przez defekty białek macierzy zewnątrzkomórkowej (np. zespół Marfana8 i nadzastawkowe zwężenie aorty9), gwałtowne zmiany ciśnienia tętniczego w tym okresie mogą przyczyniać się do fenotypu i nasilenia choroby poprzez zmiany w sygnałach mechanotransdukcyjnych. Dlatego ważne jest, aby móc mierzyć zmiany ciśnienia tętniczego w późnym okresie embrionalnym i w okresie noworodkowym w mysich modelach ludzkich chorób.
Opisujemy metodę pomiaru ciśnienia w LV u myszy w późnym okresie embrionalnym (E18) oraz we wczesnym okresie postnatalnym (P1 - 20). Igłę połączoną z wypełnionym cieczą przetwornikiem ciśnienia wprowadza się do LV pod kontrolą ultradźwięków. Podczas realizacji protokołu eksperymentalnego dbano o zachowanie prawidłowej funkcji serca, szczególnie w przypadku myszy w okresie embrionalnym. Przedstawiono reprezentatywne dane oraz omówiono ograniczenia protokołu.
Protokół
1. System ultradźwiękowy i ciśnieniowy
- Uruchom system ultrasonograficzny zgodnie z instrukcjami producenta (Vevo 770, Visualsonics). Napełnij odpowiednią głowicę (wiek E18 - P7 = model 708, wiek > P7 = model 707B) wodą destylowaną i podłącz do systemu ultrasonograficznego. Umieść głowicę w regulowanym uchwycie w orientacji przybliżonej do tej niezbędnej do uzyskania obrazu LV w osi długiej dla myszy zamocowanej na platformie obrazującej, tak aby wierzchołek LV był skierowany w stronę ramienia do iniekcji.
- System pomiaru ciśnienia składa się z wypełnionego cieczą przetwornika ciśnienia, wzmacniacza mostkowego, systemu akwizycji danych oraz oprogramowania do rejestracji danych (LabChart). Połączenia obejmują trójdrożne kurki, rurki, złącza Luer-lock i kolanka do węży. Strzykawkę o pojemności 20 mL napełnia się 10% roztworem soli fizjologicznej z heparyną do przepłukiwania na jednym końcu. Drugi koniec łączy się z igłą, a korpus strzykawki 3 mL jest modyfikowany w celu wykorzystania go jako obudowy utrzymującej rurkę igły w ramieniu do iniekcji (Rycina 1).
- Zkalibruj system przetwornika ciśnienia za pomocą manometru.
- Zamontuj rurkę igły wraz z obudową w ramieniu do iniekcji systemu ultrasonograficznego. Zamocuj przetwornik ciśnienia w statywie pierścieniowym na wysokości zbliżonej do wysokości platformy obrazującej. Do rurki igły przymocuj igłę odpowiednią dla wieku myszy (wiek E18 - P3 = 30G, wiek > P3 = 25G). Mniejsze igły częściej ulegają zapchaniu, trudniej je wprowadzić przez ścianę klatki piersiowej i charakteryzują się wolniejszym czasem reakcji. Dlatego dla każdego wieku stosuje się największy rozmiar igły, który mieści się w świetle LV.
- Nałóż kopczyk żelu do ultrasonografii na platformę obrazującą i ostrożnie wyrównaj głowicę za pomocą regulowanego uchwytu, tak aby igłę można było wprowadzić bezpośrednio w żel pod środek głowicy obrazującej (Rycina 2). Igła musi znajdować się wystarczająco nisko pod głowicą, aby nie przebić jej osłony, ale wystarczająco blisko, aby mieścić się w głębokości ogniskowej głowicy. W razie potrzeby igłę można wygiąć ręcznie, aby pozostawała w odpowiedniej płaszczyźnie przez całą drogę wprowadzania.
- Zachowując wyrównanie, wycofaj igłę i podnieś głowicę obrazującą, aby umieścić mysz na platformie obrazującej. Przepłucz igłę, aby usunąć ewentualny żel, który mógł dostać się do jej końcówki.
