Artykuł metodologiczny

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

32.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3770

⸱

30 kwietnia 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research, Singapore, 2A*STAR-Duke-NUS Neuroscience Research Partnership, Singapore, 3Department of Biochemistry, National University of Singapore, Singapore

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Streszczenie

Genomy są zorganizowane w struktury trójwymiarowe, przyjmując konformacje wyższego rzędu w obrębie mikroskopijnych przestrzeni jądrowych 7, 2, 12. Takie architektury nie są przypadkowe i obejmują oddziaływania między promotorami genów a elementami regulacyjnymi 13. Wiązanie czynników transkrypcyjnych do specyficznych sekwencji regulacyjnych prowadzi do powstania sieci regulacji i koordynacji transkrypcji 1, 14.

Metoda analizy oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania tagów końców parzystych (ChIA-PET) została opracowana w celu identyfikacji tych struktur chromatyny wyższego rzędu 5,6. Komórki są utrwalane, a oddziałujące loci są wychwytywane dzięki kowalencyjnym wiązaniom krzyżowym DNA-białko. Aby zminimalizować szum nieswoisty i zmniejszyć złożoność, a także zwiększyć swoistość analizy oddziaływań chromatyny, stosuje się immunoprecypitację chromatyny (ChIP) przeciwko specyficznym czynnikom białkowym w celu wzbogacenia fragmentów chromatyny budzących zainteresowanie przed ligacją bliskościową. Ligacja z udziałem pół-linkerów tworzy następnie kowalencyjne wiązania między parami fragmentów DNA powiązanych ze sobą w obrębie poszczególnych kompleksów chromatyny. Flankujące miejsca restrykcyjne enzymu MmeI w pół-linkerach umożliwiają ekstrakcję konstruktów tag-linker-tag końców parzystych (PET) po trawieniu enzymem MmeI. Ponieważ pół-linkery są biotynilowane, konstrukty PET są oczyszczane przy użyciu magnetycznych kulek z streptawidyną. Oczyszczone PET-y są ligowane z adaptorami do sekwencjonowania nowej generacji, a katalog oddziałujących fragmentów jest generowany za pomocą sekwenatorów nowej generacji, takich jak Illumina Genome Analyzer. Następnie przeprowadzana jest analiza mapowania i bioinformatyczna w celu identyfikacji miejsc wiązania wzbogaconych metodą ChIP oraz oddziaływań chromatyny wzbogaconych metodą ChIP 8.

Przygotowaliśmy materiał wideo, aby zaprezentować krytyczne aspekty protokołu ChIA-PET, w szczególności przygotowanie ChIP, ponieważ jakość ChIP odgrywa kluczową rolę w końcowym wyniku biblioteki ChIA-PET. Ze względu na bardzo długi charakter protokołów, w filmie przedstawiono jedynie najważniejsze etapy.

Protokół

A. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) (patrz Rysunek 1)

1. Podwójne sieciowanie białek związanych z chromatyną i zbieranie komórek

(w 02:10 filmu)

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest pierwszym krytycznym etapem tworzenia biblioteki ChIA-PET. Krok ten jest istotny dla zmniejszenia poziomu złożoności, szumu tła oraz zwiększenia specyficzności. Przygotowanie ChIP będzie wymagało optymalizacji pod kątem typu komórek i badanego czynnika. Niniejszy protokół opiera się na bibliotece ChIA-PET dla polimerazy RNA II przygotowanej z komórek MCF-7 9 opracowanej w naszym laboratorium. Aby zapewnić wystarczającą złożoność otrzymanej biblioteki, zalecamy użycie 1 x 108 komórek do przygotowania materiału ChIP. W zależności od celu i linii komórkowej uzyskana wydajność może wynosić od 100 ng do 300 ng. Zalecamy użycie minimum 100 ng ChIP do konstrukcji biblioteki ChIA-PET z liczbą cykli PCR mniejszą niż 20, aby zminimalizować redundancję podczas sekwencjonowania. Większe ilości materiału ChIP pozwolą na dalszą redukcję redundancji, co poprawi jakość bibliotek.

  1. Przemyć 1 x 108 komórek MCF-7 (odpowiednik pięciu płytek kwadratowych 500 cm2 zawierających 2 x 107 komórek) dwukrotnie podgrzanym do 37 °C roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
  2. Przeprowadzić sieciowanie komórek MCF-7 za pomocą świeżo przygotowanego 1,5 mM EthylGlycol bis(SuccinimidylSuccinate) (EGS) przez 45 minut w temperaturze pokojowej (22 °C) przy jednoczesnym obracaniu w dygestorium.
  3. Dodać 37% formaldehyd do stężenia końcowego 1% na 20 minut w temperaturze pokojowej (22 °C) przy jednoczesnym obracaniu w dygestorium.

Równanie do obliczania objętości 37% formaldehydu podczas przygotowania próbki.

  1. Zneutralizuj działanie czynników sieciujących, dodając glicynę 2 M do stężenia końcowego 200 mM. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22 °C) przy ciągłym obracaniu.

Równanie do obliczenia objętości 2M glicyny z EGS-formaldehydem w formie wzoru chemicznego.

  1. Zużyte sieciujące należy przelać do kolby z odpadami, a następnie dwukrotnie przemyć komórki zimnym PBS.
  2. Odlać PBS i zebrać komórki poprzez skrobanie. Zebrane komórki przechowywać w lodzie. Przepłukać płytkę 5ml PBS (z dodatkiem inhibitorów proteaz („+PI”) zgodnie z instrukcją producenta), aby maksymalnie zwiększyć ilość zebranych komórek.
  3. Wirować komórki w celu uzyskania osadu przy 1,800 x g (3,000 rpm) przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz i przystąpić do lizy komórek. Alternatywnie można przechowywać osad w temperaturze -80 °C.

2. Lizy komórek

(w 04:15 filmu)

  1. Osad całkowicie resuspendować w 15 ml 0,1% buforu lizującego SDS (50 mM HEPES pH7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoksycholan sodu, 0,1% SDS + PI) poprzez pipetowanie. Inkubować w rotatorze przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Zlizowane komórki wirować w celu uzyskania osadu przy 800 x g (2 000 rpm) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odlać nadsącz i powtórzyć lizę komórek raz, zgodnie z krokami 2.1 i 2.2.
  4. Wyizolowany osad jąder jest gotowy do lizy jądrowej. Alternatywnie, osad można przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Liza jąder

(w 05:00 filmu)

Lizę jądrową przeprowadza się w celu uwolnienia sieciowanej chromatyny przed jej fragmentacją. W przypadku braku błony jądrowej sieciowaną chromatynę można poddać sonikacji w łagodniejszych warunkach. Czasami intensywność sonikacji może być niewystarczająca do rozbicia błony jądrowej, co skutkuje uzyskaniem mniejszej ilości chromatyny, ponieważ nienaruszone jądra zostaną usunięte po wirowaniu. Niemniej jednak różne typy komórek mogą wymagać odmiennych warunków.

