Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Podsumowanie

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Streszczenie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i jest wykorzystywane jako model zwierzęcy do badania ludzkiej choroby demielinizacyjnej – stwardnienia rozsianego (SM). EAE charakteryzuje się patologiczną infiltracją komórek jednojądrowych do OUN oraz klinicznymi objawami postaci porażennej. Podobnie jak w przypadku SM, EAE podlega kontroli genetycznej, w tym sensie, że niektóre szczepy myszy są podatne na indukcję choroby, podczas gdy inne wykazują oporność. Zazwyczaj myszy C57BL/6 (H-2^b) immunizowane białkiem zasadowym mieliny (MBP) nie wykazują objawów porażennych. Brak tej odpowiedzi nie wynika z defektów w przetwarzaniu lub prezentacji antygenu MBP, ponieważ opisany tutaj protokół eksperymentalny został wykorzystany do indukowania ciężkiego EAE u myszy C57BL/6, a także u innych uznawanych za oporne szczepów myszy. Ponadto z sukcesem wyizolowano i namnożono encefalitogenne klony limfocytów T reaktywnych wobec MBP pochodzące od myszy C57BL/6 i Balb/c.

Protokół eksperymentalny opiera się na wykorzystaniu systemu komórkowego transferu adopcyjnego, w którym komórki węzłów chłonnych dawcy C57BL/6, uwrażliwione na MBP (200 μg/mysz), są izolowane i hodowane przez pięć dni z antygenem w celu zwiększenia populacji limfocytów T specyficznych dla MBP. Po zakończeniu okresu hodowli 50 milionów żywych komórek jest przenoszonych do naiwnych biorców syngenicznych poprzez żyłę ogonową. Myszy biorcy poddane takiej procedurze zazwyczaj nie rozwijają EAE, co potwierdza ich status oporny; mogą one pozostawać w stanie prawidłowym w nieskończoność. Dziesięć dni po transferze komórek myszy biorcy są poddawane wyzwaniu za pomocą MBP w emulsji z pełnym adiuwantem Freunda (CFA), aplikowanym w czterech miejscach na bokach ciała. Ciężka postać EAE zaczyna rozwijać się u tych myszy od dziesięciu do czternastu dni po wyzwaniu. Wyniki wykazały, że indukcja choroby była specyficzna antygenowo, ponieważ wyzwanie nieistotnymi antygenami nie wywołało klinicznych objawów choroby. Co istotne, miareczkowanie dawki antygenu stosowanej do wyzwania myszy biorczych wykazało, że może ona być tak niska jak 5 μg/mysz. Dodatkowo badanie kinetyki czasu wyzwania antygenowego wykazało, że wyzwanie indukujące chorobę było skuteczne już 5 dni po transferze komórek, a także po ponad 445 dniach. Dane te silnie wskazują na udział „długożyjącej” populacji limfocytów T w utrzymywaniu braku odpowiedzi. Udział regulatorowych limfocytów T (Tregs) w tym systemie nie został określony.

