Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Podsumowanie

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Streszczenie

Choć ogromne wysiłki poświęcono identyfikacji szlaków sygnalizacyjnych i cząsteczek zaangażowanych w prawidłowe i nowotworowe zachowania komórek^1-2, znaczna część tych prac została przeprowadzona z wykorzystaniem klasycznych dwuwymiarowych modeli hodowli komórkowych, które umożliwiają łatwą manipulację komórkami. Stało się jasne, że wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne są pod wpływem sił zewnątrzkomórkowych, w tym wymiarowości i napięcia powierzchniowego komórek^3-4. Zastosowano wiele podejść w celu opracowania modeli trójwymiarowych, które dokładniej odzwierciedlają architekturę tkanki biologicznej³. Mimo że modele te uwzględniają wielowymiarowość i naprężenia architektoniczne, badanie wynikających z nich efektów w komórkach jest mniej łatwe niż w dwuwymiarowej hodowli tkankowej ze względu na ograniczenia modeli oraz trudności w izolowaniu komórek do późniejszych analiz.

Coraz powszechniej uznaje się istotną rolę mikrośrodowiska wokół guzów w procesie tumorigennezy i zachowaniu nowotworu⁴. Zręb guza składa się z wielu typów komórek oraz cząsteczek zewnątrzkomórkowych. W trakcie rozwoju guza zachodzi dwukierunkowa sygnalizacja między komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu⁵. Choć zidentyfikowano niektóre czynniki uczestniczące w koewolucji guza i zrębu, wciąż istnieje potrzeba opracowania prostych technik do systematycznej identyfikacji i badania pełnego spektrum tych sygnałów⁶. Fibroblasty są najliczniejszym typem komórek w prawidłowych tkankach zrębowych lub tkankach zrębowych związanych z nowotworem i przyczyniają się do odkładania oraz utrzymania błony podstawnej i czynników wzrostu działających w sposób parakrynny⁷.

Wiele grup badawczych wykorzystywa trójwymiarowe systemy hodowli do badania roli fibroblastów w różnych funkcjach komórkowych, w tym w odpowiedzi nowotworu na terapie, rekrutacji komórek odpornościowych, działaniu cząsteczek sygnałowych, proliferacji, apoptozie, angiogenezie i inwazji^8-15. Zoptymalizowaliśmy prostą metodę oceny wpływu fibroblastów gruczołu piersiowego na komórki nabłonkowe gruczołu piersiowego, wykorzystując dostępny komercyjnie model macierzy zewnątrzkomórkowej do tworzenia trójwymiarowych hodowli mieszanych populacji komórek (ko-kultur)^16-22. Wraz z przebiegiem ko-kultury komórki tworzą sferoidy, w których fibroblasty skupiają się wewnątrz, a komórki nabłonkowe znajdują się głównie na zewnątrz sferoidów, tworząc wielokomórkowe wypustki w macierzy. Manipulacje fibroblastami prowadzące do zmiany inwazyjności komórek nabłonkowych można łatwo ilościowo ocenić poprzez zmiany w liczbie i długości wypustek nabłonkowych²³. Ponadto opracowaliśmy metodę izolacji komórek nabłonkowych z trójwymiarowej ko-kultury, co ułatwia analizę wpływu kontaktu z fibroblastami na zachowanie komórek nabłonkowych. Stwierdziliśmy, że efekty ko-kultury utrzymują się przez wiele tygodni po izolacji komórek nabłonkowych, co zapewnia wystarczającą ilość czasu na przeprowadzenie wielu testów. Metoda ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Technika ta pozwala na szybką ocenę in vitro modeli komórkowych w wielu warunkach, a uzyskane wyniki można porównać z modelami tkankowymi zwierząt in vivo oraz z ludzkimi próbkami tkanek.