  1. Osad wyizolowanych jąder resuspendować w 15 ml 1% buforu lizującego SDS (50 mM HEPES pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoksycholan sodu, 1% SDS + PI). Zawiesinę jąder przenieść do probówki do wirowania wysokoprędkościowego (Oak Ridge Centrifuge Tube (Polypropylene)) i rotować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Zwiryzować osad zlizowanych jąder przy 47 810 x g (20 000 rpm) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odlać naddatek i rozbić osad za pomocą końcówki pipety p1000.
  4. Przemyć osad 30 ml 0,1% buforu lizującego SDS (+PI).
  5. Rotować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zwiryzować chromatynę przy 47 810 x g (20 000 rpm) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć naddatek i powtórzyć przemywanie raz zgodnie z krokami 3.4 do 3.6 przed przystąpieniem do fragmentacji chromatyny. Alternatywnie można przechowywać osad chromatyny w temperaturze -80 °C.

4. Fragmentacja chromatyny

(w 07:03 filmu)

  1. Przenieś osad chromatyny do 14 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem.
  2. Do osadu chromatyny dodaj 1 ml 0,1% buforu lizującego SDS (+PI). Upewnij się, że w mieszaninie nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ wpłynie to na wydajność sonikacji.
  3. Poddaj chromatynę-DNA fragmentacji do rozmiaru od 200 do 600 par zasad za pomocą cyfrowego sonikatora Branson Digital Sonifer Cell Disrupter (amplituda 35%, 9 minut (30 sekund pracy, 30 sekund przerwy)); próbki muszą być przez cały czas utrzymywane w niskiej temperaturze, aby zapobiec przegrzaniu, dlatego sonikację należy przeprowadzać w pomieszczeniu chłodniczym (patrz Rysunek 2).
  4. Przeprowadź odwrócenie sieciowania (reverse-crosslinking) dla aalikwoty chromatyny i sprawdź wydajność fragmentacji zgodnie z poniższymi krokami. (Poniższe kroki nie są pokazane w filmie).
    • Odbierz 10 μl alikwot chromatyny po sonikacji.
    • Odwiruj sonikowaną chromatynę z prędkością 16 110 x g (13 200 rpm) przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    • Przenieś nadsącz do nowej probówki i dodaj 2 μl roztworu Proteinazy K.
    • Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 50 °C.
    • Rozdziel chromatynę po odwróceniu sieciowania na żelu agarozowym 1,5%.
    • Powtórz sonikację, jeśli fragmenty DNA są większe niż oczekiwano.
  5. Odwiruj pozostały lizat z prędkością 16 110 x g (13 200 rpm) przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przenieś sonikowaną chromatynę (nadsącz) do nowej probówki przed etapem oczyszczania wstępnego (preclearing) za pomocą kulek magnetycznych. Alternatywnie, przechowuj sonikowaną chromatynę w temperaturze -80 °C do czasu zebrania ilości chromatyny wystarczającej do rozpoczęcia analizy ChIP.

5. Przemywanie, wstępne oczyszczanie i powlekanie koralików przeciwciałem

(w 08:17 filmu)

  1. Wstępne oczyszczanie chromatyny
    1. Do jednej procedury IP należy użyć 300 μl magnetycznych kuleczek z białkiem G.
    2. Przemyć kuleczki trzykrotnie 5 ml buforu do mycia kuleczek (Beads Wash Buffer; PBS, 0,1% Triton X-100). Ta oraz przyszłe etapy mycia z wykorzystaniem magnetycznych kuleczek z białkiem G składają się z następujących kroków. Należy dopilnować, aby kuleczki magnetyczne nie wyschły.
      • Odzyskać kuleczki za pomocą koncentratora cząstek magnetycznych.
      • Usunąć nadsącz.
      • Resuspendować kuleczki w buforze.
      • Mieszać w rotatorze przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      • Wirować przy 129 x g (800 rpm) przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
      • Odzyskać kuleczki za pomocą koncentratora cząstek magnetycznych.
      • Usunąć nadsącz.
    3. Połączyć sonicowaną chromatynę z uprzednio przemytymi kuleczkami, aby usunąć nieswoiste wiązanie chromatyny z kuleczkami.
      • Odstawić 10 μl sonicowanej chromatyny jako „input” do późniejszej kontroli wzbogacenia za pomocą ilościowej PCR (qPCR). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Mieszać w rotatorze przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Wirować sonicowaną chromatynę przy 129 x g (800 rpm) przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
    6. Umieścić probówkę na koncentratorze cząstek magnetycznych.
  2. Powlekanie kuleczek magnetycznych przeciwciałem
    1. Odmierzyć 300 μl magnetycznych kuleczek z białkiem G do nowej probówki.
    2. Przemyć kuleczki trzykrotnie 5 ml buforu do mycia kuleczek (Beads Wash Buffer; PBS, 0,1% Triton X-100).
    3. Dodać równą objętość (jak w kroku 5.1.3) buforu do mycia kuleczek.
    4. Dodać 35 μg przeciwciała monoklonalnego przeciwko polimerazie RNA II (8WG16).
    5. Mieszać w rotatorze przez noc w temperaturze 4 °C.
    6. Przemyć kuleczki powleczone przeciwciałem dwukrotnie 5 ml buforu do mycia kuleczek.
    7. Odzyskać kuleczki powleczone przeciwciałem za pomocą koncentratora cząstek magnetycznych.

6. Immunoprecypitacja chromatyny

(w 10:03 filmu)

Aby zmniejszyć poziom złożoności i szum tła, stosuje się przeciwciała przeciwko specyficznym czynnikom białkowym w celu wzbogacenia konkretnych fragmentów chromatyny przed ligacją w bliskości 6.

W niniejszej pracy zastosowano mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko polimerazie RNA II (8WG16), które rozpoznaje formę inicjującą białka. Poprzez wzbogacenie fragmentów DNA związanych z polimerazą RNA II można zwiększyć specyficzność biblioteki, co pozwala na identyfikację dalekosiężnych oddziaływań chromatyny pomiędzy aktywnymi promotorami a ich odpowiednimi regionami regulacyjnymi 9.

  1. Usunąć bufor piorący z kulek pokrytych przeciwciałami za pomocą magnetycznego koncentratora cząsteczek.
  2. Przenieść sonikowaną chromatynę (nadpłyn z kroku 5.1.6) za pomocą magnetycznego koncentratora cząsteczek do kulek pokrytych przeciwciałami (z kroku 5.2.7).
  3. Inkubować w rotacji przez noc w temperaturze 4 °C.

