Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choć ogromne wysiłki poświęcono identyfikacji szlaków sygnalizacyjnych i cząsteczek zaangażowanych w prawidłowe i nowotworowe zachowania komórek1-2, znaczna część tych prac została przeprowadzona z wykorzystaniem klasycznych dwuwymiarowych modeli hodowli komórkowych, które umożliwiają łatwą manipulację komórkami. Stało się jasne, że wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne są pod wpływem sił zewnątrzkomórkowych, w tym wymiarowości i napięcia powierzchniowego komórek3-4. Zastosowano wiele podejść w celu opracowania modeli trójwymiarowych, które dokładniej odzwierciedlają architekturę tkanki biologicznej3. Mimo że modele te uwzględniają wielowymiarowość i naprężenia architektoniczne, badanie wynikających z nich efektów w komórkach jest mniej łatwe niż w dwuwymiarowej hodowli tkankowej ze względu na ograniczenia modeli oraz trudności w izolowaniu komórek do późniejszych analiz.
Coraz powszechniej uznaje się istotną rolę mikrośrodowiska wokół guzów w procesie tumorigennezy i zachowaniu nowotworu4. Zręb guza składa się z wielu typów komórek oraz cząsteczek zewnątrzkomórkowych. W trakcie rozwoju guza zachodzi dwukierunkowa sygnalizacja między komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu5. Choć zidentyfikowano niektóre czynniki uczestniczące w koewolucji guza i zrębu, wciąż istnieje potrzeba opracowania prostych technik do systematycznej identyfikacji i badania pełnego spektrum tych sygnałów6. Fibroblasty są najliczniejszym typem komórek w prawidłowych tkankach zrębowych lub tkankach zrębowych związanych z nowotworem i przyczyniają się do odkładania oraz utrzymania błony podstawnej i czynników wzrostu działających w sposób parakrynny7.
Wiele grup badawczych wykorzystywa trójwymiarowe systemy hodowli do badania roli fibroblastów w różnych funkcjach komórkowych, w tym w odpowiedzi nowotworu na terapie, rekrutacji komórek odpornościowych, działaniu cząsteczek sygnałowych, proliferacji, apoptozie, angiogenezie i inwazji8-15. Zoptymalizowaliśmy prostą metodę oceny wpływu fibroblastów gruczołu piersiowego na komórki nabłonkowe gruczołu piersiowego, wykorzystując dostępny komercyjnie model macierzy zewnątrzkomórkowej do tworzenia trójwymiarowych hodowli mieszanych populacji komórek (ko-kultur)16-22. Wraz z przebiegiem ko-kultury komórki tworzą sferoidy, w których fibroblasty skupiają się wewnątrz, a komórki nabłonkowe znajdują się głównie na zewnątrz sferoidów, tworząc wielokomórkowe wypustki w macierzy. Manipulacje fibroblastami prowadzące do zmiany inwazyjności komórek nabłonkowych można łatwo ilościowo ocenić poprzez zmiany w liczbie i długości wypustek nabłonkowych23. Ponadto opracowaliśmy metodę izolacji komórek nabłonkowych z trójwymiarowej ko-kultury, co ułatwia analizę wpływu kontaktu z fibroblastami na zachowanie komórek nabłonkowych. Stwierdziliśmy, że efekty ko-kultury utrzymują się przez wiele tygodni po izolacji komórek nabłonkowych, co zapewnia wystarczającą ilość czasu na przeprowadzenie wielu testów. Metoda ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Technika ta pozwala na szybką ocenę in vitro modeli komórkowych w wielu warunkach, a uzyskane wyniki można porównać z modelami tkankowymi zwierząt in vivo oraz z ludzkimi próbkami tkanek.
Protokół
1. Tworzenie trójwymiarowych kokultur
- Dzień przed utworzeniem kokultur wyjmij Matrigel z zamrażarki i rozmroź na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
- W dniu eksperymentu przygotuj pożywkę do kokultury, która odpowiada pożywce stosowanej dla komórek nabłonkowych (w tym przykładzie pożywka HMEC: pożywka DME/F12 z dodatkiem 10% serum cielęcego, 5 μg/mL insuliny, 1 μg/mL hydrokortyzonu i 1 ng/mL EGF). Przechowuj pożywkę na lodzie przez co najmniej 1 godzinę przed zmieszaniem z Matrigelem.
