Szybkie oznaczanie progu termicznej nocycepcji u szczurów z cukrzycą

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisujemy szybką, niezawodną i prostą procedurę określania najniższej temperatury, przy której szczury lub myszy wykazują zachowania nocyfencyjne, t. j. na próg termicznej nocycepcji (TNT). Metoda ta wykorzystuje powoli zwiększający się bodziec termiczny, co pozwala na precyzyjną i powtarzalną ocenę TNT przy minimalnym lub żadnym stresie dla zwierząt.

Streszczenie

Bolesna neuropatia cukrzycowa (PDN) charakteryzuje się hiperalgezją, tj. zwiększoną wrażliwością na bodźce szkodliwe, oraz allodynią, tj. nadwrażliwością na bodźce normalnie niebolesne¹. Hiperalgezja i allodynia były badane w wielu różnych modelach cukrzycy u gryzoni². Jednakże, jak stwierdzili Bölcskei et al, określenie „bólu” w modelach zwierzęcych jest trudne ze względu na jego subiektywny charakter³. Co więcej, tradycyjne metody stosowane do określania odpowiedzi behawioralnych na szkodliwe bodźce termiczne zazwyczaj wykazują brak powtarzalności i czułości farmakologicznej³. Na przykład, stosując metodę gorącej płyty według Ankiera⁴, drgnięcie, cofnięcie i/lub lizanie tylnych i/lub przednich łap jest kwantyfikowane jako opóźnienia odruchowe przy stałych wysokich bodźcach termicznych (52-55 °C). Jednak zwierzęta z hiperalgezją na bodziec termiczny nie wykazują powtarzalnych różnic w opóźnieniach odruchowych przy zastosowaniu tych temperatur powyprogowych^3,5. Podobnie jak w niedawno opisanej metodzie Bölcskei et al.⁶, procedury opisane tutaj pozwalają na szybkie, czułe i powtarzalne oznaczenie progów nocycepcji termicznej (TNTs) u myszy i szczurów. Metoda ta wykorzystuje powoli zwiększający się bodziec termiczny przykładany głównie do skóry powierzchni podeszwowej myszy/szczura. Metoda ta jest szczególnie czuła w badaniu antynocycepcji podczas stanów hiperalgetycznych, takich jak PDN. Procedury opisane poniżej opierają się na tych, które zostały szczegółowo opublikowane przez Almási et al ⁵ oraz Bölcskei et al ³. Procedury opisane w niniejszym opracowaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Laboratoryjnych (LACUC) Uniwersytetu Wright State.

Protokół

Progi odczuwalności bólu (TNT) u myszy i szczurów określa się przy użyciu inkrementalnego miernika analgesji na gorącej płycie [iHPAM, IITC Inc. Life Science (Woodland Hills, CA)]. Urządzenie składa się z kilku komponentów: aluminiowej płyty (10 x 20 cm) z systemem grzewczym pod spodem oraz pleksiglassowej komory obserwacyjnej powyżej; jednostki sterującej ciepłem, oprogramowania do akwizycji danych (IITC Part # Soft Series 8), komputera PC oraz przełącznika nożnego do zdalnego uruchamiania, zatrzymywania lub resetowania pracy urządzenia. System grzewczy umożliwia również ręczne uruchamianie, zatrzymywanie i resetowanie procesu grzania za pomocą klawiatury znajdującej się przed urządzeniem. iHPAM można zaprogramować na różne szybkości nagrzewania oraz temperatury czuwania/odcięcia.

