Artykuł metodologiczny

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

16K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3757

⸱

8 marca 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, New York University Langone School of Medicine, 2Program in Molecular Pathogenesis, Marty and Helen Kimmel Center for Biology and Medicine and Skirball Institute for Biomolecular Medicine, 3Laboratory of Molecular Immunogenetics, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Veteran Affairs New York Harbor Healthcare System

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Streszczenie

Zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) zachodzi najefektywniej poprzez transmisję z komórki do komórki2,10,11. Ten transfer z komórki do komórki pomiędzy limfocytami T CD4+ wiąże się z tworzeniem synapsy wirogicznej (VS), która jest zależnym od F-aktyny połączeniem międzykomórkowym, powstającym w wyniku oddziaływania białka otoczki gp120 HIV-1 na zainfekowanej komórce z cząsteczką CD4 oraz receptorem chemokin (CKR) CCR5 lub CXCR4 na komórce docelowej 8. Oprócz gp120 i jego receptorów, istotną rolę w tworzeniu VS i transmisji wirusa odgrywają inne białka błonowe, w szczególności cząsteczka adhezyjna LFA-1 i jej ligandy z rodziny ICAM, ponieważ występują one na powierzchni zainfekowanych wirusem komórek dawców i komórek docelowych, a także na otoczce wirionów HIV-11,4,5,6,7,13. Tworzeniu VS towarzyszą również wewnątrzkomórkowe zdarzenia sygnalizacyjne, które są indukowane w wyniku wiązania gp120 z jego receptorami. Rzeczywiście, wykazaliśmy niedawno, że interakcja limfocytów T CD4+ z gp120 indukuje rekrutację i fosforylację cząsteczek sygnałowych związanych z sygnalosomem TCR, w tym Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk i PLCγ15.

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wizualizacji nadorganizacji supramolekularnej oraz zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących w pobliżu błony podczas formowania się VS. Wykorzystujemy system planarnej dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym jako redukcjonistyczny model reprezentujący powierzchnię zainfekowanych HIV komórek, zawierającą wirusową kopertę gp120 oraz cząsteczkę adhezyjną komórki ICAM-1. Protokół opisuje ogólne procedury monitorowania montażu VS indukowanego przez HIV-1 gp120 oraz zdarzeń aktywacji sygnałowej, które obejmują: i) przygotowanie i montaż dwuwarstwy w komorze przepływowej, ii) wtryskiwanie komórek i barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnalizacyjnych w komórkach oddziałujących z HIV-1 gp120 i ICAM-1 na dwuwarstwach, iii) akwizycję obrazów za pomocą mikroskopii TIRF oraz iv) analizę danych. System ten pozwala na generowanie obrazów interfejsu VS o wysokiej rozdzielczości, przewyższającej tę uzyskiwaną w konwencjonalnym systemie komórka-komórka, ponieważ umożliwia wykrycie odrębnych klastrów pojedynczych komponentów molekularnych VS wraz ze specyficznymi cząsteczkami sygnalizacyjnymi rekrutowanymi do tych subdomen.

Protokół

1. Znakowanie GP120

Barwniki fluorescencyjne użyte w tym protokole skutecznie wiążą się z białkami, są wystarczająco fotostabilne do obrazowania mikroskopowego i odpowiadają długościom fal wzbudzenia laserów dostępnych w naszym mikroskopie. Te trzy kryteria muszą zostać spełnione podczas wyboru cząsteczek fluorescencyjnych do znakowania białek.