- Aby rozcieńczyć rozmrożony Matrigel, określ całkowitą pożądaną ilość mieszaniny Matrigel:pożywka (300 μL na studzienkę dla płytek 24-dołkowych) i dodaj połowę tej objętości schłodzonej pożywki HMEC do sterylnej probówki na lodzie. Następnie dodaj do probówki taką samą połowę całkowitej objętości rozmrożonego Matrigelu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1. Przechowuj probówkę na lodzie.
- Nanieś 50 μL mieszaniny Matrigel:pożywka na środek wyznaczonych studzienek na płytce 24-dołkowej i inkubuj przez 10 min w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżonym powietrzem i 5% CO2.
- Dodaj do studzienek kolejne 450 μL mieszaniny Matrigel:pożywka i inkubuj przez kolejne 60 minut.
- Podczas inkubacji przygotuj zawiesinę 1:1 fibroblastów (tutaj h-TERT-unieśmiertelnione fibroblasty gruczołu piersiowego redukcyjnego wykazujące ekspresję GFP) i komórek nabłonkowych (tutaj h-TERT-unieśmiertelniona linia ludzkich komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego wykazująca ekspresję RFP) w stężeniu 0,5 x 105 każdych komórek w 0,5 ml pożywki HMEC.
- Po 60-minutowym etapie inkubacji ostrożnie nanieś zawiesinę komórkową na powierzchnię zestalonego żelu i przenieś kulturę z powrotem do inkubatora.
- Nie zakłócaj kultur przez 2 dni. Po tym czasie pożywkę można wymieniać co 2-3 dni, bardzo ostrożnie aspirując ją z boku studzienki i delikatnie zastępując świeżą pożywką HMEC.
- Codziennie monitoruj tworzenie sferoidów pod mikroskopem. Kultury są zazwyczaj dojrzałe po 10-14 dniach. Wykonaj odpowiednie obrazy za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Rozmiar sferoidów oraz długość wypustek można zmierzyć pod mikroskopem świetlnym.
2. Izolacja komórek z kokultur sferoidów
- Bardzo delikatnie pipetuj kulturę w górę i w dół 10 razy, używając sterylnej szklanej pipety 2-mL. Alternatywnie, aby pipetować kulturę, można odciąć końcówkę plastikowego tipa do pipety 1000 µl za pomocą nożyczek wysterylizowanych w autoklawie lub poprzez zanurzenie w 70% etanolu. Przenieś kulturę za pomocą szklanej pipety lub odciętego plastikowego tipa do sterylnej probówki wirówkowej 15 ml i wiruj przez 5 min przy 2000 rpm w temperaturze pokojowej. Sferoidy komórkowe osiądą na dnie.
- Użyj sterylnej końcówki pipety Pasteura, aby delikatnie usunąć rozbitą matrycę Matrigel z górnej części wirówki w probówce.
- Dodaj 1 ml pożywki HMEC do osadu ze sferoidów, pipetuj w górę i w dół 2-3 razy za pomocą sterylnej szklanej pipety 2 mL, a następnie przenieś kulturę do dołka w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek.
- Pozostaw sferoidy do przyczepienia się do płytki na co najmniej 48 godzin przed zmianą pożywki. Z czasem komórki opuszczą struktury sferoidalne i zaczną rosnąć jako monowarstwy.
- Przeprowadź pasaż kultur komórkowych, gdy komórki osiągną 50% konfluencji. Najpierw przenieś kulturę do naczynia 35 mm (około 2-4 dni), a następnie do naczynia 100 mm (około 3-5 dni). Bezpośrednio przed każdym etapem pasażowania użyj sterylnej pipety Pasteura, aby ręcznie usunąć jak najwięcej pozostałych „sferoidów widm”.
- Przeanalizuj komórki metodą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości populacji, używając odpowiednich markerów powierzchniowych komórek, a w razie potrzeby oddziel różne populacje komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Izolowane komórki są teraz gotowe do dalszych analiz zgodnie z potrzebami.
3. Reprezentatywne wyniki
W trójwymiarowych kokulturach sferoidów fibroblasty z indukowanym wyciszeniem Tiam1 powodują zwiększoną inwazję w macierz komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego (Rycina 1, porównać D, E, F z A, B, C). Fibroblasty z indukowaną nadekspresją Tiam1 powodują zmniejszoną inwazję w macierz linii komórek raka piersi SUM159 (Rycina 1, porównać J, K, L z G, H, I).