7. Płukanie i eluowanie immunoprecypitowanych kompleksów DNA-białko

(w 11:13 filmu)

  1. Przemyć koraliki po immunoprecypitacji chromatyny trzykrotnie 5 ml 0,1% SDS Lysis Buffer.
  2. Przemyć koraliki raz 5 ml High Salt Wash Buffer (50 mM HEPES pH 7.5, 350 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS).
  3. Przemyć koraliki raz 5 ml Lithium Chloride Wash Buffer (10 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 0.5% Sodium Deoxycholate).
  4. Odlać bufor do mycia i resuspendować przemyte koraliki w 1 ml TE Buffer.
  5. Mieszać na rotatorze przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Próbka jest gotowa do ilościowego oznaczenia i kontroli wzbogacenia ChIP. Po zgromadzeniu wystarczającej ilości materiału ChIP, próbka jest gotowa do przygotowania biblioteki ChIA-PET. Krok ten jest krytyczny i musi zostać wykonany, aby zapewnić pomyślne przygotowanie biblioteki ChIA-PET. Koraliki wzbogacone ChIP można przechowywać do 2 tygodni w 4 °C podczas przeprowadzania oznaczeń ilościowych, kontroli wzbogacenia ChIP i gromadzenia wystarczającej ilości materiału.
    1. Eluować i odwrócić sieciowanie DNA „input” oraz koralików wzbogaconych ChIP zgodnie z poniższymi krokami. (Kolejne kroki nie są pokazane w filmie.)
      • Eluować 20% koralików wzbogaconych ChIP za pomocą 200 μl ChIP Elution Buffer (50 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Mieszać na rotatorze przez 30 minut w 37 °C. Wirować eluowane koraliki z prędkością 6,100 x g (800 rpm) przez 1 minutę w 4 °C. Przenieść eluowane kompleksy ChIP (nadanos) do nowej probówki za pomocą koncentratora cząstek magnetycznych.
      • Odwrócić sieciowanie DNA „input” i eluowanych kompleksów ChIP przy użyciu 2 μl Proteinase K (stężenie końcowe 0.2 g/ml) przez 2 godziny w 50 °C.
      • Przenieść odsieciowane DNA „input” i eluowane DNA ChIP (odpowiednio) do probówek 2 ml MaXtract High Density. Dodać do probówek w dygestorium 200 μl 25:24:1 Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol pH 7.9 i wymieszać przez odwracanie. Wirować probówki przez 5 minut przy 16,110 x g (13,200 rpm) w temperaturze pokojowej.
      • Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki i wytrącić odsieciowane DNA za pomocą 20 μl 3 M Sodium Acetate pH 5.5, 200 μl izopropanolu i 1 μl 15 mg/ml Glycoblue. Inkubować w -80 °C przez 30 minut, a następnie wirować DNA przez 30 minut przy 16,110 x g (13,200 rpm) w 4 °C.
      • Po wirowaniu DNA wytrąconego izopropanolem, przemyć osad DNA dwukrotnie 75% lodowatym etanolem i resuspendować osad DNA w 20 μl TE buffer.
    2. Oznaczyć ilościowo DNA „input” (z kroku 5.1.3) oraz DNA ChIP za pomocą testu picogreen 10.
    3. Przeprowadzić kontrolę wzbogacenia za pomocą jakościowej reakcji PCR (qPCR).

B. Analiza oddziaływań chromatyny z wykorzystaniem sekwencjonowania znaczników par końcowych (ChIA-PET)

Druga połowa filmu omówi kluczowe etapy konstrukcji biblioteki ChIA-PET.

1. Wyrównywanie końców fragmentów DNA z ChIP

Ten rozdział filmu podkreśla dwa główne punkty: procedurę krok po kroku płukania kulek magnetycznych w celu usunięcia enzymów i soli buforowej z poprzedniej reakcji (Krok 1.1, od 12:22 do 12:54 filmu) oraz procedurę przygotowania reakcji enzymatycznych z wykorzystaniem kulek magnetycznych w mieszaninie reakcyjnej (Krok 1.2, od 12:54 do 13:25 filmu).

  1. Przemyj raz koraliki wzbogacone w ChIP lodowatym buforem TE. Ten oraz kolejne etapy płukania z użyciem koralików magnetycznych składają się z następujących kroków.
    • Wiruj przy 6,100 x g (800 rpm) przez 1 minutę w 4 °C.
    • Odzyskaj koraliki za pomocą koncentratora cząsteczek magnetycznych.
    • Odrzuć nadsącz.
    • Dodaj bufor do koralików.
    • Wymieszaj koraliki z buforem, delikatnie potrząsając probówką.
    • Wiruj przy 6,100 x g (800 rpm) przez 1 minutę w 4 °C.
    • Odzyskaj koraliki za pomocą koncentratora cząsteczek magnetycznych.
    • Odrzuć nadsącz.
  2. Aby uzupełnić nawisy po sonikacji, przygotuj master-mix zawierający 70 μl 10 x buforu dla polimerazy DNA T4, 7 μl 10 mM dNTPs oraz 615,8 μl wody wolnej od nukleaz. Dokładnie wymieszaj i resuspenduj przemyte koraliki w master-mixie. Dodaj 7,2 μl polimerazy DNA T4 o stężeniu 9,7 U/μl do końcowej objętości 700 μl. Wymieszaj i inkubuj przez 40 minut w 37 °C w rotacji (używając Palico Biotech Intelli-Mixer RM-2L, F8, 30 rpm, U=50, u=60). Wszystkie kolejne reakcje enzymatyczne przeprowadź zgodnie z następującymi krokami.
    • Rozcieńcz bufory reakcyjne wodą wolną od nukleaz.
    • Dodaj wszystkie pozostałe odczynniki (z wyjątkiem enzymów) do rozcieńczonego buforu.
    • Dokładnie wymieszaj. Resuspenduj koraliki/osad w mieszaninie reakcyjnej.
    • Dodaj enzym do resuspendowanych koralików/osadu (przechowuj enzymy przez cały czas w chłodni laboratoryjnej, aby zapewnić maksymalną aktywność enzymatyczną).
    • Uszczelnij probówkę parafilmem.
    • Upewnij się, że koraliki są dobrze wymieszane przez cały czas inkubacji.
  3. Odrzuć mieszaninę reakcyjną i trzykrotnie wypłucz pozostałe sole buforowe oraz enzymy lodowatym buforem do płukania (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl).

2. Ligacja biotynilowanych pół-linkerów do DNA z ChIP

Ten rozdział filmu przedstawia charakterystykę oligonukleotydów półłączników wykorzystywanych w konstrukcji ChIA-PET oraz zastosowanie składu kodów kreskowych nukleotydowych do rozróżnienia nieswoistych i swoistych produktów ligacji (13:28 do 14:24 filmu). Rozdział ten prezentuje również procedurę krok po kroku przygotowania reakcji ligacji półłączników (Krok 2.2, 14:24 do 15:54 filmu).

W niniejszym protokole wprowadzono dwa rodzaje biotynilowanych pół-linkerów, które zaprojektowano z wewnętrznym kodem kreskowym składającym się z czterech nukleotydów (TAAG lub ATGT) oraz miejsca rozpoznawania dla enzymu restrykcyjnego typu IIS MmeI (TCCAAC). Po wzbogaceniu metodą ChIP, sonikowane fragmenty chromatyny dzieli się na dwie równe alikwoty, które następnie liguje się z nadmiarem pół-linkera A lub pół-linkera B 5,9.