  1. Wymień bufor białka gp120 DH12 z etykietą His6 (prezent od dr. Michaela Cho z Iowa State University) na sterylny PBS, używając jednostki filtra wirowego (30 kDa MWCO). Upewnij się, że stężenie gp120 nie przekracza 1 mg/ml. Uwaga: Przetestowano również białka gp120 z etykietą His6 z innych szczepów tropizmu X4 lub R5, które są obecnie dostępne komercyjnie w Immune Technologies.
  2. Dodaj wodorowęglan sodu o pH 9,0 do roztworu białka, aby uzyskać końcowe stężenie wodorowęglanu sodu 50mM przy pH ~8,5.
  3. Dodaj reaktywny wobec amin barwnik fluorescencyjny Alexa Fluor 488 (AF488) rozpuszczony w wodzie w 10-krotnym nadmiarze molowym. Inkubuj tę mieszaninę przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Aby usunąć nadmiar barwnika, użyj jednostki filtra wirowego jak poprzednio i dodaj do kolumny świeży sterylny PBS. Powtarzaj ten krok, aż do usunięcia całego wolnego barwnika (3-4 przemycia 4 ml PBS). Wirować do momentu, aż gp120 zostanie skoncentrowane do ok. 1 mg/ml. Uwaga: Usuwanie wolnego barwnika za pomocą dializy lub jednostki filtra wirowego działa tylko wtedy, gdy barwnik jest rozpuszczalny w wodzie; w przeciwnym razie można zastosować filtrację żelową.
  5. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji na cząsteczkę białka (F/P) znakowanego białka, wyznacz stężenia (w μM) barwnika fluorescencyjnego przy odpowiedniej długości fali (na przykład 488 nm dla AlexaFluor 488) oraz białka (używamy spektrofotometru NanoDrop z ustawieniem „proteins and labels”), a następnie podziel te dwie wartości, aby otrzymać stosunek F/P. Tę samą procedurę stosuje się dla innych białek i barwników, takich jak ICAM-1 i Cy5. Uwaga: Jeśli NanoDrop jest niedostępny, do wyznaczenia stężenia białka i stężenia barwnika fluorescencyjnego w celu obliczenia stosunku F/P można użyć innych typów spektrofotometrów.

2. Montaż komory przepływowej i przygotowanie dwuwarstwy

Ogólna procedura przygotowania celi przepływowej i dwuwarstwy została wcześniej opisana szczegółowo14. Poniżej przedstawiamy konkretny protokół przygotowania dwuwarstw zawierających białko gp120 DH12 z etykietą His6 w celi przepływowej Bioptech. W badaniach z wykorzystaniem wirusów zakaźnych lub zakażonych komórek, a także w sytuacjach, gdy ze względu na ograniczoną ilość odczynników wymagane są małe objętości, można zastosować jednorazową komorę przepływową Ibidi (sticky Slide I 0.2 Luer), a następnie przeprowadzić tę samą procedurę przygotowania dwuwarstwy opisaną w krokach 2.4-2.9. Informacje na temat komór przepływowych Ibidi można uzyskać na stronie internetowej firmy: http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf.