Protokół

1. Przygotowanie antygenu emulgowanego w CFA

1. Rozpuścić MBP świnki morskiej (przygotowane zgodnie z metodą Swanborga1 i przechowywane w formie liofilizowanej w temperaturze 4 °C) w roztworze buforu fosforanowego (PBS) do stężenia 2 mg/mL. W przypadku użycia syntetycznych peptydów MBP (MBP_60-80, S H H A A R T T H Y G S L P Q K S Q R)², przygotować roztwór o stężeniu 2 mg/mL. Pobrać odpowiednią ilość roztworu antygenu (0,1 mL na jedną mysz do immunizacji) do szklanej strzykawki z końcówką luer-lok.
2. Pobrać do drugiej szklanej strzykawki z końcówką luer-lok objętość pełnego adjuwantu Freunda H37Ra (0,1WT%) (CFA, Difco Laboratories) równą objętości roztworu antygenu.
3. Połączyć obie szklane strzykawki za pomocą kurka trójdrożnego. Wymieszać roztwór MBP z CFA, przesuwając tłoki tam i z powrotem. Powtarzać ten ruch do momentu utworzenia się emulsji.
4. Aby sprawdzić, czy emulsja została utworzona, przetłoczyć całą mieszaninę do jednej strzykawki. Odłączyć pustą strzykawkę, lekko cofnąć tłok i wpuścić kroplę pozostałej emulsji do zlewki z czystą wodą w temperaturze pokojowej. Jeśli kropla emulsji pozostanie nienaruszona na powierzchni wody, oznacza to, że emulsja została utworzona. Jeśli kropla emulsji się rozproszy, ponownie połączyć strzykawki i kontynuować mieszanie.
5. Do procesu immunizacji użyć plastikowej strzykawki o pojemności 1 mL, aby zapewnić podanie dokładnej dawki antygenu. Aby przenieść emulsję antygenu do plastikowej strzykawki, należy wyciągnąć tłok i włożyć pustą plastikową strzykawkę do otworu kurka trójdrożnego, z którego odłączono wcześniej szklaną strzykawkę zgodnie z punktem 1.4.
6. Napełnić plastikową strzykawkę aż po krawędź, naciskając tłok szklanej strzykawki. Włożyć z powrotem tłok plastikowej strzykawki i wypchnąć nadmiar emulsji, aż do osiągnięcia kreski 1,2 mL na plastikowej strzykawce. Manewr ten gwarantuje, że wewnątrz plastikowej strzykawki nie uwięziony zostanie pęcherzyk powietrza.
7. Odłączyć plastikową strzykawkę od kurka trójdrożnego. Do plastikowej strzykawki przymocować igłę o rozmiarze #26 G. Przesunąć tłok do kreski 1 mL, tak aby emulsja wypełniła przestrzeń wewnątrz igły.

2. Immunizacja myszy dawców

Uwaga: Samicom myszy C57BL/6 zazwyczaj wstrzykuje się emulsję antygenową w czterech miejscach w okolicach boków, zgodnie z metodami opracowanymi pierwotnie przez grupę McFarlina³ w National Institutes of Health. Doświadczony badacz może wykonać całą procedurę samodzielnie. Osoby początkujące mogą poprosić o pomoc, tak aby jedna osoba trzymała mysz, a druga wykonywała iniekcję. Alternatywnie mysz można znieczulić przed wykonaniem zastrzyku.

1. Mocno chwyć mysz za skórę karku, a ogon odsuń między 4.^th a 5.^th palcem tak, aby klatka piersiowa i brzuch były łatwo dostępne.
2. Umieść igłę plastikowej strzykawki 1mL w miejscu na klatce piersiowej nieco powyżej prawej pachy (myszy) i wstrzyknij podskórnie 0,05 mL emulsji antygenu. Przez bladą skórę powinno być widoczne niewielkie wybrzuszenie białawego CFA. Powtórz tę czynność w miejscu na klatce piersiowej nieco powyżej lewej pachy.
3. Zwolnij ogon, chwyć prawą stopę (myszy), obróć ją i przytrzymaj między 4.^th a 5.^th palcem. Zlokalizuj miejsce tuż poniżej klatki piersiowej w prawym boku i wstrzyknij 0,05 mL emulsji antygenu.
4. Zwolnij prawą stopę, obróć mysz w drugą stronę i przytrzymaj lewą stopę (myszy) między 4.^th a 5.^th palcem. Zlokalizuj miejsce tuż poniżej klatki piersiowej w lewym boku i wstrzyknij 0,05 mL emulsji antygenu.
5. Wymień igłę na nową po zaszczepieniu 10 myszy lub w przypadku stępienia igły.

