Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym

Podsumowanie

Opisano metodę pomiaru ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w okresie embrionalnym i neonatalnym. Ciśnienie mierzy się poprzez wprowadzenie igły połączonej z przetwornikiem wypełnionym cieczą do LV pod kontrolą ultradźwięków. Podczas realizacji protokołu eksperymentalnego należy zadbać o utrzymanie prawidłowej funkcji serca.

Streszczenie

Ciśnienie krwi znacząco wzrasta podczas rozwoju embrionalnego i ponatalnego u zwierząt kręgowców. U myszy przepływ krwi jest po raz pierwszy wykrywalny około 8,5 dnia embrionalnego (E)¹. Skurczowe ciśnienie w lewej komorze (LV) wynosi 2 mmHg w E9,5 oraz 11 mmHg w E14,5². Na tych środkowych etapach rozwoju embrionalnego LV jest wyraźnie widoczna przez ścianę klatki piersiowej, co umożliwia inwazyjne pomiary ciśnienia, ponieważ żebra i skóra nie są w pełni rozwinięte. Między E14,5 a narodzinami (około E21) do obrazowania LV należy stosować metody obrazowania. Po urodzeniu średnie ciśnienie tętnicze wzrasta od 30 do 70 mmHg między 2. a 35. dniem ponatalnym (P)³. Po P20 ciśnienie tętnicze można mierzyć za pomocą cewników półprzewodnikowych (np. Millar lub Scisense). Przed P20 cewniki te są zbyt duże dla rozwijających się tętnic myszy, dlatego ciśnienie tętnicze musi być mierzone za pomocą specjalnie przygotowanych, wyciąganych cewników plastikowych podłączonych do przetworników ciśnienia wypełnionych cieczą³ lub szklanych mikropipet podłączonych do serwomechanicznych przetworników ciśnienia zerującego⁴.

Nasze ostatnie badania wykazały, że największy wzrost ciśnienia tętniczego u myszy występuje w okresie od późnego embrionalnego do wczesnego postnatalnego^5-7. Ten znaczny wzrost ciśnienia tętniczego może wpływać na fenotyp komórek mięśni gładkich (SMC) w rozwijających się tętnicach i wywoływać istotne zdarzenia mechanotransdukcyjne. W przypadku chorób ludzkich, w których właściwości mechaniczne rozwijających się tętnic są upośledzone przez defekty białek macierzy zewnątrzkomórkowej (np. zespół Marfana⁸ i nadzastawkowe zwężenie aorty⁹), gwałtowne zmiany ciśnienia tętniczego w tym okresie mogą przyczyniać się do fenotypu i nasilenia choroby poprzez zmiany w sygnałach mechanotransdukcyjnych. Dlatego ważne jest, aby móc mierzyć zmiany ciśnienia tętniczego w późnym okresie embrionalnym i w okresie noworodkowym w mysich modelach ludzkich chorób.

Opisujemy metodę pomiaru ciśnienia w LV u myszy w późnym okresie embrionalnym (E18) oraz we wczesnym okresie postnatalnym (P1 - 20). Igłę połączoną z wypełnionym cieczą przetwornikiem ciśnienia wprowadza się do LV pod kontrolą ultradźwięków. Podczas realizacji protokołu eksperymentalnego dbano o zachowanie prawidłowej funkcji serca, szczególnie w przypadku myszy w okresie embrionalnym. Przedstawiono reprezentatywne dane oraz omówiono ograniczenia protokołu.