  1. Przygotować roztwór Pirhana (45 ml kwasu siarkowego (Trace Metal Grade 98%) i 15 ml 30% nadtlenku wodoru) 14. Za pomocą plastikowych zacisków zanurzyć szkiełka nakrywki w roztworze Pirhana na 15 minut.
  2. Przenieść szkiełka nakrywki do zlewki wypełnionej wodą oczyszczoną metodą pica i myć każde z nich pod bieżącą wodą przez 2 min (po jednej minucie na każdą stronę). Umieścić na statywie do wyschnięcia.
  3. Złożyć komory Bioptechs FCSII zgodnie z wcześniejszym opisem14.
  4. Do przechwytywania i prezentowania His6-gp120 na powierzchni dwuwarstwy wykorzystuje się mieszaninę liposomów zawierającą 12,5% lipidów chelatujących Ni2+16. Nanieść krople 1 μl mieszaniny liposomów na szkiełko z mikroakweduktem, nie dotykając końcówką szkła. Aby przygotować maksymalnie 5 dwuwarstw na jedną komorę przepływową, powtórzyć czynność do 4 kolejnych razy, tak aby uzyskać pięć kropli po 1 μl, zgodnie z wcześniejszym opisem14.
  5. Umieścić szkiełko nakrywkę na lipidach. Przykryć biały pierścień mocujący podstawą zacisku ze stali nierdzewnej, odwrócić całe urządzenie i uszczelnić. Zaznaczyć położenie dwuwarstw markerem. Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  6. Podłączyć rurkę z dwudrożnym kurkiem do lewej rurki perfuzyjnej, zgodnie z instrukcją w filmie. Stworzyć pozytywny menisk na końcu rurki za pomocą zamontowanego na niej kurka trójdrożnego (rurka została wcześniej wypełniona solą buforową HEPES (HBS) zawierającą albuminę ludzką (HSA) (HBS/HSA: 50 ml 10x HBS [10x sól buforowa HEPES: 200 mM HEPES, pH 7,2, 1,37 M NaCl, 50 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 60 mM D-glukozy], 20 ml 25x HSA, 500 μl 1M CaCl2, 1 ml 1 M MgCl2 i dH2O do uzyskania objętości końcowej 500 ml, a następnie przefiltrować przez filtr 0,22 μm) i jest wolna od pęcherzyków powietrza). Połączyć rurkę z prawą rurką perfuzyjną i delikatnie przepchnąć bufor przez komorę przepływową.
  7. Zablokować dwuwarstwę za pomocą ~300 μl kazeiny zawierającej 100 μM NiCl2, napełniając strzykawkę 1 ml i mocując ją do otwartej części kurka trójdrożnego. Delikatnie przepchnąć bufor i zamknąć oba kurki przed odłączeniem strzykawki. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  8. Dodać gp120 znakowane AF488 z etykietą His6 (stężenie określono zgodnie z wcześniejszym opisem w16). Używamy ~250 cząsteczek gp120/μm2, aby naśladować lokalną gęstość klastrów Env występujących na powierzchni wirionu HIV-117. Podobnie, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami 14, stosujemy ~250 cząsteczek/μm2 ICAM-1 na dwuwarstwie. Wprowadzić do komory przepływowej w taki sam sposób jak w przypadku kazeiny. Inkubować przez 30 min w ciemności (przykryć folią) w temperaturze pokojowej. Tę samą procedurę stosuje się do wbudowania w dwuwarstwę innych białek, takich jak ICAM-1 znakowane Cy5 z etykietą His12.
  9. Przemyć dwuwarstwy 5 ml buforu.

3. Kontrola jakości dwuwarstw za pomocą FRAP

Białka w dwuwarstwach muszą wykazywać dyfuzję boczną. Przed naniesieniem komórek na dwuwarstwy ważne jest upewnienie się co do mobilności białek w przygotowanej dwuwarstwie. Opisujemy tutaj metodę FRAP (Fluorescent Recovery After Photobleaching – fluorescencyjny powrót po fotowybielaniu)3, którą można przeprowadzić ręcznie na większości mikroskopów TIRF z oświetleniem przez obiektyw, mikroskopów epifluorescencyjnych w polu szerokim lub konfokalnych mikroskopach skaningowych. Celem jest obrazowanie w pełni jednolitych pól fluorescencji w dwuwarstwie lipidowej, wybielenie punktu oraz monitorowanie powrotu niezwybielonych cząsteczek do obszaru wybielonego. Odzyskanie sygnału na poziomie 50% w ciągu 2 minut może być uznane za akceptowalne. Wszyscy główni producenci mikroskopów (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) oferują systemy TIRF z oświetleniem przez obiektyw, które sprawdzają się w tej aplikacji. Mimo że każda firma oferuje inne warianty oświetlenia TIRF i inne funkcje operacyjne, jakość obrazu jest w zasadzie taka sama.