2. Przygotowanie myszy
- Wszystkie metody przedstawione w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC). Z narkozą matki w określonym dniu ciąży (E18) lub myszy noworodkowej (P1 - 20) należy przeprowadzić poprzez ciągłą inhalację 1,5% izofluranu. Do standardowego stożka nosowego można włożyć rurkę, aby dostosować go do małej głowy wczesnej myszy noworodkowej (P1 - 15).
- Przymocuj mysz do platformy obrazowej systemu ultradźwiękowego w pozycji na plecach, tak aby wierzchołek LV był skierowany w stronę ramienia do iniekcji. W przypadku matek w ciąży nałóż żel ultradźwiękowy, aby monitorować częstotliwość akcji serca za pomocą dołączonego detektora EKG, oraz wprowadź termometr rektalny do kontroli zwrotnej temperatury ciała. Myszy noworodkowe są zbyt małe dla tych detektorów, dlatego częstotliwość akcji serca jest monitorowana podczas pomiarów ciśnienia, a temperatura ciała jest utrzymywana za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej.
- Usuń włosy z brzucha matki w ciąży lub z klatki piersiowej młodej myszy za pomocą kremu do depilacji. Myszy noworodkowe (P1 - 10) nie wymagają usuwania włosów.
- W przypadku matek w ciąży nacinaj brzuch, używając nożyczek sekcyjnych i zakrzywionych pincet. Wyprowadź jeden róg macicy i umieść go na gazie zwilżonej ciepłym roztworem soli fizjologicznej. Ostrożnie przesuń embrion do właściwej pozycji, aby uzyskać obraz LV w osi długiej przyściannej za pomocą głowicy ultradźwiękowej. Zmierz ciśnienie we wszystkich embrionach po tej stronie przed wyprowadzeniem drugiego rogu macicy. Utrzymuj wszystkie embriony oraz brzuch matki w stanie wilgotnym, okresowo dodając ciepłą sól fizjologiczną.
3. Pomiar ciśnienia
- Nanieś podgrzany i odgazowany żel do USG na embrion lub noworodka myszy. W przypadku noworodków myszy, które nie zostały poddane depilacji, należy przed nałożeniem głównej ilości żelu wetrzeć niewielką ilość żelu do USG na klatkę piersiową, aby poprawić sprzężenie. Obniż głowicę obrazującą i dostosuj kąt platformy obrazowania, aby uzyskać optymalny widok osi długiej LV w przekroju parasternalnym. Nie zmieniaj kąta nachylenia głowicy, ponieważ spowoduje to utratę osiowości igły.
- Monitorując obraz LV na ekranie USG, powoli wprowadzaj igłę, aż znajdzie się ona w pobliżu dolnej krawędzi głowicy. W razie potrzeby skoryguj położenie igły i głowicy, aby naprawić przesunięcia osiowości. Delikatnie przepłucz igłę solą fizjologiczną. Rozpocznij rejestrację danych ciśnienia i wyzeruj przetwornik ciśnienia za pomocą oprogramowania LabChart. Przetwornik wykazuje dryft w zależności od temperatury i położenia, dlatego ważne jest jego zerowanie bezpośrednio przed pomiarem ciśnienia u każdej myszy.
- Powoli wprowadzaj igłę, aż stanie się ona widoczna na krawędzi obrazu USG, ale nie będzie jeszcze znajdować się w LV. W razie potrzeby skoryguj położenie igły, aby wprowadzić ją do LV w okolicy wierzchołka. Jeśli to konieczne, dostosuj położenie głowicy, aby zachować wyraźny obraz igły. Wprowadź igłę do światła LV (Rycina 3), rejestrując jednocześnie dane ciśnienia i monitorując położenie igły na obrazie USG. Rozpoczęcie pulsacyjnych zapisów z przetwornika ciśnienia potwierdza obecność igły w świetle LV (Rycina 4).