Protokół

1. System ultradźwiękowy i ciśnieniowy

1. Uruchom system ultrasonograficzny zgodnie z instrukcjami producenta (Vevo 770, Visualsonics). Napełnij odpowiednią głowicę (wiek E18 - P7 = model 708, wiek > P7 = model 707B) wodą destylowaną i podłącz do systemu ultrasonograficznego. Umieść głowicę w regulowanym statywie w orientacji przybliżonej do tej wymaganej do uzyskania widoku osi długiej LV dla myszy zamontowanej na platformie obrazującej, tak aby wierzchołek LV był skierowany w stronę ramienia do iniekcji.
2. System ciśnieniowy składa się z wypełnionego cieczą przetwornika ciśnienia, wzmacniacza mostkowego, systemu akwizycji danych i oprogramowania do rejestracji danych (LabChart). Połączenia obejmują trójdrożne kurki, rurki, łączniki Luer-lock i kolanka do węży. Strzykawkę o pojemności 20 mL napełnia się 10% roztworem soli fizjologicznej z heparyną w celu przepłukiwania na jednym końcu. Drugi koniec łączy się z igłą, a korpus strzykawki 3 mL jest modyfikowany do użytku jako obudowa utrzymująca rurkę igły w ramieniu do iniekcji (Rysunek 1).
3. Zkalibruj system przetwornika ciśnienia za pomocą manometru.
4. Zamontuj rurkę igły i obudowę w ramieniu do iniekcji systemu ultrasonograficznego. Zamocuj przetwornik ciśnienia w statywie pierścieniowym na wysokości zbliżonej do wysokości platformy obrazującej. Do rurki igły przymocuj igłę odpowiednią dla wieku myszy (wiek E18 - P3 = 30G, wiek > P3 = 25G). Mniejsze igły częściej się zapychają, trudniej je wprowadzić przez ścianę klatki piersiowej i mają wolniejszy czas odpowiedzi. Dlatego dla każdego wieku stosuje się największy rozmiar igły, który mieści się w świetle LV.
5. Nałóż kopczyk żelu do USG na platformę obrazującą i ostrożnie ustaw głowicę za pomocą regulowanego statywu tak, aby igłę można było wprowadzić bezpośrednio do żelu pod środek głowicy obrazującej (Rysunek 2). Igła musi znajdować się wystarczająco nisko pod głowicą, aby nie przebić jej osłony, ale wystarczająco blisko, aby znajdować się w głębokości ogniskowej głowicy. W razie potrzeby igłę można wygiąć ręcznie tak, aby pozostawała w prawidłowej płaszczyźnie podczas całego ruchu.
6. Zachowując osiowość, wycofaj igłę i podnieś głowicę obrazującą, aby umieścić mysz na platformie obrazującej. Przepłucz igłę, aby usunąć ewentualny żel, który mógł dostać się do jej końcówki.

2. Przygotowanie myszy

1. Wszystkie metody przedstawione w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt. Z narkozą myszy w określonym dniu ciąży (E18) lub myszy noworodkowej (P1 - 20) należy przeprowadzić poprzez ciągłą inhalację 1,5% izofluranu. Do standardowego stożka nosowego można włożyć rurkę, aby dostosować go do małej głowy wczesnego noworodka myszy (P1 - 15).
2. Unieruchom mysz na platformie obrazującej systemu ultradźwiękowego w pozycji na plecach, tak aby wierzchołek LV był skierowany w stronę ramienia do iniekcji. W przypadku ciężarnych matek należy nałożyć żel do badań USG, aby monitorować częstotliwość akcji serca za pomocą dołączonego detektora EKG, oraz wprowadzić termometr rektalny w celu sprzężenia zwrotnego kontroli temperatury ciała. Myszy noworodkowe są zbyt małe dla tych detektorów, dlatego częstotliwość akcji serca jest monitorowana podczas pomiarów ciśnienia, a temperatura ciała jest utrzymywana za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej.
3. Usuń owłosienie z brzucha ciężarnej matki lub z klatki piersiowej młodej myszy za pomocą kremu do depilacji. Myszy noworodkowe (P1 - 10) nie wymagają usuwania owłosienia.
4. W przypadku ciężarnych matek należy rozciąć brzuch, używając nożyczek sekcyjnych i pęsety zakrzywionej. Wyciągnij jeden róg macicy i połóż go na gazie zwilżonej ciepłym roztworem soli fizjologicznej. Ostrożnie przesuń embrion do odpowiedniej pozycji, aby uzyskać obraz LV w osi długiej przykleszczowej za pomocą głowicy USG. Zmierz ciśnienie we wszystkich embrionach po tej stronie przed wyciągnięciem drugiego rogu macicy. Utrzymuj wszystkie embriony oraz brzuch matki w stanie wilgotnym, okresowo dodając ciepłą sól fizjologiczną.