  1. Podziel kulki wzbogacone w ChIP na dwie alikwoty w celu ligacji połowicznych łączników DNA za pomocą biotynylowanych połowicznych łączników A lub połowicznych łączników B. Te dwa połowiczne łączniki mają takie same sekwencje nukleotydowe, z wyjątkiem czterech nukleotydów w środku, które służą (połowiczny łącznik A z TAAG; połowiczny łącznik B z ATGT) jako kody kreskowe nukleotydów. Po połączeniu podczas ligacji zbliżeniowej, losowe i nieswoiste ligacje między dwoma różnymi kompleksami ChIP można zidentyfikować w populacji sekwencji z heterodimerami łączników AB, w porównaniu do ligacji swoistych, które można zidentyfikować w populacji sekwencji z homodimerami łączników AA lub BB.
  2. Przeprowadź ligację kulek wzbogaconych w ChIP, dodając 140 μl 5 x buforu do ligazy T4 DNA z PEG, 3,5 μl biotynylowanych połowicznych łączników A lub B o stężeniu 200 ng/μl, 553,5 μl wody wolnej od nukleaz oraz 3 μl ligazy T4 DNA o stężeniu 30 U/μl (Ligazę T4 DNA należy przez cały czas przechowywać w chłodziarce laboratoryjnej, ponieważ ligazy są niestabilne nawet w lodzie). Zamknij probówkę parafilmem i inkubuj przez noc w temperaturze 16 °C przy jednoczesnej rotacji.

3. Elucja i ligacja bliskościowa fragmentów DNA z ChIP

Ten rozdział filmu wyjaśnia rolę buforu EB, SDS oraz Triton X-100 podczas elucji kompleksów chromatyny z kulek, a także przedstawia krok po kroku procedurę przygotowania reakcji cyrkularyzacji (krok 3.9, od 15:54 do 17:10 filmu).

Po ligacji pół-linkerów do fragmentów chromatyny, obie frakcje są łączone i eluowane z kulek. Oddziałujące fragmenty DNA zostaną następnie połączone pełną sekwencją linkera podczas ligacji bliskościowej.

Wykorzystując skład kodów kreskowych nukleotydowych, sekwencje można podzielić na trzy kategorie: sekwencje z linkerami heterodimerycznymi AB (kod kreskowy ATGT / TAAG) oraz sekwencje z linkerami homodimerycznymi AA lub BB (kod kreskowy TAAG / TAAG lub ATGT / ATGT), aby odpowiednio odróżnić niespecyficzne i specyficzne produkty ligacji 9.

Zatem zastosowanie dwóch pół-linkerów z różnymi kodami kreskowymi nukleotydowymi pozwala na określenie różnych eksperymentów lub powtórzeń, a także na monitorowanie szybkości niespecyficznej ligacji chimerycznej pomiędzy różnymi kompleksami ChIP 5.

  1. Przemyć trzy razy kulek z przyłączonym pół-linkerem lodowatym Buforem do Płukania (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl).
  2. Połączyć obie probówki z kulekami z przyłączonym pół-linkerem w następujący sposób:
    • Odzyskać kuleczki z jednej z probówek z przyłączonym pół-linkerem za pomocą koncentratora cząstek magnetycznych („Probówka A”).
    • Drugą probówkę z kulekami z przyłączonym pół-linkerem pozostawić w lodzie („Probówka B”).
    • Odlać Bufor do Płukania (z kroku 3.2.1) z Probówki A i przenieść kuleczki z przyłączonym pół-linkerem (z kroku 3.2.2) z Probówki B do Probówki A, gdy ta wciąż znajduje się w koncentratorze cząstek magnetycznych.
    • Dodać 700 μl lodowatego Buforu do Płukania do Probówki B, aby zebrać pozostałe kuleczki z przyłączonym pół-linkerem i upewnić się, że zawartość obu probówek została prawidłowo połączona. Przenieść bufor do Probówki A. Pustą Probówkę B wyrzucić.
  3. Przeprowadzić fosforylację kulek z przyłączonym pół-linkerem, dodając 70 μl 10 x buforu do ligazy T4 DNA (NEB), 616 μl wody wolnej od nukleaz oraz 14 μl kinazy polinukleotydowej T4 DNA (10 U/μl). Inkubować przez 50 minut w 37 °C przy ciągłym obracaniu.
  4. Odzyskać fosforylowane kuleczki z przyłączonym pół-linkerem za pomocą koncentratora cząstek magnetycznych i odlać mieszaninę reakcyjną.
  5. Eluować kompleks chromatyny-DNA z przyłączonym pół-linkerem za pomocą 200 μl świeżo przygotowanego Buforu do Elucji (bufor TE, 1% SDS). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (22 °C) przy ciągłym obracaniu.
  6. Przenieść eluat do nowej probówki i przepłukać kuleczki 900 μl Buforu EB. Przenieść nadsącz do tej samej probówki, aby połączyć elucje.
  7. Przenieść zebrany eluat do wkładów dwóch filtrów do wirowania i wirować przy 16,110 x g (13,200 rpm) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (22 °C).
  8. Związać SDS, dodając 90 μl 20% Triton X-100, a następnie wymieszać poprzez odwracanie probówki. Inkubować przez 1 godzinę w 37 °C.
  9. Cyrkularyzację przeprowadza się w warunkach ekstremalnie niskiego stężenia, aby sprzyjać ligacji w obrębie pojedynczych sieciowanych kompleksów chromatyny, minimalizując jednocześnie ligację między różnymi kompleksami chromatyny, co mogłoby prowadzić do powstania niepożądanych chimerycznych cząsteczek DNA. Pracując w lodzie, przenieść zneutralizowany eluat do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml i dodać 7776 μl wody wolnej od nukleaz, 1000 μl 10 x Buforu do ligazy T4 DNA (NEB) oraz 33.33 μl ligazy T4 DNA (30 U/μl). Inkubować przez noc w 16 °C.

4. Odwrócenie sieciowania i oczyszczanie DNA

Ten rozdział filmu przedstawia szczegółową procedurę ekstrakcji fenol:chloroform (Krok 4.3, od 17:11 do 17:59) oraz zbliżenie na osad DNA po wirowaniu w Kroku 4.4.