- Jeśli igła wydaje się znajdować w świetle LV, ale zapisy ciśnienia nie mają charakteru pulsacyjnego, przepłucz ją, lekko uderzając w tłok strzykawki, tylko do momentu wykrycia wzrostu ciśnienia (objętość około 5 - 10 μL). Powinno to usunąć wszelkie zatory, które mogą uniemożliwiać dokładny odczyt. Jeśli odczyty ciśnienia nadal nie są pulsacyjne, igła może znajdować się powyżej lub poniżej właściwej płaszczyzny i nie być wprowadzona do światła LV. Cofnij igłę, przepłucz ją solą fizjologiczną i wprowadź ponownie. Jeśli nadal nie uzyskano odczytów pulsacyjnych, przejdź do następnej myszy. Dla każdej myszy używaj nowej igły.
- Pomyślne odczyty ciśnienia można uzyskać u 75% badanych embrionów i noworodków myszy. Każdy odczyt powinien trwać od 5 do 10 minut; dane ciśnienia dla danej myszy nie powinny być uwzględnione, jeśli częstość akcji serca znacząco odbiega od oczekiwanej (Rycina 5A). Częstość akcji serca ma istotny wpływ na pomiary sercowo-naczyniowe, a zmieniona częstość akcji serca świadczy o stresie kardiologicznym. Stres embrionalny występuje zazwyczaj 1 - 1,5 godziny po pierwszym zewnętrznym odsłonięciu macicy, dlatego szybkość działania jest kluczowa przy pomiarach ciśnienia u całego miotu.
4. Reprezentatywne wyniki
Wszystkie przedstawione wyniki dotyczą myszy C57BL6J. Zdjęcie igły w świetle LV u myszy P1 pokazano na Rysunku 3. Igła jest niezbędna do przebicia ścian klatki piersiowej i uzyskania dostępu do małego światła LV, lecz znacząco zwiększa czas odpowiedzi systemu ciśnieniowego. Gdy do systemu ręcznie zastosowano przybliżony skokowy wzrost ciśnienia, czas osiągnięcia 67% ciśnienia maksymalnego wyniósł 0,067 s dla samego przewodu (co najprawdopodobniej wskazuje na rzeczywisty czas aplikacji skoku ciśnienia), 0,105 s z igłą 25 G oraz 0,529 s z igłą 30 G. Opóźnienie w osiągnięciu ciśnienia maksymalnego jest widoczne na pełnych zapisach przedstawionych na Rysunkach 4A i 4C. Chociaż czas odpowiedzi jest dłuższy przy użyciu igły 30 G, kształt fali jest lepiej uchwycony w etapach embrionalnym i wczesnym neonatalnym, ponieważ częstotliwość akcji serca u myszy wzrasta wraz z wiekiem5. Mimo tego ograniczenia, ciśnienie skurczowe można obliczyć, przyjmując, że rzeczywiste ciśnienie rozkurczowe (minimalne) LV wynosi zero, a skurczowe (maksymalne) ciśnienie LV jest dwukrotnością średniego ciśnienia LV wyznaczonego z odczytów w stanie ustalonym (Rysunki 4B i 4D)6. Zazwyczaj przyjmuje się, że skurczowe ciśnienia w LV i w tętnicach są sobie równe. Zmierzone częstotliwości akcji serca oraz obliczone ciśnienia LV dla różnych wieku od E18 do P14 przedstawiono na Rysunku 5.
Rycina 1. Zdjęcie przetwornika ciśnienia z przymocowanymi trójdrożnymi kranikami, męskimi (M) i żeńskimi (F) złączami Luer lock, kolcami do węży, rurkami, strzykawkami i igłą.
Rysunek 2. Zdjęcie układu służącego do wyrównania igły z sondą obrazującą (A). Platforma obrazująca jest obrócona tak, aby wierzchołek LV myszy był skierowany w stronę ramienia do iniekcji. Sonda jest zamontowana w regulowanym uchwycie w orientacji przybliżonej do tej niezbędnej do uzyskania obrazu osi długiej LV. Obudowa rurki igły jest zamontowana w ramieniu do iniekcji. Igłę wprowadza się w kopczyk żelu ultradźwiękowego na platformie obrazującej, aby określić właściwy kąt oraz pozycję pionową i poziomą względem sondy obrazującej (B).