3. Izolacja komórek węzłów chłonnych do hodowli tkankowej od 7 do 10 dni po immunizacji

1. Od siedmiu do 10 dni po immunizacji uśmierć myszy i pobierz drenujące węzły chłonne. Preferowaną metodą eutanazji jest inhalacja CO₂. Po uśmierceniu ułóż mysz na plecach na stole sekcyjnym z rozciągniętymi kończynami, przymocowując je do podłoża szpilkami. Myszy zwilża się rozpylonym 70% etanolem.
2. Za pomocą sterylnych nożyczek i pęset wykonaj podłużne nacięcie skóry w linii środkowej, od dolnej części brzucha aż do podbródka.
3. Nacinaj skórę brzucha od okolic pachwin w dół w stronę każdej z nóg. Odchyl skórę i przymocuj ją szpilkami, aby odsłonić węzły chłonne pachwinowe.
4. Nacinaj skórę wzdłuż przednich kończyn (lewej i prawej) w taki sposób, aby można było ją odchylić i przymocować szpilkami, odsłaniając węzły chłonne pachowe w okolicach pach.
5. Używając dwóch par pęset, usuń tkankę łączną pokrywającą i otaczającą węzły chłonne pachwinowe. Po oczyszczeniu z tkanki łącznej wsuń jedną pęsetę pod węzeł chłonny i odciągnij go od ciała. Umieść węzły chłonne w 35 mm szalce Petriego wypełnionej sterylnym PBS.
6. Za pomocą dwóch par pęset usuń tkankę łączną pokrywającą dwa węzły chłonne pachowe. Wyizoluj węzły chłonne i umieść je w szalce Petriego. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przerwać naczyń krwionośnych przecinających ten obszar, ponieważ krwawienie znacznie utrudnia identyfikację węzłów chłonnych.
7. Po zebraniu wszystkich węzłów chłonnych przenieś szalkę Petriego do komory z laminarnym przepływem powietrza. Rozdrobnij i rozdziel węzły chłonne za pomocą dwóch par pęset, rozcierając je o siebie. Alternatywnie można rozbić węzły chłonne, dociskając płaską końcówkę tłoka plastikowej strzykawki 3 mL do węzłów chłonnych znajdujących się na dnie szalki Petriego.
8. Przepuść uzyskaną zawiesinę komórek węzłów chłonnych przez nylonowe sito, aby usunąć błony i zanieczyszczenia.
9. Uzupełnij objętość zawiesiny komórek węzłów chłonnych do 50 mL za pomocą sterylnego PBS. Wirować przy 1000 rpm przez 10 mins. Osad resuspenduj w pożywce hodowlanej. Wykonaj pomiar liczby żywych komórek i dostosuj stężenie do 4 x 10⁶ cells/mL. Użyj RPMI 1640 uzupełnionego o 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu MEM, 0,1 mM nieessentialnych aminokwasów MEM, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 10 mM buforu Hepes i 5 x 10^-5 M 2-ME. Podgrzej pożywkę przed resuspensją komórek.
10. Hoduj komórki w 24-dołkowych płytkach hodowlanych z objętością 2 mL na dołek (końcowe stężenie komórek 8 x 10⁶ cells/well). Do każdego dołka dodaj antygen do końcowego stężenia 100 μg/mL. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂. Inkubuj komórki przez 5 dni.

4. Pozyskiwanie hodowlanych komórek węzłów chłonnych 5 dni po zainicjowaniu kultur

1. Wymieszaj komórki w każdej studzience, pipetując je w górę i w dół za pomocą szklanej pipety Pasteura lub pipety o małej objętości. Zbierz komórki do probówki do wirowania o pojemności 50 mL.
2. Wiruj komórki przy 1000 rpm przez 10 mins. Resuspenduj osad komórkowy w małej objętości PBS.
3. Policz komórki i dostosuj stężenie żywych komórek do 2.5 x 10⁸ cells/mL za pomocą sterylnego PBS. Pobierz komórki do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze #26 gauge.
4. Umieść lampę grzewczą nad klatką myszy biorących, aby wspomóc rozszerzenie żyły ogonowej.
5. Za pomocą uchwytu do myszy wysuń ogon myszy przez szczelinę w uchwycie. Pociągnij, aby wyprostować ogon. Zlokalizuj żyłę.
6. Wstrzyknij 0.2 mL/mysz zawiesiny komórkowej, co odpowiada 5 x 10⁷ cells.