3. Pomiar ciśnienia

1. Nanieś uprzednio ogrzany i odgazowany żel ultradźwiękowy na embrionalną lub noworodkową mysz. W przypadku myszy noworodkowych, które nie zostały poddane depilacji, przed nałożeniem pozostałej ilości żelu należy wetrzeć niewielką jego ilość w klatkę piersiową w celu poprawy sprzężenia. Obniż głowicę obrazującą i dostosuj kąt platformy obrazującej, aby uzyskać optymalny widok długiej osi LV w przekroju parasternalnym. Nie należy zmieniać kąta nachylenia głowicy, ponieważ spowoduje to utratę wyrównania igły.
2. Monitorując obraz LV na ekranie ultrasonografu, powoli wysuwaj igłę, aż znajdzie się ona w pobliżu dolnej krawędzi głowicy. W razie potrzeby skoryguj pozycję igły i głowicy, aby naprawić przesunięcia w wyrównaniu. Delikatnie przepłucz igłę solą fizjologiczną. Rozpocznij rejestrację danych o ciśnieniu i wyzeruj przetwornik ciśnienia za pomocą oprogramowania LabChart. Przetwornik dryfuje wraz ze zmianą temperatury i pozycji, dlatego ważne jest jego zerowanie bezpośrednio przed pomiarem ciśnienia u każdej myszy.
3. Powoli wysuwaj igłę, aż stanie się widoczna na krawędzi obrazu USG, ale nie znajdzie się jeszcze w LV. W razie potrzeby skoryguj pozycję igły, aby wprowadzić ją do LV w okolicy wierzchołka. W razie potrzeby dostosuj pozycję głowicy, aby utrzymać wyraźny obraz igły. Wprowadź igłę do światła LV (Rysunek 3), rejestrując jednocześnie dane o ciśnieniu i monitorując położenie igły na obrazie USG. Rozpoczęcie rejestracji pulsacyjnego ciśnienia z przetwornika potwierdza obecność igły w świetle LV (Rysunek 4).
4. Jeśli igła wydaje się znajdować w świetle LV, ale rejestrowane ciśnienie nie jest pulsacyjne, przepłucz ją, lekko uderzając w tłok strzykawki, tylko do momentu wykrycia wzrostu ciśnienia (objętość około 5 - 10 μL). Powinno to usunąć wszelkie zatory, które mogą uniemożliwiać dokładny odczyt. Jeśli odczyty ciśnienia nadal nie są pulsacyjne, igła może znajdować się powyżej lub poniżej właściwej płaszczyzny i nie być wprowadzona do światła LV. Cofnij igłę, przepłucz ją solą fizjologiczną i wysuń ponownie. Jeśli nadal nie uzyskano odczytów pulsacyjnych, przejdź do następnej myszy. Dla każdej myszy należy użyć nowej igły.
5. Prawidłowe odczyty ciśnienia można uzyskać u 75% badanych myszy embrionalnych i noworodkowych. Każdy pomiar powinien trwać od 5 do 10 minut; dane ciśnienia dla danej myszy nie powinny być uwzględnione, jeśli częstość akcji serca różni się znacząco od oczekiwanej (Rysunek 5A). Częstość akcji serca ma istotny wpływ na parametry sercowo-naczyniowe, a zmieniona częstość akcji serca wskazuje na stres kardiologiczny. Stres embrionalny występuje zazwyczaj od 1 do 1,5 godziny po pierwszej eksternalizacji macicy, dlatego szybkość działania jest kluczowa przy pomiarach ciśnienia w całym miocie.

4. Reprezentatywne wyniki

Wszystkie przedstawione wyniki dotyczą myszy C57BL6J. Obraz igły w świetle LV u myszy P1 pokazano na Rysunku 3. Igła jest niezbędna do przebicia ściany klatki piersiowej i uzyskania dostępu do małego światła LV, ale znacznie zwiększa czas odpowiedzi systemu pomiaru ciśnienia. Gdy do systemu ręcznie przyłożono przybliżony skokowy wzrost ciśnienia, czas osiągnięcia 67% maksymalnego ciśnienia wyniósł 0,067 s w przypadku samych przewodów (co najprawdopodobniej wskazuje na rzeczywisty czas przyłożenia skoku ciśnienia), 0,105 s z igłą 25 G oraz 0,529 s z igłą 30 G. Opóźnienie w osiągnięciu maksymalnego ciśnienia jest widoczne na pełnych zapisach przedstawionych na Rysunkach 4A i 4C. Mimo że czas odpowiedzi jest dłuższy przy użyciu igły 30 G, kształt fali jest lepiej zarejestrowany w etapach embrionalnym i wczesnym neonatalnym, ponieważ u myszy częstość akcji serca wzrasta wraz z wiekiem⁵. Pomimo tego ograniczenia, ciśnienie skurczowe można obliczyć przy założeniu, że rzeczywiste rozkurczowe (minimalne) ciśnienie w LV wynosi zero, a skurczowe (maksymalne) ciśnienie w LV jest dwukrotnością średniego ciśnienia w LV wyznaczonego z odczytów w stanie ustalonym (Rysunek 4B i 4D)⁶. Ogólnie przyjmuje się, że skurczowe ciśnienie w LV i ciśnienie tętnicze są sobie równe. Zmierzone częstości akcji serca oraz obliczone ciśnienia w LV dla różnych grup wiekowych między E18 a P14 przedstawiono na Rysunku 5.