Rysunek 3. Obraz igły (N) wprowadzonej przez ścianę klatki piersiowej (CW) do światła LV u myszy P1. Pasek skali = 0.1 mm.
Rysunek 4. Przykładowe odczyty ciśnienia pulsacyjnego podczas wprowadzania igły do LV myszy w dniu E18 (A) i P14 (C). Występuje opóźnienie w osiągnięciu stanu stacjonarnego ze względu na czas odpowiedzi układu z podłączoną igłą. Powiększone widoki odczytów w stanie stacjonarnym przedstawiono w B i D. Należy zauważyć, że minimalne ciśnienia w LV w dniu E18 są bliskie zeru, jednak pełna fala od zera do ciśnienia maksymalnego nie może zostać zarejestrowana przy wyższych częstotliwościach akcji serca u myszy P14. Średnie ciśnienia są mierzone z odczytów w stanie stacjonarnym i przyjmuje się, że ciśnienie skurczowe w LV = 2 x zmierzone ciśnienie średnie.
Rycina 5. Zmierzone tętno (A) i obliczone ciśnienie skurczowe LV dla myszy w dniach E18 - P14. N = 7 dla E18, 5 dla P1, 22 dla P3, 23 dla P7 i 16 dla P145-7.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę pomiaru ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w późnym okresie embrionalnym i wczesnym okresie neonatalnym. Głównym ograniczeniem tego protokołu jest rozdzielczość czasowa systemu pomiarowego. Sygnał ciśnienia ulega tłumieniu podczas przemieszczania się z LV przez igłę do przetwornika, przez co rejestrowane mogą być jedynie średnie wartości ciśnienia. Tłumienie można zminimalizować, stosując możliwie największą igłę, jednak musi ona mieścić się w świetle LV u myszy w różnym wi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana częściowo z grantów NIH HL087653 oraz HL105314. Niektóre z metod zostały opracowane w laboratorium dr. Roberta Mechama w Washington University School of Medicine.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System ultradźwiękowy o wysokiej rozdzielczości | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Lub inny odpowiedni system ultradźwiękowy |
| Wysokoczęstotliwościowe głowice ultradźwiękowe | VisualSonics, inc. | 708 i 707B | |
| Platforma obrazowania i ramię do iniekcji | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | Z EKG i sprzężeniem zwrotnym temperatury platformy |
| Przetwornik ciśnienia | ADInstruments | MLT 844 | |
| Wzmacniacz mostkowy | ADInstruments | ML221 | |
| System akwizycji danych | ADInstruments | ML866 | |
| Oprogramowanie do rejestracji danych | ADInstruments | LabChart | |
| Statyw z obejmą | Różni | Do utrzymania przetwornika ciśnienia podczas pomiarów | |
| Trójdrożne kurki z połączeniami luer, blokada męska | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| Przewody Tygon o wewnętrznej średnicy 1/16" | Cole-Parmer | 06408 | |
| Złącza luer męskie i żeńskie z kolcem 1/16" | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| Przewód 24" z łączem luer męskim i żeńskim na każdym końcu | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| Strzykawki 3 i 10 mL | BD Biosciences | ||
| Igły 30 i 25G | BD Biosciences | Długość 1,5 cala | |
| Manometr Big Ben | Riester | 1456-100 | |
| Sól fizjologiczna | Różni | ||
| Heparyna | Różni | ||
| Żel do USG | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Krem do depilacji | Nair |
Bibliografia
- Ji, R. P. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos. Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).
- Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).
- Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice. Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).
- Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).
- Wagenseil, J. E. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).
- Wagenseil, J. E. The importance of elastin to aortic development in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).
- Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. Extracellular microfibrils in development and disease. Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).
- Li, D. Y. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