  1. Przeprowadź odwrócenie sieciowania i degradację białek poprzez dodanie 100 μl roztworu Proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml. Inkubuj przez 2 godziny w temperaturze 50 °C.
  2. Przenieś DNA chromatyny do probówki 50 ml MaXtract High Density i dodaj 9 ml wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać objętość końcową 19 ml.
  3. Dodaj do probówki w dygestorium 19 ml mieszaniny Fenol-Chloroform-Alkohol Izopentylowy 25:24:1 o pH 7.9 i wymieszaj przez odwracanie. Wirować probówki przez 5 minut przy 1 800 x g (3 000 rpm) w temperaturze pokojowej.
  4. Przenieś górną fazę wodną do probówki wirówkowej Oak Ridge Centrifuge Tubes (Teflon FEP) o pojemności 50 ml i wytrąć DNA chromatyny za pomocą 1,9 ml 3 M octanu sodu o pH 5.5, 19 ml izopropanolu oraz 5 μl Glycoblue. Glycoblue dodaje się w celu zwiększenia widoczności osadu.
  5. Inkubuj w temperaturze -80 °C przez co najmniej godzinę. Pozostaw zamrożony roztwór do odwilżnięcia przed wirowaniem przy 38 720 x g (18 000 rpm) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Po wirowaniu DNA wytrąconego izopropanolem, przemyj osad DNA dwukrotnie 75% lodowatym etanolem i resuspenduj osad DNA w 34 μl buforu EB. Przenieś mieszaninę DNA do probówki DNA LoBind o pojemności 1,7 ml.
  7. Resuspenduj osad DNA w 34 μl buforu EB.
  8. (Obróbka RNazą jest opcjonalna, ponieważ kolejne etapy przemywania i oczyszczania w protokole ChIA-PET służą usunięciu zanieczyszczeń RNA, a manualna inspekcja sekwencji ChIA-PET z naszych wewnętrznych bibliotek nie wykazała śladów zanieczyszczeń RNA).
    • Przeprowadź trawienie RNazą, dodając 10 μl 10 x Reaction Buffer do RNase ONE, 55 μl wody wolnej od nukleaz oraz 1 μl rybonukleazy RNase ONE o stężeniu 10 U/μl. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez godzinę.
    • Przenieś DNA chromatyny do probówki 2 ml MaXtract High Density. Dodaj do probówki w dygestorium 100 μl mieszaniny Fenol-Chloroform-Alkohol Izopentylowy 25:24:1 o pH 7.9 i wymieszaj przez odwracanie. Wirować probówkę przez 5 minut przy 16 110 x g (13 200 rpm) w temperaturze pokojowej (22 °C).
    • Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki i wytrąć DNA z odwróconym sieciowaniem za pomocą 10 μl 3 M octanu sodu o pH 5.5 oraz 100 μl izopropanolu. Inkubuj w temperaturze -80 °C przez 30 minut, a następnie wytrąć DNA przez wirowanie przez 30 minut przy 16 110 x g (13 200 rpm) w temperaturze 4 °C.
    • Po wirowaniu DNA wytrąconego izopropanolem, przemyj osad DNA dwukrotnie 75% lodowatym etanolem i resuspenduj osad DNA w 34 μl buforu EB.

5. Immobilizacja DNA ChIA-PET na kuleczkach z streptawidyną

Wstęp do tego rozdziału omawia obecność miejsca rozpoznawania MmeI oraz biotynilowanej tymidyny T w oligonukleotydach typu half-linker, co ułatwia ekstrakcję konstruktów tag-linker-tag („PETs”, od 18:02 do 19:10 filmu). Dodatkowo, ten rozdział filmu przedstawia krótki przegląd Kroku 5.2, procedurę krok po kroku przygotowania reakcji PCR (Krok 6.1, od 19:10 do 20:00 filmu) oraz wycinanie prawidłowego fragmentu DNA ChIA-PET (Krok 6.9, od 20:00 do 20:30).

Pół-łączniki A i B zawierają flankujące miejsca rozpoznawania przez MmeI, co pozwala temu enzymowi restrykcyjnemu typu IIS na cięcie 18/20 par zasad w kierunku downstream od miejsc wiązania docelowego w celu wygenerowania krótkich „tagów” fragmentu chromatyny, tworząc sparowane konstrukty tag-łącznik-tag („PETs”).

Aby umożliwić oczyszczanie konstruktów PET za pomocą magnetycznych kulek powlekanych streptawidyną, oba pół-linkery A i B są modyfikowane biotyną, co pozwala na wychwyt i oczyszczanie konstruktów ChIA-PET.

  1. Uwolnić uchwycone DNA ChIA-PET, dodając do resuspenderowanego DNA 5 μl 10 x NEBuffer 4, 5 μl świeżo przygotowanego 500 μM (10 x) S-adenozylometioniny (SAM) oraz 1 μl 2 U/μl MmeI. Zahamować nadmiar MmeI, dodając 5 μl niebiotynylowanych pół-adapterów (half-linkers) do mieszaniny reakcyjnej, ponieważ nadmiar MmeI może działać samohamująco. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. W celu uchwycenia uwolnionego DNA ChIA-PET, przenieść 50 μl resuspenderowanych kulek streptawidynowych M-280 do probówki DNA LoBind. Przemyć kulki dwukrotnie 2 x Buforem do wiązania i przemywania (2 x B&W: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl). Resuspenderować kulki w 50 μl 2 x Buforu B&W i przenieść 50 μl mieszaniny trawiennej (z kroku 5.1) do tej samej probówki. Dobrze wymieszać i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej przy jednoczesnej rotacji.
  3. Odzyskać kulki za pomocą magnetycznego koncentratora cząstek i odrzucić nadsącz. Przemyć kulki dwukrotnie 150 μl 1 x Buforu do wiązania i przemywania (1 x B&W: 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl).
  4. Przyłączyć adaptery 454 GS20 do DNA ChIA-PET, używając 5 μl 10 x Buforu ligazy T4 DNA (należy zauważyć, że bufor ligazy użyty w tym kroku różni się od tego z kroku 3.9; bufor ligazy użyty tutaj pochodzi od tego samego producenta, który dostarcza ligazę T4 DNA), 4 μl 200 ng/μl adaptera 454 GS20 Adaptor A, 4 μl 200 ng/μl adaptera 454 GS20 Adaptor B, 36 μl wody wolnej od nukleaz oraz 1 μl 30 U/μl ligazy T4 DNA. Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C przy jednoczesnej rotacji. DNA ChIA-PET można również liganować z adapterami Illumina-NN, w takim przypadku zaleca się amplifikację biblioteki przy użyciu starterów PCR PE1.0 i PCR PE 2.0 zakupionych od firmy Illumina.
  5. Odzyskać kulki za pomocą magnetycznego koncentratora cząstek i odrzucić nadsącz. Przemyć kulki trzykrotnie 150 μl 1 x Buforu B&W.
  6. Przeprowadzić translację z nacięciem (nick translation) DNA ChIA-PET z użyciem 5 μl 10 x NEBuffer 2, 2.5 μl 10 mM dNTPs, 38.5 μl wody wolnej od nukleaz i 4 μl 10 U/μl polimerazy DNA I z Escherichia coli. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (22 °C) przy jednoczesnej rotacji.
  7. Odzyskać kulki za pomocą magnetycznego koncentratora cząstek i odrzucić nadsącz. Przemyć kulki trzykrotnie 150 μl 1 x Buforu B&W.
  8. Resuspenderować kulki w 50 μl Buforu EB.