1. Konfiguracja sprzętu

1. Przed badaniem zwierząt należy dokonać inspekcji wizualnej urządzenia, aby potwierdzić wybrane szybkości nagrzewania (np. 6 °C/min), początkową temperaturę czuwania oraz końcową temperaturę odcięcia (np. odpowiednio 28 °C i 55 °C).
2. Należy sprawdzić wszystkie połączenia. Aby zachować elektroniczną kopię wyników, urządzenie musi być podłączone do komputera z zainstalowanym programem Software Series 8. Alternatywnie, kopie wyników w formie papierowej można wydrukować za pomocą portu szeregowego urządzenia.
3. Należy przetestować sprzęt. Naciśnij raz przełącznik nożny, aby upewnić się, że program Software Series 8 rejestruje dane: początkową temperaturę czuwania, końcową temperaturę odcięcia oraz czas w sekundach potrzebny do osiągnięcia temperatury odcięcia.
4. W ramach dodatkowego testu kontrolnego badacze zaangażowani w eksperymenty mogą potrzebować sprawdzić działanie urządzenia na sobie. Cofnięcie ręki z metalowej płyty w momencie odczucia bólu (46-48 °C) nie powinno spowodować uszkodzenia skóry ani żadnego późniejszego dyskomfortu.
5. Po skonfigurowaniu urządzenia i zarejestrowaniu wyników z kroków 1.3 i 1.4 można je porównać. Pomaga to w wykryciu potencjalnych problemów, które mogłyby unieważnić użycie urządzenia. Przykładami są rozbieżności między początkową temperaturą czuwania/końcową temperaturą odcięcia a rzeczywistym odczytem urządzenia i/lub różnice między temperaturami wyświetlanymi przez urządzenie a rzeczywistą temperaturą płyty wymaganą do cofnięcia ręki.

2. Badanie zwierząt zdrowych

Można wykorzystać młode lub dorosłe szczury Wistar [wiek ponatalny (p) 21-25 dni] lub myszy (p21-25) o dowolnym tle genetycznym i płci. Myszy użyte w naszych eksperymentach pochodzą z linii C57BL/6J.