Protokół

1. Tworzenie trójwymiarowych kokultur

1. Dzień przed ustanowieniem kokultur należy wyjąć Matrigel z zamrażarki i rozmrozić go na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
2. W dniu eksperymentu należy przygotować pożywkę do kokultury, która odpowiada pożywce stosowanej dla użytych komórek nabłonkowych (w tym przykładzie pożywka HMEC: pożywka DME/F12 z 10% serum cielęcego, 5 μg/mL insuliny, 1 μg/mL hydrokortyzonu i 1 ng/mL EGF). Pożywkę należy przechowywać na lodzie przez co najmniej 1 godzinę przed zmieszaniem z Matrigelem.
3. Aby rozcieńczyć rozmrożony Matrigel, należy określić całkowitą pożądaną ilość mieszaniny Matrigel:pożywka (300 μL na studzienkę dla płytek 24-dołkowych) i dodać połowę tej objętości lodowatej pożywki HMEC do sterylnej probówki na lodzie. Następnie do probówki należy dodać taką samą połowę całkowitej objętości rozmrożonego Matrigelu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1. Probówkę należy przechowywać na lodzie.
4. Do środka wyznaczonych studzienek na płytce 24-dołkowej należy nanieść 50 μL mieszaniny Matrigel:pożywka i inkubować przez 10 min w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżonym powietrzem i 5% CO₂.
5. Do studzienek należy dodać dodatkowe 450 μL mieszaniny Matrigel:pożywka i inkubować przez kolejne 60 minut.
6. Podczas inkubacji należy przygotować suspensję fibroblastów (tutaj h-TERT-unieśmiertelnione fibroblasty gruczołu piersiowego wykazujące ekspresję GFP) i komórek nabłonkowych (tutaj h-TERT-unieśmiertelniona linia ludzkich komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego wykazująca ekspresję RFP) w stosunku 1:1, przy stężeniu 0,5 x 10⁵ każdych z nich w 0,5 ml pożywki HMEC.
7. Po 60-minutowym etapie inkubacji należy delikatnie nanieść suspensję komórkową na powierzchnię zestalonego żelu, a następnie przenieść kulturę z powrotem do inkubatora.
8. Nie należy zakłócać kultur przez 2 dni. Po tym czasie pożywkę można wymieniać co 2-3 dni, bardzo delikatnie aspirując ją z boku studzienki i ostrożnie zastępując świeżą pożywką HMEC.
9. Tworzenie sferoidów należy monitorować codziennie pod mikroskopem. Kultury zazwyczaj dojrzewają po 10-14 dniach. Należy wykonać odpowiednie obrazy za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Wielkość sferoidów oraz długość projekcji można zmierzyć pod mikroskopem świetlnym.

2. Izolacja komórek z kokultur sferoidowych

1. Bardzo delikatnie pipetuj kulturę w górę i w dół 10 razy, używając sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 mL. Alternatywnie, aby pipetować kulturę, odetnij końcówkę plastikowego tipa do pipety 1000 µL za pomocą nożyczek wysterylizowanych w autoklawie lub poprzez zanurzenie w 70% etanolu. Przenieś kulturę za pomocą szklanej pipety lub przyciętego plastikowego tipa do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez 5 min przy 2000 rpm w temperaturze pokojowej. Sferoidy komórkowe osadzą się na dnie.
2. Użyj sterylnego tipa pipety Pasteura, aby delikatnie usunąć rozbity Matrigel z górnej części wirówki.
3. Dodaj 1 ml medium HMEC do osadu sferoidów, pipetuj w górę i w dół 2-3 razy sterylną szklaną pipetą 2 mL, a następnie przenieś kulturę do dołka w 24-dołkowej płytce hodowlanej.
4. Pozostaw sferoidy do przytwierdzenia do podłoża na co najmniej 48 godzin przed wymianą medium. Z czasem komórki opuszczą struktury sferoidalne i będą rosły w formie monowarstw.
5. Pasażuj kultury komórkowe, gdy komórki osiągną 50% konfluencji. Najpierw rozszerz kulturę do naczynia 35 mm (około 2-4 dni), a następnie do naczynia 100 mm (około 3-5 dni). Bezpośrednio przed każdym etapem pasażowania użyj sterylnej pipety Pasteura, aby ręcznie usunąć jak najwięcej pozostałych „sferoidów widm”.
6. Przeanalizuj komórki metodą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości populacji, używając odpowiednich markerów powierzchniowych komórek, a w razie potrzeby przeprowadź dalszą separację różnych populacji komórkowych za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek. Wyizolowane komórki są teraz gotowe do dalszych analiz zgodnie z potrzebami.

3. Reprezentatywne wyniki

W trójwymiarowych współkulturach sferoidów fibroblasty z wyciszonym genem Tiam1 indukują zwiększoną inwazję komórek nabłonkowych piersi w macierz (Rycina 1, porównaj D, E, F z A, B, C). Fibroblasty z wyindukowaną nadekspresją Tiam1 indukują zmniejszoną inwazję w macierz linii komórkowej raka piersi SUM159 (Rycina 1, porównaj J, K, L z G, H, I).