6. Amplifikacja DNA ChIA-PET

  1. Przygotować reakcje PCR, dodając 2 μl zawiesiny kulek, 21 μl wody wolnej od nukleaz, 1 μl 10 μM startera Illumina 1-454, 1 μl 10 μM startera Illumina 2-454 oraz 25 μl Phusion High Fidelity Master Mix.
  2. Aby określić liczbę cykli niezbędną do wygenerowania wystarczającej ilości produktów PCR do sekwencjonowania, przygotować trzy testowe reakcje PCR z 16, 18 i 20 cyklami. Nie przekraczać 20 cykli, ponieważ ustalono, że prowadzi to do bardzo niskiej złożoności biblioteki.
Krok wstępny30 seconds98 °C(denaturacja)
18 do 25 cykli10 seconds 98 °C(denaturacja)
 30 seconds65 °C(przyłączanie)
 30 seconds 72 °C(elongacja)
Krok końcowy5 minutes72 °C(elongacja końcowa)
  1. Wyznacz najniższą możliwą liczbę cykli, przeprowadzając reakcje PCR na żelu TBE z gradientem 4-20% i barwiąc go SYBR Green I, aby upewnić się pod względem obecności prążka o długości 223 par zasad, która odpowiada długości DNA ChIA-PET.
  2. Wzmocnij pozostałe paciorki streptawidyny z wiązanym DNA ChIA-PET w PCR w dużej skali, stosując jak najmniejszą liczbę cykli PCR, która nadal pozwoli na uzyskanie wydajności wystarczającej do sekwencjonowania.
  3. Odzyskaj paciorki ze wszystkich reakcji PCR za pomocą magnetycznego koncentratora cząstek i połącz nadsącz do dwóch świeżych probówek DNA LoBind. Wytrąc z każdej probówki nadsączu, dodając 60 μl 3 M octanu sodu, 2 μl GlycoBlue oraz 600 μl izopropanolu do połączonych reakcji.
  4. Inkubuj w temperaturze -80 °C przez 30 minut. Wirowuj przy 16,110 x g (13,200 rpm) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Po wirowaniu DNA wytrąconego izopropanolem, przemyj osad DNA dwukrotnie 75% lodowatym etanolem i zawieś ponownie osad DNA w 100 μl buforu TE oraz 5 μl 6 x barwnika do ładowania.
  6. Rozdziel produkty PCR równomiernie w dołkach żelu TBE 6%. Prowadź elektroforezę w buforze 1 x TBE przy 200 V przez 35 minut i zabarw żel SYBR Green I. Wizualizuj żel za pomocą transiluminatora Dark Reader.
  7. Ostrożnie wytnij z żelu prążek 223 bp i przeprowadź protokół ekstrakcji DNA metodą „gel crush” w następujący sposób:
    • Umieść wycięte fragmenty żelu w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 ml, których dno zostało przebite igłą 21-G.
    • Umieść każdą probówkę wewnątrz probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 16,110 x g (13,200 rpm) przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    • Dodaj 200 μl buforu TE pH 8,0 do każdej probówki i upewnij się, że kawałki żelu są całkowicie zanurzone w buforze.
    • Zamroź w temperaturze -80 °C na godzinę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
    • Przenieś kawałki żelu wraz z buforem z każdej probówki do koszyczka filtrującego probówki do wirowania i wiruj przy 16,110 x g (13,200 rpm) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    • Przepłucz każdą probówkę 1,5 ml 200 μl buforu TE pH 8,0 i przenieś bufor płuczący do każdej jednostki filtrującej po zakończeniu pierwszego wirowania.
    • Połącz filtraty i wytrąć za pomocą izopropanolu.
    • Zawieś ponownie osad DNA w 15 μl buforu TE.

7. Kontrola jakości i amplifikacja DNA z ChIA-PET

  1. Przeprowadź kontrolę jakości, stosując Agilent DNA 1000 Assay lub Agilent High Sensitivity DNA Assay na systemie Agilent Bioanalyzer 2100.
  2. Elektroferogram z analizy Agilent DNA powinien wykazywać tylko jeden pik oraz płaską linię bazową przed przystąpieniem do sekwencjonowania na systemie Illumina Genome Analyzer IIx.
  3. Przed sekwencjonowaniem na systemie Illumina Genome Analyzer IIx DNA z ChIA-PET powinno mieć optymalnie minimalne stężenie 10 nM. Wykonaj 4-punktowe ilościowe PCR zgodnie z podręcznikiem Illumina qPCR Quantification Protocol Guide, aby określić ilość próbki do naniesienia na celę przepływową. Alternatywnie wykonaj jednopunktowe ilościowe PCR w następujący sposób:
    • Rozcieńcz matrycę kontrolną do stężeń 100 pM, 10 pM i 1 pM. Zgodnie z opisem w Illumina qPCR Quantification Protocol, matryca kontrolna to dowolna biblioteka przygotowana do sekwencjonowania na platformie Illumina, która powinna być jak najbardziej zbliżona pod względem wielkości matrycy, zawartości GC i typu biblioteki.
    • Rozcieńcz DNA z ChIA-PET do stężenia 10 pM.
    • Przygotuj triplikaty PCR dla każdego rozcieńczenia, zawierające 0,1 μl qPCR Primer 1.1, 0,1 μl qPCR Primer 2.1, 5 μl LightCycler480 DNA SYBR Green I Master Mix, 3,8 μl wody wolnej od nukleaz oraz 1 μl matrycy, korzystając z systemu Roche Applied Science LightCycler 480 Real-Time PCR. Uwzględnij dwie kontrole negatywne, stosując 1 μl wody wolnej od nukleaz jako matrycę.
      • Denaturacja wstępna
        • 95 °C 5 minut 4,8 °C/s
      • Amplifikacja
        • 95 °C 10 sekund 4,8 °C/s
        • 60 °C 1 minuta 2,5 °C/s
        • 72 °C 30 sekund 4,8 °C/s
      • Krzywa topnienia
        • 95 °C 5 sekund 4,8 °C/s
        • 65 °C 1 minuta 2,5 °C/s
        • 95 °C 5 akwizycji na °C
      • Chłodzenie
        • 40 °C 10 sekund 2,0 °C/s
    • Przed obliczeniem stężenia matryc biblioteki na podstawie krzywej wzorcowej wygenerowanej z rozcieńczeń matrycy kontrolnej upewnij się, że kontrole negatywne nie wykazują amplifikacji, a odchylenie standardowe dla wartości Ct jest mniejsze niż 0,1.
  4. Wygeneruj klastry na powierzchni cel przepływowych Illumina, nanosząc 1,5 pM do systemu Illumina cBot Cluster Generation System zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
  5. Przystąp do sekwencjonowania DNA z ChIA-PET na systemie Illumina Genome Analyzer IIx, używając Illumina 3-454 sequencing primer i Illumina 4-454 sequencing primer w jednym kanale, aby ocenić jakość biblioteki. Pozostałe DNA z ChIA-PET przechowuj w temperaturze -20 °C. Jeśli biblioteka dostarcza dobre dane, przygotuj próbkę do dodatkowych przebiegów w 4 do 8 kanałach, zależnie od wyników z kanału próbnego, aby uzyskać od 18 do 20 milionów unikalnych odczytów.
    • Ilość DNA z ChIA-PET naniesiona na cele przepływowe w dużym stopniu zależy od wersji oprogramowania do analizy danych sekwencjonowania, Illumina Sequencing Control Studio. Dla wersji 2.9 stężenie nanoszenia wynosi od jednej trzeciej do połowy maksymalnej pojemności każdego kafelka, co odpowiada około 21 milionom odczytów po filtrowaniu (pass filtered reads), z czego około 9,5 miliona to odczyty PET.
    • Zmniejszone obciążenie jest konieczne, aby zapewnić prawidłowe odczytywanie zasad (base-calling) dla sekwencji kodów kreskowych linkerów. Błąd ten występuje, gdy sekwencjonowana jest duża liczba podobnych nukleotydów, co ma miejsce podczas sekwencjonowania linkera w celu uzyskania informacji o kodowaniu. Jeśli informacje o kodowaniu nie są wymagane i linkery nie są odczytywane, można zastosować pełne stężenie nanoszenia.
  6. Pliki qSeq przekonwertowane przez offline base caller mogą być dalej analizowane za pomocą narzędzia ChIA-PET zgodnie z instrukcją instalacji ChIA-PET Tool (Wersja 4.1) 8.  