1. W noc poprzedzającą planowane eksperymenty należy przeprowadzić aklimatyzację zwierząt, umieszczając ich klatki na blacie, na którym znajduje się iHPAM. Na dwie godziny przed rozpoczęciem testów należy włączyć iHPAM, aby zwierzęta oswoiły się z hałasem generowanym przez urządzenie. Na tym etapie iHPAM można skonfigurować i przetestować w celu weryfikacji jego prawidłowego działania (patrz Krok 1). Pokarm i wodę podaje się ad libitum przez cały czas trwania testu, z wyjątkiem czasu przebywania zwierzęcia w komorze obserwacyjnej (patrz Krok 2.1).
   Uwaga: Ważne jest, aby nie zakładać, że warunki laboratoryjne w eksperymentach behawioralnych są domyślnie kontrolowane. Szczególną uwagę należy zwrócić na czynniki genetyczne i środowiskowe, które mogą wpływać na wyniki badań behawioralnych (omówiono w ⁷).
2. Delikatnie umieść zdrową mysz/szczura w pleksiglasowej komorze obserwacyjnej na płycie grzewczej urządzenia. Pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się do ogrzanej powierzchni (ustawionej na 28 °C), aż zacznie wykazywać komfortowe zachowanie.
   Uwaga: W tych warunkach zdrowe dorosłe szczury wykazują początkowo zachowania eksploracyjne, sporadycznie stając na tylnych łapach w stronę pokrywy komory obserwacyjnej i węsząc. Po kilku minutach szczury mogą wykazywać przerywane epizody pielęgnacji (groomingu) i rozluźnione zachowanie. Czasami szczury kładą się w rozluźnionej pozycji ciała (wyprost grzbietowy), swobodnie węsząc w otoczeniu. Zdrowe myszy są zazwyczaj bardziej aktywne niż szczury. Niemniej jednak myszy wykazują rozluźnione zachowanie eksploracyjne po kilku minutach przebywania w komorze obserwacyjnej. Wyjątkowo rzadko obserwuje się zachowania ucieczkowe (np. skakanie, próby wydostania się z komory obserwacyjnej) lub postawy obronne (np. piszczenie). Ważne jest również zauważenie, że myszy mogą przekazywać sygnały bólu między sobą⁸. Dlatego istotne może być testowanie myszy umieszczonych w oddzielnych klatkach.
3. Umieść lustra z tyłu komory obserwacyjnej, aby umożliwić obserwację pod każdym kątem. Statyw z cyfrową kamerą wideo może pomóc w dokładnym określeniu momentu wystąpienia zachowania nocyfozyjnego (unikającego bólu).
4. Gdy zwierzę poczuje się komfortowo w komorze obserwacyjnej, nagrzej płytę, naciskając przełącznik nożny. Przy tempie nagrzewania płyty wynoszącym 6 °C/minutę, zdrowe zwierzęta wykazują zachowanie nocyfozyjne obejmujące tylną łapę*, zazwyczaj przy temperaturach w zakresie od 46 do 48 °C^3,5,9,10. Zatem zwierzę jest zazwyczaj usuwane z komory obserwacyjnej po około 3 minutach.
   Uwaga: Zaobserwowanie typowej reakcji nocyfozyjnej szczura lub myszy, t.j. lizania tylnej łapy przy jednoczesnym potrząsaniu i/lub unoszeniu jej, jest wystarczające do przerwania bodźca termicznego. Osiąga się to poprzez naciśnięcie przełącznika nożnego. W tym momencie oprogramowanie rejestruje temperaturę płyty, a płyta natychmiast stygnie, aż do osiągnięcia temperatury czuwania (28 °C) (~0,5 min). Temperatura ta, t.j. ta, która wywołuje jakąkolwiek reakcję nocyfozyjną, jest uznawana za próg ciepła szkodliwego (TNT) zdrowego zwierzęcia (kontrolnego).
   *Czasami, szczególnie u myszy, zachowanie nocyfozyjne w odpowiedzi na szkodliwą temperaturę może być najpierw zaobserwowane w jednej lub obu przednich łapach (np. lizanie podczas siedzenia), kilka sekund przed reakcją tylnych łap. Jednak lizanie przednich łap jest normalnym elementem zachowania pielęgnacyjnego. W związku z tym ocenie podlegają wyłącznie reakcje tylnych łap. W niektórych przypadkach myszy mogą pielęgnować również tylne łapy. Jednak normalna pielęgnacja nie trwa dłużej niż kilka sekund, nie obejmuje intensywnego lizania i zazwyczaj kończy się po wyczyszczeniu pazurów.
5. Delikatnie usuń zwierzę z płyty i umieść je w jego klatce. Pomiar progu cieplnego powtarza się następnie dla kolejnego zdrowego zwierzęcia (kontrolnego).
   Uwaga: Wartości TNT można wyznaczać u jednego zwierzęcia w odstępach 1-2 minut bez usuwania go z komory obserwacyjnej. Wyznaczanie TNT u szczurów lub myszy można powtarzać wielokrotnie w ciągu kilku dni. Jest to szczególnie przydatne do określenia średniego TNT poszczególnych osobników, a także jego zmienności wraz z wiekiem.
6. TNT zwierząt kontrolnych wyraża się jako średnia z trzech lub więcej progów ± SEM.
7. Analizę statystyczną uzyskanych danych przeprowadza się w celu porównania różnych grup terapeutycznych myszy lub szczurów. Procedury parametryczne, w tym analiza wariancji, mogą być odpowiednio zastosowane w przypadku normalnego rozkładu danych i homoskedastyczności grup terapeutycznych; po spełnieniu tych warunków można zastosować następujące podejścia. Analiza wariancji, a następnie test Newmana-Keulsa w celu wykrycia różnic w pomiarach wielokrotnych, t.j. powtarzalnych indywidualnych wartości TNT z leczeniem lub bez, lub w różnych punktach czasowych (np. dane na Rysunku 3). Sparowany test t Student’a może być użyty do porównania dwóch grup danych, t.j. wartości TNT przed vs. po podaniu leku; niesparowany test t może być użyty do określenia różnic w zmianach TNT u zwierząt leczonych lekiem vs. zwierząt otrzymujących nośnik (np. dane na Rysunku 4).

3. Badanie zwierząt z cukrzycą

Szczur z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ) jest najczęściej stosowanym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów PDN oraz oceny leków i terapii przeciwbólowych^11,12. Szczury, u których wywołano cukrzycę za pomocą pojedynczej dawki STZ (60 mg/kg) podanej dootrzewnowo, mogą być badane pod kątem hiperalgezji termicznej w 3^rd tygodniu po wystąpieniu cukrzycy¹¹. Należy zauważyć, że nie u wszystkich szczurów cukrzycowych rozwija się PDN. Jednak zwierzęta, u których występuje hiperalgezja (~50%), można łatwo zidentyfikować. W rzeczywistości ich TNT są niższe od normy*.