  1. Stosuj niską intensywność wzbudzenia, aby zminimalizować blaknięcie. Używaj obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej, np. N.A. 1,3 do 1,45 40x, 60x lub 100x. Przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego lub TIRF, aby zmniejszyć intensywność światła, umieść filtry neutralnej gęstości w torze światła wzbudzenia. Większość systemów laserowych można ustawić na niskie natężenie oświetlenia poprzez ustawienie akusto-optycznego filtra strojonego (AOTF) lub akusto-optycznego dzielnika wiązki (AOBS) na niskie napięcie.
  2. Nagraj obraz „przed blaknięciem” (pre-bleach). W przypadku użycia chłodzonej kamery CCD, aby zrekompensować słabe warunki oświetleniowe, można ustawić binning na 2x2 lub 4x4, wysokie wzmocnienie (gain) lub zastosować długie czasy ekspozycji (na przykład rzędu sekund). W przypadku mikroskopu konfokalnego można otworzyć aperturę otworu (pinhole), ustawić wysokie wzmocnienie oraz zastosować powolne skanowanie lub uśrednianie.
  3. Wybiel punkt (bleach a spot). Jeśli używasz standardowego mikroskopu fluorescencyjnego lub TIRF, usuń wszystkie filtry ND, aby umożliwić oświetlenie o maksymalnej intensywności, przymknij przysłonę pola i naświetl próbkę przez kilka sekund. W przypadku konfokalnego mikroskopu skaningowego ustaw maksymalną moc lasera i powiększenie około 4x do 8x, aby wybielić punkt. Ostrzeżenie przy użyciu mikroskopu konfokalnego: nie stosuj zbyt dużego powiększenia, ponieważ warstwa dwuwarstwowa może zostać uszkodzona przez nadmiernie skoncentrowane fotony.
  4. W odstępach od dziesięciu do piętnastu sekund rejestruj obrazy, stosując te same ustawienia oświetlenia i rejestracji, co w punktach 3.1 i 3.2. W ciągu dwóch do trzech minut intensywność w punkcie powinna powrócić do wartości zbliżonej do obrazu „przed blaknięciem”. Szybka regeneracja jest oznaką prawidłowo funkcjonującej, mobilnej dwuwarstwy. Jeśli punkt pozostaje ciemny, a w szczególności jeśli krawędź zachowuje wysoki kontrast, oznacza to, że białka fluorescencyjne są nieruchome w dwuwarstwie i nie powinny być używane w eksperymencie.

Uwaga: W naszym obecnym mikroskopie możemy dostarczyć 0,9 mW światła o długości fali 641 nm do okrągłego punktu o powierzchni 240 μm2, co powoduje wybielenie fluorescencyjnego ICAM w typowych stężeniach w czasie krótszym niż 4 sekundy. Czytelnicy powinni stwierdzić, że precyzyjne ustawienie lampy Hg lub Xe z czasem wybielania krótszym niż 30 sekund jest w zupełności wystarczające do powtarzalnego przeprowadzenia tego testu. Dodatkowych szczegółów można znaleźć w odniesieniu3.