5. Wyzwanie antygenowe myszy biorców 20 dni po transferze komórek i rozwój objawów choroby

1. Poddać myszy biorcze, niewykazujące objawów choroby, stymulacji antygenowej. Procedury są takie same jak w sekcji 2 pt. „Immunizacja myszy dawców”.
2. Obserwować rozwój choroby porażennej od 7 do 10 dni po stymulacji antygenowej.
   1. Choroba rozpoczyna się od osłabienia ogona. Stopień 1 choroby stwierdza się, gdy ogon staje się wiotki. Stopień 2 choroby stwierdza się, gdy występuje porażenie jednej kończyny tylnej. Stopień 3 choroby stwierdza się, gdy obie kończyny tylne są porażone i mysz wlecze je podczas poruszania się do przodu. Stopień 4 choroby stwierdza się, gdy mysz traci sprawność obu kończyn przednich, co prowadzi do całkowitego unieruchomienia. Stopień 5 choroby stwierdza się, gdy mysz jest w stanie agonalnym, a jej ciało zwija się. Śmierć klasyfikuje się jako stopień 6 choroby⁴.
3. EAE specyficzna dla MBP indukowana u myszy C57BL/6 zgodnie z niniejszym protokołem ma charakter monofazowy. Myszy mogą wyzdrowieć, ale nie dochodzi u nich do spontanicznych nawrotów choroby.

6. Reprezentatywne wyniki

Myszy, które otrzymały przygotowane i namnożone in vitro komórki węzłów chłonnych dawcy, nie rozwinęły objawów choroby EAE, co odzwierciedla ich odporność na indukcję choroby. Jednak po stymulacji antygenowej rozwinęła się ciężka postać choroby (Tabela I), co demonstruje zdolność stymulacji antygenowej do zniesienia mechanizmu odporności. Dwie zauważone szczególne cechy stymulacji antygenowej to dawki antygenu oraz kinetyka stymulacji niezbędna do wywołania choroby. Zgodnie z Tabelą III, wymagana jest bardzo niska dawka antygenu. Co zaskakujące, u myszy, które otrzymały komórki dawcy rok wcześniej, nadal mogła rozwinąć się ciężka postać choroby po stymulacji antygenem (Tabela IV). Te dwie obserwacje silnie sugerują udział „długożyjących” limfocytów T w utrzymywaniu odporności na EAE. Niniejszy protokół ma zastosowanie do wielu szczepów myszy odpornych na EAE⁴.

Rycina 1. Schemat blokowy projektu eksperymentalnego dla indukcji EAE u uznanych za oporne szczepów myszy.

		Kliniczne EAE po transferze adoptywnym			Kliniczne EAE po stymulacji antygenowej
Szczep	Antygen	częstość występowania	Śr. stopień choroby (zakres)	Śr. dzień wystąpienia (zakres)	Częstość występowania	Śr. stopień choroby (zakres)	Śr. dzień wystąpienia (zakres)
SJL	MBP	21/21	4.0 (3-5)	8.0 (6-10)	N.D.	N.D.	N.D.
C57BL/6	MBP	0/10	- -	- -	7/7	3.85 (3-5)	9.28 (9-10)
Balb/c	MBP	0/7	- -	- -	5/5	3.2 (3-4)	7.0 (7)
C3H/HeJ	MBP	0/7	- -	- -	4/4	3.2 (3-4)	8.0 (8)
C57BL/6	MBP60-80	0/4	- -	- -	4/4	2.75 (2-4)	10.2 (9-11)

Tabela I. Indukcja EAE zapśredniczonej przez MBP u myszy C57BL/6. Adoptywny transfer uwrażliwionych i namnożonych in vitro komórek donora nie indukował EAE u myszy C57Bl/6. Wyzwanie antygenowe po transferze komórek uczyniło myszy podatnymi na indukcję choroby. Av., średnia. N.D., nie wykonano.