Rysunek 1. Zdjęcie przetwornika ciśnienia z dołączonymi trójdrożnymi kurkami, męskimi (M) i żeńskimi (F) złączami luer lock, króćcami do węży, rurkami, strzykawkami i igłą.

Rysunek 2. Zdjęcie układu służącego do wyrównania igły z sondą obrazującą (A). Platforma obrazująca jest obrócona tak, aby wierzchołek LV myszy był skierowany w stronę ramienia do iniekcji. Sonda jest zamontowana w regulowanym statywie w orientacji przybliżonej do tej niezbędnej do uzyskania obrazu LV w osi długiej. Obudowa rurki igły jest zamontowana w ramieniu do iniekcji. Igłę wprowadza się w kopczyk żelu ultradźwiękowego na platformie obrazującej, aby określić właściwy kąt oraz pozycję pionową i poziomą względem sondy obrazującej (B).

Rysunek 3. Obraz igły (N) wprowadzonej przez ścianę klatki piersiowej (CW) do światła LV u myszy P1. Pasek skali = 0.1 mm.

Rysunek 4. Przykładowe odczyty ciśnienia pulsacyjnego podczas wprowadzania igły do LV myszy w stadium E18 (A) i P14 (C). Występuje opóźnienie w osiągnięciu stanu ustalonego ze względu na czas odpowiedzi systemu z podłączoną igłą. Powiększone widoki odczytów w stanie ustalonym przedstawiono w B i D. Należy zauważyć, że minimalne ciśnienia LV dla E18 są bliskie zeru, natomiast pełna fala od zera do ciśnienia maksymalnego nie może zostać zarejestrowana przy wyższym tętnie myszy P14. Średnie ciśnienia są mierzone z odczytów w stanie ustalonym i przyjmuje się, że ciśnienie skurczowe LV = 2 x zmierzone ciśnienie średnie.

Rysunek 5. Zmierzone częstości akcji serca (A) i obliczone ciśnienia skurczowe LV dla myszy w dniach E18 – P14. N = 7 dla E18, 5 dla P1, 22 dla P3, 23 dla P7 i 16 dla P14^5-7.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę pomiaru ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w późnym okresie embrionalnym i wczesnym okresie neonatalnym. Głównym ograniczeniem tego protokołu jest rozdzielczość czasowa systemu pomiarowego. Sygnał ciśnienia ulega tłumieniu podczas przemieszczania się z LV przez igłę do przetwornika, przez co rejestrowane mogą być jedynie średnie wartości ciśnienia. Tłumienie można zminimalizować, stosując możliwie największą igłę, jednak musi ona mieścić się w świetle LV u myszy w różnym wi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System ultradźwiękowy o wysokiej rozdzielczości	VisualSonics, inc.	Vevo 770	Lub inny odpowiedni system ultradźwiękowy
Wysokoczęstotliwościowe głowice ultradźwiękowe	VisualSonics, inc.	708 i 707B
Platforma obrazowania i ramię do iniekcji	VisualSonics, inc.	Imaging Station 2	Z EKG i sprzężeniem zwrotnym temperatury platformy
Przetwornik ciśnienia	ADInstruments	MLT 844
Wzmacniacz mostkowy	ADInstruments	ML221
System akwizycji danych	ADInstruments	ML866
Oprogramowanie do rejestracji danych	ADInstruments	LabChart
Statyw z obejmą	Różni		Do utrzymania przetwornika ciśnienia podczas pomiarów
Trójdrożne kurki z połączeniami luer, blokada męska	Cole-Parmer	30600-02
Przewody Tygon o wewnętrznej średnicy 1/16"	Cole-Parmer	06408
Złącza luer męskie i żeńskie z kolcem 1/16"	Cole-Parmer	45510-50 45510-00
Przewód 24" z łączem luer męskim i żeńskim na każdym końcu	Cole-Parmer	30600-60
Strzykawki 3 i 10 mL	BD Biosciences
Igły 30 i 25G	BD Biosciences		Długość 1,5 cala
Manometr Big Ben	Riester	1456-100
Sól fizjologiczna	Różni
Heparyna	Różni
Żel do USG	Parker Hannifin Corporation	Aquasonic 100
Krem do depilacji	Nair