Kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Podsumowanie

Protokół hodowli eksplantów fibroblastów z biopsji wycinanych ze skóry ludzkiej jest technicznie niezawodną i prostą metodą pozyskiwania komórek skóry w ciągu 4-8 tygodni w celu zamrożenia około 15-20 milionów komórek o niskim numerze pasażu.

Streszczenie

Tkanki i linie komórkowe pochodzące od osoby chorej są idealnym źródłem do badania fenotypów komórkowych związanych z chorobą. Fibroblasty pochodzące od pacjenta wykorzystane w niniejszym protokole zostały z sukcesem użyte do otrzymywania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu modelowania chorób¹. Wczesne pasażowanie tych fibroblastów można również wykorzystać w funkcjonalnych testach komórkowych do badania specyficznych szlaków i mechanizmów chorobowych² oraz w późniejszych podejściach do przesiewania leków. Przewagą przedstawionego protokołu nad procedurami enzymatycznymi jest 1) powtarzalność techniki przy małych ilościach tkanki pochodzącej od starszych pacjentów, np. pacjentów cierpiących na chorobę Parkinsona, 2) techniczna prostota podejścia w porównaniu z bardziej wymagającymi metodologiami wykorzystującymi traktowanie enzymatyczne oraz 3) kwestia czasu: protokół ten trwa 15-20 min i może być wykonany natychmiast po otrzymaniu biopsji. Traktowanie enzymatyczne może trwać do 4 hr i wiąże się z problemami nadmiernego trawienia, obniżeniem żywotności komórek oraz problemami z późniejszą adhezją komórek, jeśli proces nie jest przeprowadzony prawidłowo. Niniejszy protokół opisuje sekcję i przygotowanie 4-mm biopsji skóry ludzkiej w celu otrzymania hodowli fibroblastów i charakteryzuje się bardzo wysokim wskaźnikiem sukcesu, co jest istotne przy pracy z próbkami tkanek pochodzącymi od pacjentów. W tej hodowli keratynocyty migrują z tkanki biopsyjnej w ciągu pierwszego tygodnia po przygotowaniu. Fibroblasty pojawiają się 7-10 dni po pierwszym wzroście keratynocytów. Pożywka DMEM high glucose uzupełniona o 20% FBS sprzyja wzrostowi fibroblastów nad keratynocytami, w wyniku czego fibroblasty zdominują keratynocyty. Po 2 pasażach keratynocyty zostają rozcieńczone, co prowadzi do powstania stosunkowo homogenicznych hodowli fibroblastów wykazujących ekspresję markera fibroblastów SERPINH1 (HSP-47). Stosując to podejście, w ciągu 4-8 tygodni można uzyskać 15-20 milionów fibroblastów do bankowania komórek. Sekcja skóry trwa około 15-20 min, następnie komórki są monitorowane raz dziennie pod mikroskopem, a pożywka jest wymieniana co 2-3 dni po adhezji i wzroście komórek.

Protokół

Wyciętą biopsję skóry, pobraną zgodnie ze standardową procedurą³ (np. przy użyciu 4mm okrągłego instrumentu Visipunch), należy przechowywać w lodzie w pełnej pożywce DMEM z 20% FBS. Po dostarczeniu próbki do laboratorium należy niezwłocznie przystąpić do obróbki biopsji.

1. Przygotowanie biopsji skóry wyciętej wykrawaczem

KROKI 1.1- 1.3 NALEŻY WYKONAĆ W KOMORZE ZAPEWNIANIA BEZPIECZEŃSTWA BIOLOGICZNEGO

1. Przygotowanie wstępne: Do każdej studni płytki 6-dołkowej dodać 1 ml 0,1% żelatyny. Pozostawić płytkę na 30–60 min. Odessać roztwór żelatyny i do każdej studni dodać 800 μl pełnej pożywki DMEM/20% FBS. Upewnić się, że cała powierzchnia studni jest pokryta pożywką.
2. Odwrócić pokrywkę sterylnej 10 cm naczynia do hodowli tkanek, na środek pokrywki nanieść 1,5 ml pożywki DMEM/20% FBS i rozprowadzić kroplę pożywki za pomocą końcówki pipety serologicznej.
3. Za pomocą sterylnej pęsety umieścić wycinek biopsji skóry w pożywce na pokrywce naczynia.

2. Disekcja wycinka skóry pobranego biopsją

KROKI 9 2.1-2.2 NALEŻY WYKONAĆ W POZIOMEJ KOMORZE Z PRZEPŁYWEM LAMINARNYM

1. Umieść dno szalki 10 cm na odwróconej pokrywie, a następnie przenieś biopsjat skóry pod mikroskop stereoskopowy w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Podziel okrągły biopsjat skóry o średnicy 4 mm na 12-15 równych kawałków o ostrych krawędziach, dzieląc go na równe połowy; użyj jednego skalpela do przytrzymania biopsjatu, a drugiego do cięcia ruchem toczącym w jednym kierunku. Kawałki o poszarpanych krawędziach przyczyniają się do słabej adhezji i ograniczonego wzrostu komórek.