C. Reprezentatywne wyniki ChIA-PET

Z sukcesem skonstruowano biblioteki ChIA-PET z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko polimerazie RNA II (8WG16) w komórkach MCF-7 (CHM160 i CHM163) 9, używając 672 ng materiału ChIP zgodnie z powyższym opisem. Wstępna elektroforeza diagnostyczna tej biblioteki amplifikowanej metodą PCR, wspomniana w kroku 6.2 protokołu ChIA-PET, wykazała jasny i wyraźny prążek o oczekiwanej wielkości 223 par zasad dla wszystkich zastosowanych cykli PCR (patrz Rycina 4).

Do amplifikacji biblioteki ChIA-PET wykorzystano 16 cykli PCR, uzyskując całkowitą wydajność 17,1 ng. W analizie Agilent DNA 1000, zgodnie z krokiem 7.1 protokołu ChIA-PET, zaobserwowano pojedynczy, intensywny piki elektroferogramu o oczekiwanej wielkości 223 par zasad (patrz Rysunek 5).  

Schemat immunoprecypitacji chromatyny; przedstawia lizę komórek, sonikację, powlekanie kulek, immunoprecypitację.
Rysunek 1. Przegląd metody ChIP. Komórki MCF-7 poddano sekwencyjnemu podwójnemu sieciowaniu przy użyciu EthylGlycol bis(SuccinimidylSuccinate (EGS) i formaldehydu, co doprowadziło do powstania wiązań kowalencyjnych między przestrzennie sąsiadującymi fragmentami chromatyny. Sieciowaną chromatynę uzyskano z utrwalonych komórek MCF-7 poprzez lizę komórkową i lizę jąder komórkowych. Następnie chromatynę poddano fragmentacji do rozmiaru od 200-600 par zasad. Po wstępnym oczyszczaniu sonikowanej chromatyny za pomocą magnetycznych kulek z białkiem G w celu usunięcia nieswoistego DNA, wstępnie oczyszczoną chromatynę poddano immunoprecypitacji przez noc z wykorzystaniem kulek powlekanych przeciwciałami w celu wychwycenia interesującej chromatyny.

Wyniki elektroforezy; obraz żelu; prążki DNA; porównanie ekspozycji; drabinka; analiza masy cząsteczkowej.
Rycina 2. Analiza żelowa fragmentów chromatyny poddanych sonikacji. W pierwszej i ostatniej ścieżce przedstawiono drabinkę DNA 100 bp jako odniesienie wielkości. Sonikowana chromatyna wykazała silną intensywność w zakresie od 200 do 600 bp, co jest optymalne do uchwycenia dalekosiężnych oddziaływań chromatyny.

Schemat procesu przygotowania DNA ChIP; ligacja, elucja, trawienie, z użyciem kulek streptawidynowych.
Rysunek 3. Przegląd metody ChIA-PET. Fragmenty pofragmentowanej chromatyny są wyrównywane na końcach i ligowane z biotynylowanymi pół-linkerami zawierającymi flankujące miejsca restrykcyjne MmeI. Następnie nienaruszone kompleksy chromatyny są eluowane z kulek i poddawane ligacji bliskościowej w warunkach ekstremalnego rozcieńczenia, tak aby oddziałujące fragmenty DNA były preferencyjnie ligowane ze sobą. Po odwróceniu sieciowania w celu usunięcia białek związanych z DNA, przeprowadza się trawienie enzymem MmeI, aby uwolnić konstrukty tag-linker-tag (PET), które następnie są oczyszczane poprzez selektywne wiązanie z kulkami streptawidynowymi. Konstrukty PET są ligowane z adapterami do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.

Elektroforeza żelowa wykazująca prążki DNA z markerem 100bp, z zaznaczonymi rozmiarami fragmentów 223bp i 125bp.
Rycina 4. Analiza żelowa ChIA-PET po amplifikacji PCR. W ścieżkach 1 i 5 pokazano marker DNA 25 bp jako odniesienie wielkości. Ścieżki od 2 do 4 zawierają produkty PCR uzyskane odpowiednio po 16, 18 i 20 cyklach amplifikacji PCR z 2 μl matrycy unieruchomionej na kuleczkach. Jest to poprawnie przygotowana biblioteka, co wskazują jasne, wyraźne prążki o oczekiwanej wielkości 223 bp. Niespecyficzny smear powstaje w wyniku zwiększenia liczby cykli PCR, natomiast najniższy prążek w każdej reakcji PCR jest utworzony przez dimery starterów.

Schemat elektroforezy z analizą piku, markerami wielkości DNA, stężeniem i wynikami molarności.
Rysunek 5. Analiza oczyszczonych ChIA-PETs z ligacją adapterów Illumina-454 za pomocą Agilent 2100 Bioanalyzer. Zrzut ekranu elektroferogramów z urządzenia Agilent 2100 Bioanalyzer przedstawiający profil udanej biblioteki z pojedynczym intensywnym pikiem o oczekiwanej wielkości 223 bp. Należy zauważyć, że analiza Agilent Bioanalyzer zazwyczaj wykazuje wielkość nieco wyższą niż oczekiwana; w tym przypadku pożądany pik wyświetla się przy 237 bp zamiast 223 bp. Mieści się to w 10% zakresie błędu analizy Agilent.

Dyskusja

ChIA-PET to metoda opracowana w celu identyfikacji długozasięgowych oddziaływań w regulacji transkrypcji. Jednym z krytycznych czynników determinujących jakość biblioteki ChIA-PET jest jakość materiału ChIP.

Protokół przedstawiony w filmie obejmuje zastosowanie EGS i formaldehydu do sieciowania komórek. Użycie formaldehydu w połączeniu z drugim odczynnikiem sieciującym o dłuższym ramieniu łącznikowym może pomóc w wiązaniu białek, które nie mogłyby zostać związane samym formaldehydem 3,11,15. Za pomocą tej metody opracowaliśmy biblioteki, które wykazały obecność stabilnych miejsc wiązania oraz oddziaływań dalekiego zasięgu 9. Należy jednak zoptymalizować warunki sieciowania i ChIP dla każdego badanego czynnika; ważne jest, aby nie doprowadzić do nadmiernego sieciowania, ponieważ może ono spowodować trudności w fragmentacji metodą sonikacji oraz potencjalnie doprowadzić do powstania pozornych oddziaływań chromatyny. Oddziaływania chromatyny zidentyfikowane metodą ChIA-PET powinny zostać zweryfikowane inną metodą, taką jak fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ 4.