Po utworzeniu sferoidów w ko-kulturze, populacje komórek można wyizolować ze sferoidów poprzez ponowne wysianie w warunkach dwuwymiarowych, jak pokazano na Rysunku 2. W zależności od względnych szybkości wzrostu badanych komórek, czyste populacje mogą pojawić się w wyniku seryjnego pasażowania (jak pokazano na Rysunku 3) lub mogą zostać posortowane przy użyciu odpowiednich markerów komórkowych. Po izolacji z 3D ko-kultury, komórki nabłonkowe zachowują właściwości nabyte w wyniku ko-kultury z fibroblastami przez dłuższy czas, co stwarza szerokie możliwości analizy. W niniejszym przykładzie ekspozycja na fibroblasty z niedoborem Tiam1 wywołała zwiększoną migrację w ko-kulturowanych HMEC, która utrzymywała się przez wiele tygodni po izolacji z 3D ko-kultury (Rysunek 4).
Rycina 1. Obrazowanie uformowanych kokultur sferoidów w mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej. Kultury sferoidów utworzono z linii komórkowych nabłonka gruczołów mlekowych oraz fibroblastów i pozostawiono do wzrostu w kulturze na 10-14 dni. A-F: komórki nabłonkowe = HMEC-mCherry. G-L: komórki nabłonkowe = SUM159-mCherry. A-C, G-I: fibroblasty = kontrolne komórki RMF-GFP. D-F: fibroblasty = RMF-GFP z wyciszeniem Tiam1. J-L: fibroblasty = RMF-GFP z nadekspresją Tiam1. Strzałki wskazują wypustki nabłonkowe naciekające macierz.
Rysunek 2. Sekwencyjne obrazowanie hodowli pod mikroskopem świetlnym i fluorescencyjnym po izolacji z hodowli w Matrigelu. Dzień 0 oznacza obrazowanie bezpośrednio po izolacji; dni 1, 2 i 5 wskazują liczbę dni po izolacji. Korona komórek opuszczających sferoid powiększa się z czasem. Ostatecznie pozostaje „widmowy” sferoid z bardzo niewielką liczbą komórek (strzałka). Po usunięciu sferoidów widmowych i pierwszym pasażu pozostaje bardzo mało sferoidów.
Rycina 3. Analiza cytometrii przepływowej komórek po izolacji z kokultury w Matrigelu. Po dojrzewaniu kokultur sferoidalnych komórki są izolowane z kokultury 3D poprzez pipetowanie i seryjne pasażowanie. Alikwoty próbek są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (w tym przykładzie z wykorzystaniem fluorescencji zielonej i czerwonej w celu zidentyfikowania odpowiednio fibroblastów wykazujących ekspresję GFP oraz komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję mCherry), aby określić względne liczebności populacji komórek nabłonkowych i fibroblastów.
Rycina 4. Migracja komórek HMECs w układzie Transwell utrzymuje się po izolacji z kokultury w Matrigelu. Po uzyskaniu czystych populacji poprzez hodowlę lub sortowanie komórek metodą fluorescencyjną, komórki można poddać dowolnej analizie. Przedstawiono ocenę migracji komórek HMECs kokultywowanych z fibroblastami kontrolnymi (C) lub fibroblastami z niedoborem Tiam1 (shT) przez perforowane membrany Transwell w 2., 4. i 8. tygodniu po izolacji z kokultury.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda stanowi proste podejście do analizy wpływu fibroblastów zrębu na komórki nabłonkowe, w tym komórki nowotworowe. Umożliwia ona bezpośrednią interakcję międzykomórkową w kontekście trójwymiarowym, wspieranym przez zewnątrzkomórkową macierz błony podstawnej, jednocześnie pozwalając na łatwe wyodrębnienie komórek z macierzy do dalszych analiz. Metodę tę można zastosować w badaniach zrębu związanego z nowotworem, ponieważ linie fibroblastów mogą być modyfikowane w celu wpływania na wybrane szlaki sy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak deklarowanych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Bez czerwieni fenolowej |
| Klasyczne pożywka ciekła Hyclone: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Surowica cielęca Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulina | EMD Millipore | 407709 | Rozpuścić w 0,005N HCl; filtr 0,22 μM |
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H4001 | Rozpuścić w 50% EtOH; filtr 0,22 μM |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Rozpuścić w 10mM kwasie octowym; filtr 0,22 μM |
Bibliografia
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L. Tumor-stroma interactions. Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