4. Iniekcja komórek i barwienie immunofluorescencyjne

  1. Podgrzać komorkę przepływową do 37 °C (można to zrobić w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez CO2 przez około 30 min).
  2. Dodać aktywowane ludzkie limfocyty T CD4+ (2-5x106/komorkę przepływową) w ~400 μl HBS/HSA za pomocą strzykawki 1 ml. Pozostawić komórki do przywierania do warstwy lipidowej przez ~45 min w inkubatorze w 37 °C. W przypadku użycia komór Ibidi należy co 15-20 min dostarczać dodatkowy bufor.
  3. Utrwalić komórki poprzez wstrzyknięcie 2% paraformaldehydu i inkubować przez 10 min w 37°C.
  4. Przemyć 3x 1 ml buforu PBS w temperaturze pokojowej. Permeabilizować komórki, wstrzykując 0,1% Triton X-100 na 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć 3x 1 ml buforu PBS w temperaturze pokojowej (podczas wykrywania białek fosforylowanych można dodać wanadan sodu w końcowym stężeniu 1mM lub inny inhibitor fosfatazy w PBS, aby zapobiec usuwaniu grup fosforanowych podczas obróbki). Zablokować używając kazeiny z 5% surowicą kozą przez 25 min w temperaturze pokojowej. Rodzaj surowicy zwierzęcej zależy od przeciwciała wtórnego.
  6. Przemyć 3x 1 ml buforu PBS w temperaturze pokojowej. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe w ~300 μl buforu/komorkę przepływową na 30 min - 1 h w temperaturze pokojowej. Aby wykryć początkowy sygnał aktywacji proksymalnej względem błony, stosujemy przeciwciała specyficzne dla fosforylowanego Lck (pLck), całkowitego Lck lub Fyn.
  7. Przemyć 3x 1 ml buforu PBS w temperaturze pokojowej. Dodać odpowiednie znakowane fluorescencyjnie przeciwciało wtórne w buforze w taki sam sposób jak w przypadku przeciwciała pierwszorzędowego. W naszych eksperymentach stosujemy kozie przeciwciało antykrólicze wtórne znakowane Alexa Fluor 568. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej. Przemyć 3x 1 ml buforu PBS.
  8. Uwaga: Niezbędne jest posiadanie kontrolnej warstwy lipidowej traktowanej wyłącznie przeciwciałem wtórnym (bez przeciwciała pierwszorzędowego). Należy wykonać kroki 4.1-4.5, pominąć krok 4.6, a następnie przejść do kroku 4.7. Pozwoli to określić poziom niespecyficznego wiązania przeciwciała wtórnego. Alternatywnie można zastosować bezpośrednio znakowane przeciwciała pierwszorzędowe.

5. Pozyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopii TIRF

Mikroskopia TIRF umożliwia wzbudzenie sygnałów fluorescencyjnych ograniczonych do płaszczyzny o grubości 250 nm lub cieńszej na styku szklanego podłoża i komórki. Gwarantuje to obrazowanie wyłącznie sygnałów pochodzących z dwuwarstwy lipidowej oraz z bezpośrednio przylegających błon komórkowych. W związku z tym obrazowane są tylko cząsteczki znajdujące się w synapsie. Ponieważ metoda TIRF obrazuje jedynie obszar proksymalny względem błony na dnie komórki, białka zinternalizowane lub redystrybuowane do błony grzbietowej nie zostaną wykryte. Może zatem być istotne dodatkowe wykonanie obrazów za pomocą standardowej mikroskopii szerokopolowej lub konfokalnej, aby określić akumulację lub rozkład białek w obszarze synaptycznym w porównaniu z innymi objętościami komórki.

Wszyscy główni producenci mikroskopów (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) oferują systemy TIRF z oświetleniem przez obiektyw, które sprawdzają się w tej aplikacji. Choć każda firma zapewnia różne warianty oświetlenia TIRF i inne funkcje operacyjne, jakość obrazu jest w zasadzie taka sama. Każdy mikroskop TIRF posiada własną specyfikę obsługi, jednak w celu uzyskania obrazowania o wysokiej rozdzielczości obowiązują następujące ogólne zasady.

  • Oświetlenie powinno być słabe, aby uniknąć fotowyblaknięcia.
  • Kamera powinna charakteryzować się liniową odpowiedzią.
  • Kamera powinna umożliwiać obrazowanie szerokiego zakresu dynamicznego bez nasycenia.
  • Wszystkie ustawienia powinny pozostać stałe w celu przeprowadzenia analiz ilościowych.

6. Analiza danych

Aby zbadać sygnały wewnątrzkomórkowe aktywowane w wyniku oddziaływania komórek T CD4+ z gp120 w obrębie VS, przeprowadzono ilościowe analizy obrazów TIRF w celu ustalenia, czy wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe, takie jak Lck i Fyn, są aktywowane i rekrutowane do synapsy 15. Przedstawiamy tutaj prostą metodę, którą można zastosować w większości pakietów do analizy obrazów, takich jak ImageJ i Metamorph. W opisanej metodzie wykorzystaliśmy program ImageJ, który działa w systemach Windows, Macintosh i Linux 12.