Zalecamy użycie co najmniej 100 ng materiału chromatynowego. Choć udało nam się przygotować wysokiej jakości biblioteki z 50 ng materiału chromatynowego, zaobserwowaliśmy, że duże ilości materiału wyjściowego pozwoliły na konstrukcję bibliotek ChIA-PET przy zastosowaniu mniej niż 16 cykli PCR, co zminimalizowało powstawanie amplikonów i redundancję każdej biblioteki. Niższa redundancja korelowała z większą liczbą unikalnych zmapowanych tagów oraz wysokim odsetkiem użytecznych danych, co umożliwiło stworzenie bardziej kompleksowej mapy oddziaływań chromatyny przy mniejszej liczbie ścieżek sekwencjonowania. Końcowa objętość upakowanych kulek w każdej probówce powinna wynosić odpowiednio 50 μl dla kulek magnetycznych i 100 μl dla kulek Sepharose. Jeśli objętość upakowanych kulek jest mniejsza niż wskazano, należy uzupełnić ją do minimalnej objętości, stosując analogicznie oczyszczone puste kulki magnetyczne lub Sepharose, aby zminimalizować stratę kulek niosących DNA w kolejnych etapach. Do pipetowania kulek Sepharose należy używać końcówek o odciętym czubku lub końcówek z szerokim otworem (large-core tips).

Wprowadzono następujące modyfikacje w odniesieniu do wcześniej opublikowanego protokołu ChIA-PET 5. Po pierwsze, zastosowano magnetyczne kulki G, aby zminimalizować ubytki próbki podczas etapów przemywania. Ponadto zidentyfikowano nieswoiste prążki o przybliżonych rozmiarach 100 bp i 138 bp jako amplikony samoligowanych półłączników i/lub adaptorów. W związku z tym zmniejszono stężenie biotynylowanych półłączników oraz adaptorów 454 GS20, aby zminimalizować powstawanie nieswoistych prążków podczas amplifikacji PCR. Objętość ligacji bliskościowej zmniejszono z 50 ml do 10 ml, aby ograniczyć straty próbki podczas kolejnych etapów oczyszczania oraz zredukować koszty odczynników. Wydłużono również czas inkubacji w celu unieruchomienia DNA ChIA-PET na kulkach, aby zapewnić maksymalne wychwycenie DNA ChIA-PET przez kulki streptawidynowe.

Podczas etapu ligacji bliskości nieuchronnie powstają ligacje chimeryczne, które nie reprezentują rzeczywistych oddziaływań chromatyny in vivo, a generowane są w sposób nieswoisty i losowy. Z tego powodu, aby ocenić jakość danych z dowolnego eksperymentu ChIA-PET, stopień chimeryzmu szacuje się przy użyciu dwóch różnych półlinkerów ze specyficznymi kodami kreskowymi nukleotydów TAAG i ATGT 5. Po sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym sekwencje ChIA-PET są najpierw analizowane pod kątem składu kodów kreskowych linkerów, co pozwala na rozróżnienie sekwencji pochodzących ze specyficznych produktów ligacji od tych pochodzących z nieswoistych produktów ligacji 8. Procent znanych chimer (tj. heterodimerów linkerów AB) obecnych w naszych wewnętrznych bibliotekach ChIA-PET polimerazy RNA II dla linii MCF-7 wynosi mniej niż 15%.

Sekwencje ChIA-PET są następnie klasyfikowane w dwóch kategoriach: PET-ów samoligancyjnych (self-ligation PETs) oraz PET-ów interligancyjnych (inter-ligation PETs). PET-y samoligancyjne powstają w wyniku ligacji z samoczynną cyrkularyzacją fragmentów chromatyny, podczas gdy PET-y interligancyjne pochodzą z ligacji między dwoma różnymi fragmentami DNA. Te ostatnie są następnie dzielone na trzy różne kategorie w zależności od tego, czy odległość genomowa każdego tagu przypada na ten sam chromosom (intrachromosomalne PET-y interligancyjne), czy też oba tagi są mapowane na dwa różne chromosomy (interchromosomalne PET-y interligancyjne). Opracowaliśmy pakiet oprogramowania ChIA-PET tool do sortowania tych różnych kategorii 8. Proces ten opiera się na fragmentach DNA znajdujących się w bibliotece. Zazwyczaj mniejsze fragmenty ChIP zapewniają wyższą rozdzielczość, a wartość odcięcia dla tych bibliotek ChIA-PET polimerazy RNA II wynosi około 4 kb.

Ponadto rzeczywiste oddziaływania chromatyny można odróżnić od szumu losowego poprzez zliczenie liczby PET-ów interligacyjnych w klastrze oddziaływań; innymi słowy, przyjmuje się, że klaster o wysokiej liczbie PET-ów ma większe prawdopodobieństwo bycia rzeczywistym oddziaływaniem chromatyny 8.

Aby odfiltrować wyniki fałszywie dodatnie wynikające z silnie wzbogaconych kotwic, które mogą tworzyć między-ligacyjne PET w wyniku przypadku, sformułowano również ramy analizy statystycznej w celu uwzględnienia przypadkowego powstawania wszelkich między-ligacyjnych PET pomiędzy dwiema kotwicami 8.

Podsumowując, technika ChIA-PET pozwala na mapowanie sieci oddziaływań chromatyny w skali globalnej. Zastosowanie ChIP w metodzie ChIA-PET umożliwia redukcję złożoności biblioteki oraz szumu tła. Dodatkowo ChIP zwiększa specyficzność oddziaływań chromatyny, co pozwala na badanie konkretnych interakcji chromatynowych związanych z określonymi czynnikami transkrypcyjnymi 5.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy otrzymali wsparcie od A*STAR z Singapuru. Ponadto M.J.F. otrzymała wsparcie w ramach A*STAR National Science Scholarship, L'Oreal For Women in Science National Fellowship oraz Lee Kuan Yew Post-Doctoral Fellowship. Y.R. jest wspierany przez granty NIH ENCODE (R01 HG004456-01 oraz R01 HG003521-01). Autorzy dziękują również zespołowi filmowców z 8 Pixels Productions w Singapurze, w szczególności panu Kelvinowi Isseyowi, panu Chang Kai Xiangowi i panu Sherwinowi Ganowi za nagranie scen, pani Siti Rahim za montaż wideo oraz pani Michelle Teo za lektora.

Bibliografia

  1. Cai, S., Lee, C. C. SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes. Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).
  2. Cook, P. R. The organization of replication and transcription. Science. 284, 1790-1795 (1999).
  3. Das, P. M., Ramachandran, K. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37, 961-969 (2004).
  4. Deng, W., Blobel, G. A. Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).
  5. Fullwood, M. J., Han, Y. Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).
  6. Fullwood, M. J., Liu, M. H. An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature. 462, 58-64 (2009).
  7. Jackson, D. A., Hassan, A. B. Visualization of focal sites of transcription within human nuclei. EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).
  8. Li, G., Fullwood, M. J. ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing. Genome Biol. 11, R22(2010).
  9. Li, G., Ruan, X. Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation. Cell. 148, 84-98 (2012).
  10. Ng, P., Wei, C. L. Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).
  11. Nowak, D. E., Tian, B. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  12. Osborne, C. S., Chakalova, L. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).
  13. Rippe, K., von Hippel, P. H. Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription. Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).
  14. Schoenfelder, S., Sexton, T. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).
  15. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694-698 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protok ChIA PETimmunoprecypitacja chromatynyligacja zbli eniowasekwencjonowanie nowej generacjifragmentacja chromatynyoczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychtrawienie enzymami restrykcyjnymi
Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.