Po wytworzeniu sferoidów w ko-kulturze, populacje komórek można izolować poprzez ponowne wysiewanie w kontekście dwuwymiarowym, jak pokazano na Rysunku 2. W zależności od względnych szybkości wzrostu badanych komórek, czyste populacje mogą pojawić się w wyniku seryjnych pasaży (jak pokazano na Rysunku 3) lub mogą zostać posortowane przy użyciu odpowiednich markerów komórkowych. Po izolacji z trójwymiarowej ko-kultury, komórki nabłonkowe zachowują właściwości nadane przez ko-kulturę z fibroblastami przez dłuższy czas, co stwarza szerokie możliwości analizy. W tym przykładzie ekspozycja na fibroblasty z niedoborem Tiam1 wywołała zwiększoną migrację w ko-kulturowanych HMEC, która utrzymywała się przez wiele tygodni po izolacji z 3D ko-kultury (Rysunek 4).

Rycina 1. Obrazowanie uformowanych kokultur sferoidów pod mikroskopem świetlnym i fluorescencyjnym. Kultury sferoidów utworzono z linii komórkowych nabłonka gruczołu piersiowego oraz fibroblastów i inkubowano przez 10-14 dni. A-F: komórki nabłonkowe = HMEC-mCherry. G-L: komórki nabłonkowe = SUM159-mCherry. A-C, G-I: fibroblasty = kontrolne komórki RMF-GFP. D-F: fibroblasty = RMF-GFP z wyciszeniem Tiam1. J-L: fibroblasty = RMF-GFP z nadekspresją Tiam1. Strzałki wskazują projekcje nabłonkowe naciekające macierz.

Rysunek 2. Obrazowanie seryjne kultur pod mikroskopem świetlnym i fluorescencyjnym po wyizolowaniu z hodowli w Matrigelu. Dzień 0 oznacza obrazowanie bezpośrednio po izolacji; dni 1, 2 i 5 wskazują dni po izolacji. Korona komórek opuszczających sferoid zwiększa się w czasie. Ostatecznie pozostaje sferoid „widmo” z bardzo niewielką liczbą komórek (strzałka). Po usunięciu sferoidów typu widmo i pierwszym pasażu pozostaje bardzo niewiele sferoidów.

Rysunek 3. Analiza cytometrii przepływowej komórek po izolacji z kokultury w Matrigelu. Po dojrzewaniu sferoidalnych kokultur komórki są izolowane z kokultury 3D poprzez pipetowanie i seryjne pasażowanie. Alikwoty próbek są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (w tym przykładzie z wykorzystaniem fluorescencji zielonej i czerwonej w celu zidentyfikowania odpowiednio fibroblastów wykazujących ekspresję GFP oraz komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję mCherry), aby określić względne populacje komórek nabłonkowych i fibroblastów.

Rysunek 4. Migracja HMEC w układzie Transwell utrzymuje się po izolacji z kokultury w Matrigelu. Po uzyskaniu czystych populacji poprzez hodowlę lub fluorescencyjne sortowanie komórek, można przeprowadzić dowolną analizę. Tutaj oceniano migrację HMEC współhodowanych z fibroblastami kontrolnymi (C) lub fibroblastami z niedoborem Tiam1 (shT) przez perforowane membrany Transwell w 2., 4. i 8. tygodniu po izolacji z kokultury.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda stanowi proste podejście do analizy wpływu fibroblastów zrębu na komórki nabłonkowe, w tym komórki nowotworowe. Umożliwia ona bezpośrednią interakcję międzykomórkową w kontekście trójwymiarowym, wspieranym przez zewnątrzkomórkową macierz błony podstawnej, jednocześnie pozwalając na łatwe wyodrębnienie komórek z macierzy do dalszych analiz. Metodę tę można zastosować w badaniach zrębu związanego z nowotworem, ponieważ linie fibroblastów mogą być modyfikowane w celu wpływania na wybrane szlaki sy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Bez czerwieni fenolowej
Klasyczne pożywka ciekła Hyclone: DMEM F12	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30023.01
Surowica cielęca Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH3007303
Insulina	EMD Millipore	407709	Rozpuścić w 0,005N HCl; filtr 0,22 μM
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H4001	Rozpuścić w 50% EtOH; filtr 0,22 μM
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Rozpuścić w 10mM kwasie octowym; filtr 0,22 μM