		Kliniczne EAE po stymulacji antygenowej
Antygen pierwotny	Antygen stymulujący	Częstość występowania	Śr. stopień zaawansowania choroby (zakres)	Śr. dzień wystąpienia objawów (zakres)
MBP-CFA	Samo CFA	0/3	- -	- -
MBP-CFA	OVA-CFA	0/3	- -	- -
MBP-CFA	MBP-CFA	3/3	4.0 (4.0)	7.7 (7-9)

Tabela II. Specyficzność wyzwania antygenowego. Myszy biorcze zostały poddane wyzwaniu antygenem primującym oraz innymi, niepowiązanymi antygenami. Tylko antygen primujący wywołał ciężki przebieg choroby. OVA: owalbumina z jaja kurzego. Av., średnia.

		Kliniczna postać EAE po podaniu antygenu
Dawki antygenu (μg/mysz)	Częstość występowania	Śr. stopień zaawansowania choroby (zakres)	Śr. dzień wystąpienia objawów (zakres)
200	4/4	3.75 (3-4)	8.25 (7-9)
100	4/4	3.67 (3-4)	7.5 (7-8)
50	4/4	3.25 (3-4)	8.25 (7-10)
25	4/4	3.0 (3.0)	8.25 (8-9)
10	4/4	3.0 (3.0)	8.76 (8-9)
5	4/4	2.5 (2-3)	9.75 (9-10)
1	2/4	1.0 (1.0)	16 (14-18)
0	0/4	- -	- -

Tabela III. Dawki antygenu wyzwalającego wymagane do indukcji choroby. Przetestowano różne stężenia MBP wykorzystywane do wyzwalania choroby u myszy biorców. Av. – średnia.

		Kliniczna EAE po stymulacji antygenowej
Antygen stymulujący	Dzień stymulacji	Częstość występowania	Śr. stopień choroby (zakres)	Śr. dzień wystąpienia (zakres)
MBP-CFA	5	3/4	1.33 (1-2)	9.67 (9-10)
MBP-CFA	10	4/4	3.0 (3.0)	8.25 (7-9)
MBP-CFA	15	4/4	3.75 (3-4)	7.25 (7-8)
MBP-CFA	25	4/4	4.0 (4.0)	8.0 (7-9)
MBP-CFA	35	4/4	3.5 (3-4)	7.5 (7-8)
MBP-CFA	60	4/4	3.75 (3-4)	9.0 (8-10)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
MBP-CFA	343	3/3	3.0 (3.0)	10.33 (10-11)
MBP-CFA	445	3/3	3.0 (3.0)	7.0 (7.0)

Tabela IV. Kinetyka stymulacji antygenowej. Myszy biorcze poddano stymulacji w różnych punktach czasowych po adopcyjnym transferze komórek. Av., średnia.

Dyskusja

Badania nad EAE u myszy często wykorzystują neuroantygeny: podstawowe białko mieliny (MBP), białko proteolipidowe (PLP) lub białko oligodendrocytarne mieliny (MOG). Wcześniejsze badania opierały się głównie na MBP. PLP stymuluje silne i spójne odpowiedzi u myszy szczepu SJL. W ostatnim czasie najczęściej stosowanym neuroantygenem jest MOG, ponieważ myszy szczepu B6 są podatne na indukcję choroby przy użyciu tego antygenu. Wiele genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy posiada tło genetyczne B6. Co ciekawe, myszy B6 są ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rdzenie kręgowe świni morskiej	Rockland Immunochemicals	GP-T065	zamrożony
Przyjaciel’Adiuwant, kompletny H37Ra	Difco Laboratories	231131
Wymienna strzykawka Multifit	BD Biosciences	512133
RPMI 1640	Mediatech, Inc.	10-040-CM
OVA	Sigma-Aldrich	A5503
Myszy	Jackson Laboratory	Myszy B6: 0000664	Bar Harbor, Maine