W karcie Analyze > Set Measurements zaznacz pola Area oraz Mean gray value. Po wyznaczeniu na obrazie obszaru zainteresowania w formie wielokąta lub zamkniętego kształtu narysowanego odręcznie i wybraniu Analyze > Measure, oprogramowanie wprowadzi dane z tego pomiaru do tabeli wyników. Wartość Area będzie podana w liczbie pikseli lub w μm2. Wartość Mean to średnia intensywność w jednostkach arbitralnych; należy od niej odjąć intensywność tła. Pomnożenie różnicy między średnią a tłem przez powierzchnię pozwala obliczyć całkowitą intensywność białka w jednostkach arbitralnych.

  1. Ustaw pomiary na Mean (średnia) oraz Area (pole powierzchni).
  2. Otwórz obrazy dla jednego warunku eksperymentalnego.
  3. Dla każdej komórki obrysuj i zmierz obszar zainteresowania (mean) oraz obrysuj i zmierz obszar poza obszarem zainteresowania (background).
  4. Po zakończeniu pracy z jednym warunkiem eksperymentalnym skopiuj pomiary i wklej je do programu Excel lub innego programu arkuszowego albo zapisz pomiary.
  5. Powtórz krok 6.2 dla każdego warunku eksperymentalnego.
  6. Po zakończeniu pomiarów oblicz wyniki. Wzory to:
    Average intensity = mean - background
    Integrated intensity = Average intensity * area

7. Reprezentatywne wyniki

Aby zmierzyć aktywację i rekrutację początkowych cząsteczek sygnalizacyjnych położonych blisko błony, Lck i Fyn, w wyniku oddziaływania z gp120 w obrębie VS, pierwotne ludzkie limfocyty T CD4+ wprowadzono na dwuwarstwy zawierające gp120 i ICAM-1 15. Komórki wprowadzone na dwuwarstwy zawierające tylko ICAM-1 posłużyły jako kontrola do określenia podstawowych poziomów sygnalizacji. Specyficzną intensywność fluorescencji mierzono w obszarze kontaktu z gp120 dla komórek na dwuwarstwach zawierających gp120 i ICAM-1 oraz w całym obszarze kontaktu dla komórek oddziałujących z dwuwarstwą ICAM-1. Wzrost średniej intensywności fluorescencji jest oznaką zwiększonej rekrutacji i aktywacji cząsteczki sygnalizacyjnej w VS. Zostanie to dodatkowo wykazane poprzez porównywalny wzrost całkowitej intensywności fluorescencji. Jeśli jednak całkowita intensywność fluorescencji nie ulegnie zmianie, wskazuje to na redystrybucję cząsteczki sygnalizacyjnej.

Po interakcji komórek z dwuwarstwami zawierającymi gp120 i ICAM-1, całkowity Lck oraz pLck(Y394) zostały zrekrutowane do interfejsu VS i kolokalizowały z gp120 (Ryc. 1 i 2). Średnia intensywność całkowitego Lck (Ryc. 1) była wyższa na dwuwarstwie zawierającej zarówno gp120, jak i ICAM-1 niż na dwuwarstwie z samym ICAM-1, jednak poziomy intensywności zintegrowanej (Ryc. 1) były podobne, co sugeruje, że Lck ulega redystrybucji do centralnego klastra po związaniu komórek T CD4+ z gp120. Jednakże ilościowe oznaczenie pLck(Y394) (Ryc. 2) wykazało, że średnia intensywność na dwuwarstwach zawierających gp120 i ICAM-1 była wyższa niż na dwuwarstwach z samym ICAM-1, a intensywność zintegrowana była wyższa na dwuwarstwach z gp120 i ICAM-1 niż na dwuwarstwach z samym ICAM-1. Wskazuje to, że mimo podobnych poziomów całkowitego Lck w interfejsie komórek przylegających do dwuwarstw z gp120 i ICAM-1 oraz dwuwarstw z samym ICAM-1, wiązanie gp120 zwiększyło fosforylację reszty Y394 w pętli aktywacyjnej Lck. W przeciwieństwie do tego, Fyn nie został zrekrutowany do VS (Ryc. 3), ponieważ w obszarze kontaktu komórek na dwuwarstwach z samym ICAM-1 obecna była większa ilość Fyn niż na dwuwarstwach zawierających zarówno gp120, jak i ICAM-1. W konsekwencji wyciągnęliśmy wniosek, że aktywną kinazą w VS indukowanym przez HIV-1 gp120 jest Lck, a nie Fyn.