3. Przeniesienie wypreparowanych fragmentów biopsji skóry do płytek hodowlanych

KROKI 3.1-3.6 NALEŻY WYKONAĆ W KOMORZE BEZPIECZEŃSTWA BIOLOGICZNEGO

1. Umieścić dno 10 cm szalki do hodowli tkankowej na odwróconej pokrywie, a następnie przenieść szalkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza.
2. Za pomocą pęsety z ostrym końcem umieścić 2-3 fragmenty biopsji w każdym dołku przygotowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 800 μl medium, unikając dołków suchych. Aby fragmenty przywarły do dna dołka, należy zastosować delikatne opukiwanie lub przesuwanie. Do usunięcia fragmentów biopsji z pęsety można użyć skalpela.
3. Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Przez pierwszy tydzień codziennie monitorować obecność cienkiej warstwy medium na dnie dołków; co 2 dni dodawać ~200 μl w celu uzupełnienia odparowanego medium.
4. Po tygodniu zwiększyć objętość medium do 2 ml kompletnego DMEM/20%FBS i wymieniać medium co 2-3 dni.
5. Gdy fibroblasty w każdym dołku osiągną konfluencję i zaczną docierać do krawędzi dołka, przeprowadzić trypsynizację i przelać zawartość płytki 6-dołkowej do 2x kolb T75 (pasaż 1). Można również przenieść fragmenty tkanki; nie przywrą one do dna i zostaną wypłukane podczas następnej wymiany medium.
6. Po osiągnięciu konfluencji przez fibroblasty, przenieść je do 3x kolb T175 (pasaż 2) lub zamrozić w kompletnym medium DMEM z dodatkiem 10% DMSO w stężeniu 1x10⁶ cells/ml na fiolkę.

4. Charakterystyka fibroblastów za pomocą immunobarwienia

1. Hodować fibroblasty w 8-dołkowych szkiełkach z komorami pokrytych żelatyną.
2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odessać medium z każdej dołki.
3. Utrwalić komórki w 4% Paraformaldehydzie przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.
4. Przemyć dołki 3 razy 1X PBS.
5. Permeabilizować komórki, dodając 150 μl 0,3% Triton X-100 (w PBS) na 5 min w temperaturze pokojowej.
6. Przemyć dołki 3 razy 1X PBS.
7. Dodać 200 μl roztworu blokującego (PBS + 5% Normal Goat Serum (Vector, S-1000)) na 1 h w temperaturze pokojowej.
8. Przygotować rozcieńczenie 1:250 Anti-SERPHIN-1 (Anti-rabbit, mAB, Sigma, S5950-200 μl) w roztworze blokującym.
9. Odessać roztwór blokujący i dodać 150 μl rozcieńczenia 1:250 AntiSERPINH-1. Inkubować przez 1-2 h w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez noc.
10. Przemyć dołki 3 razy 1X PBS.
11. Przygotować rozcieńczenie 1:200 koziego przeciwciała monoklonalnego przeciw króliczym (Alexa Fluor Goat anti-rabbit IgG(H+L), Invitrogen, A11008) w roztworze blokującym.
12. Dodać 150 μl rozcieńczenia 1:200 koziego przeciwciała monoklonalnego przeciw króliczym do każdej dołki. Inkubować przez 1 h w ciemności w temperaturze pokojowej.
13. Przemyć dołki raz 1xPBS.
14. Odessać PBS i ostrożnie zdjąć komory, aby odsłonić samo szkiełko.
15. Zamontować preparat, dodając 2-3 krople medium montażowego zawierającego DAPI (Vector, H-1200).
16. Analizować preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

Keratynocyty wyrastają z fragmentów biopsji już 48 h po wycięciu. Pierwszy wzrost fibroblastów można zaobserwować około tygodnia po przetworzeniu. Po osiągnięciu przez dołki pełnej konfluencji, fibroblasty są pasażowane dwukrotnie, aby uzyskać trzy kolby 150 cm (T150), a następnie komórki są kriokonserwowane. Metodą tą uzyskujemy 15-20 milionów komórek. Fibroblasty są dodatnie w kierunku przeciwciał anty-SERPINH1 (znanego również jako HSP-47) (Rycina 1), który jest swoistą dla kolagenu molekularną chaper...

Dyskusja

Za pomocą niniejszego protokołu można uzyskać stosunkowo czyste hodowle fibroblastów skóry. Fibroblasty charakteryzują się typową morfologią w postaci wydłużonych, wrzecionowatych ciał komórkowych oraz okrągłych lub owalnych jąder komórkowych; po osiągnięciu konfluencji fibroblasty rosną w uporządkowany sposób, tworząc pęczki. Stosowane medium wspomaga wzrost fibroblastów, podczas gdy inne populacje komórek, np. keratynocyty, wymagają dodatkowych suplementów i czynników wzrostu lub wykazują mniejszą aktywność mi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop stereoskopowy	Leica	S6E
szalka Petri do hodowli tkanek 10 cm	VWR	25382-166
płytka do hodowli tkankowej 6-dołkowa	VWR	73520-906
Jednorazowe sterylne skalpele ze stali nierdzewnej (2), ostrze nr 15, Miltex	VWR	21909-660
Sterylna pęseta z ostrymi końcówkami
Probówki stożkowe 50 ml	VWR	21008-940
Pipety serologiczne 2 ml	VWR	89130-894
Pipety serologiczne 5 ml	VWR	89130-896
Pipety serologiczne 10 ml	VWR	89130-898
Pipety Pasteura	VWR	14672-380
Tabela A. Tabela specyficznych odczynników i sprzętu.
1X DMEM: wysoka zawartość glukozy	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% płodowa surowica bydlęca	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-glutamina	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM nieessentialne aminokwasy	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X penicylina/streptomycyna	Invitrogen/Gibco	15140-163
Tabela B. Odczynniki.