Ryciny: Sygnalizacja proksymalna względem błony w VS indukowanych przez gp120 HIV-1. Przedstawiono obrazy reprezentatywnych komórek na dwuwarstwie gp120+ICAM-1 (panele górne) oraz na dwuwarstwie ICAM-1 (panele dolne). Intensywności fluorescencji poszczególnych komórek ilościowo określono w obrębie ręcznie obrysowanych obszarów śladów komórek, zgodnie z regionem zaznaczonym żółtą linią na Ryc. 1. Ilościowe oznaczenia średnich i zintegrowanych intensywności wykrytych za pomocą mikroskopii TIRF przedstawiono odpowiednio na lewym i prawym wykresie. W każdym wariancie analizie poddano od 30 do 350 komórek. Paski skali = 5 μm. Przedstawiono dane z jednego z trzech powtórzonych eksperymentów.

Kolokalizacja gp120 i ICAM-1 z całkowitym Lck na obrazach mikroskopowych oraz wykresy intensywności do analizy.
Rysunek 1. Komórki T CD4+ wprowadzono na dwuwarstwy zawierające gp120 i ICAM-1 lub sam ICAM-1 na 45 min, a następnie utrwalono i zabarwiono w kierunku całkowitego Lck.

kolokalizacja gp120 i ICAM-1 w komórkach; mikroskopia fluorescencyjna; analiza pLck(Y394); wykres.
Rycina 2. Komórki T CD4+ naniesiono na warstwy dwuwarstwowe zawierające gp120 i ICAM-1 lub sam ICAM-1 na 45 min, a następnie utrwalono i poddano barwieniu na pLck(Y394).

kolokalizacja gp120 i ICAM-1; immunofluorescencja, wykres intensywności, analiza statystyczna.
Rysunek 3. Komórki T CD4+ naniesiono na dwuwarstwy zawierające gp120 i ICAM-1 lub sam ICAM-1 na 45 min, a następnie utrwalono i zabarwiono na całkowitą ilość białka Fyn.

Dyskusja

Poprzednie badania pozwoliły na wizualizację VS w systemie koniugatów komórka-komórka; jednak badania te nie dostarczyły obrazów o wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby zwizualizować struktury supramolekularne w synapsie. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy system płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym do reprezentacji powierzchni zainfekowanych komórek wykazujących ekspresję białka otoczki wirusa gp120 oraz cząsteczki adhezyjnej komórki ICAM-1. Dzięki zastosowaniu mikroskopii TIRF, która wykrywa sygnały fluorescencyjne w odległości 100-200 nm od powierzchni dwuwarstwy z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, byliśmy w stanie wykryć supramolekularną segregację gp120 od ICAM-1 w obrębie VS. Ponadto standardowa metoda immunobarwienia może być zastosowana w systemie dwuwarstwowym i została tutaj wykorzystana do wykrycia i ilościowego oznaczenia specyficznej rekrutacji aktywnego białka Lck, ale nie Fyn, do obszaru kontaktu z gp120 w VS 15. Zatem płaska dwuwarstwa stanowi system eksperymentalny do obrazowania interfejsu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości w płaszczyźnie 2D za pomocą mikroskopii TIRF, a także metod oświetlenia szerokopolowego lub konfokalnego. System ten posiada jednak ograniczenia, ponieważ płaskie dwuwarstwy nie oddają regulacji mobilności ligandów, zgięć poza płaszczyzną oraz fluktuacji błon biologicznych. Ponadto jest to system in-vitro, co wiąże się z innymi ograniczeniami, takimi jak brak pozostałych cząsteczek błonowych, które występowałyby w zainfekowanej komórce, oraz brak aparatu cytoszkieletowego regulującego mobilność molekularną i ruchliwość komórkową. Również dynamika i rozmieszczenie cząsteczek, takich jak trimery w przeciwieństwie do monomerów gp120, mogą nie być reprezentowane na dwuwarstwie w sposób fizjologiczny. Niemniej jednak, mimo tych ograniczeń, system ten jest nadal bardzo wartościowy w badaniu oddziaływań wirus-komórka lub komórka-komórka, a opisane metody mogą służyć jako przydatny przewodnik dla badaczy poszukujących obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia organizacji supramolekularnej, która nie jest dostrzegalna w konwencjonalnym systemie koniugatów komórka-komórka.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów NIH AI071815 (C.E.H.) oraz z funduszy przyznanych przez Roadmap Nanomedicine Development Center PN2EY016586 (M.L.D.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HIV gp120 z tagiem HisPrezent od dr ChoDH12
HIV gp120 z oczkiem HisTechnologia immunologicznaRóżne tropizmy X4 lub R5
HSA (albumina ludzka)Williams Medical Company521302Albumina ludzka 25%
Wirówki odśrodkowe Amicon UltraEMD MilliporeUFC803024Ultracel-30K
przeciwciało królika mAb przeciwko LckTechnologia sygnalizacji komórkowej2787
p-Lck królicze pAbSanta Cruz Biotechnology, Inc.Sc-101728Tyr 394
przeciwciało królika mAb przeciwko FynEMD Millipore04-353
Alexa Fluor 568 2° AbSondy molekularne, Life TechnologiesA11034przeciwciało kozie przeciwko IgG królika (H+L)
Alexa Fluor 488Molecular Probes, Life TechnologiesA-20000estrym sukkunimidylowym kwasu karboksylowego
Komora FCS2Bioptechs060319-2-03
Przesuwnik mikroakweduktuBioptechs130119-5
Okrągły 30 mm z otworamiBioptechs1907-08-750o grubości 0,75 mm
Uszczelka prostokątnaBioptechs1907-1422-25014x24 o grubości 0,25 mm
Przewody TygonBioptechs202022751/16" (25 stóp)
Kurek trójdrożnyBio-Rad7328103
Kurek trójdrożnyBio-Rad7328102
Przesuwnik przylepny I 0.2 LuerIbidi80168
Szkiełka nakrywkoweIbidi10812
strzykawka 1 mlBD Biosciences309659
DOGS-NTAAvanti Polar Lipid, Inc790404C
DOPCAvanti Polar Lipid, Inc850375C
Kapturek szklanyBioptechs40-1313-031940 mm
Mikroskop TIRFNikon Instruments
ImageJNational Institutes of Healthhttp://rsbweb.nih.gov/ij/

Bibliografia

  1. Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions. J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).
  2. Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics. J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).
  3. Dustin, M. L. Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58. J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).
  4. Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
  5. Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1. Aids. 10, 1611-1620 (1996).
  6. Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).
  7. Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission. J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).
  8. Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).
  9. Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).
  10. McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus. J. Virol. , 682898-682905 (1994).
  12. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).
  13. Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization. J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).
  14. Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
  15. Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse. J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).
  16. Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells. J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).
  17. Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. Nature. 441, 847-852 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia TIRFdwuwarstwa lipidowalimfocyty T CD4rekrutacja LCKbarwienie immunofluorescencyjnemonta komory przep ywowejwi zanie gp120oddzia ywanie z ICAM 1
Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.