*W celu wyznaczenia TNT u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ stosuje się początkową temperaturę płyty wynoszącą 15 °C zamiast 28 °C. Powodem tej zmiany jest przewidywana hiperalgezja u większości zwierząt z cukrzycą i PDN^2,11. W związku z tym będą one wykazywać niższe niż normalnie progi termiczne dla bodźców szkodliwych (np. <45 °C).

1. Szczura z cukrzycą umieszcza się w komorze obserwacyjnej na górze aparatury testowej. Pozostawia się zwierzę do aklimatyzacji do powierzchni płytki, aż zacznie przejawiać komfortowe zachowanie.
   Uwaga: Zazwyczaj szczur z cukrzycą nie wykazuje w dużym stopniu typowych zachowań. Szczury z cukrzycą są zazwyczaj hypoaktywne i letargiczne; często wykazują ograniczoną ruchomość i spowolnioną pielęgnację. Rzadko obserwuje się próby stania przy pokrywie komory obserwacyjnej. Po kilku minutach szczury z cukrzycą mogą spokojnie przebywać w narożniku komory, okazjonalnie węsząc w otoczeniu.
2. Gdy zwierzę z cukrzycą poczuje się komfortowo w komorze obserwacyjnej, płytkę nagrzewa się zgodnie z krokiem 2.3. Szczur z cukrzycą może przejawiać zachowania nocifensywne obejmujące tylną lub przednią łapę. Zazwyczaj dzieje się to w temperaturach płytki niebędących szkodliwymi (np. <45 °C) lub po nie więcej niż 5 minutach przebywania w komorze przy wzroście temperatury o 6 °C/min.
   Uwaga: Odpowiedź nocifensywna młodego dorosłego szczura z cukrzycą nie różni się od odpowiedzi szczura zdrowego. Jednakże najniższa temperatura wywołująca takie zachowanie jest znacząco obniżona.
3. Patrz Krok 2.4
4. Średnia z ponad trzech progów wyznaczonych w dniu eksperymentu, wyrażona jako °C ± SEM, jest uznawana za próg szkodliwego ciepła u zwierzęcia z cukrzycą.
   Uwaga: Podobny schemat, jak ten opisany dla szczurów zdrowych lub z cukrzycą, można zastosować w celu określenia termicznego efektu anty-nocifensywnego leków przeciwbólowych na progi cieplne.

4. Badanie przeciwbólowcze

Właściwości przeciwbólowe leków (np. analgetyków), a także określenie parametrów farmakologicznych, takich jak minimalna dawka skuteczna, mogą być łatwo uzyskane dzięki zastosowaniu opisanych powyżej kroków. Przewiduje się, że odpowiednie dawki analgetyku podane szczurom/myszom znacząco zwiększą ich TNT. Jest to szczególnie widoczne u zwierząt z hiperalgezją termiczną³. Jednakże, aby uniknąć błędów w interpretacji wyników, badacze zaangażowani w obserwację behawioralną grupy zwierząt nie mogą wiedzieć ani być świadomymi, czy zwierzęta zostały poddane leczeniu, czy nie. Ponadto leki przeznaczone do wstrzyknięcia przez obserwatora mogą zostać przygotowane przez innego badacza i oznaczone jako A, B, C itd. Dawkowanie jest podane w wydruku, zawierającym poszczególne dawki dla każdego zidentyfikowanego zwierzęcia.

W zależności od testowanego leku, zwierzętom zdrowym lub z cukrzycą można podać różne dawki potencjalnego leku przeciwbólowego na 5-15 min przed testami behawioralnymi. Należy uwzględnić odpowiednie grupy kontrolne (tj. zwierzęta w tym samym wieku, którym wstrzyknięto sam nośnik i/lub szczury z cukrzycą bez PDN) i poddać je badaniom w identycznych warunkach (np. ta sama temperatura początkowa płyty). Można również badać przewlekłe efekty działania leków.

5. Reprezentatywne wyniki

Najniższą temperaturę płyty wywołującą reakcje nocyfensywne w dowolnej tylnej łapie młodych dorosłych, normalnych, nieleczonych szczurów lub myszy określono zgodnie z krokami od 2-1 do 2-6. Jak pokazano na Rysunku 1, TNT normalnych młodych dorosłych szczurów i myszy wynosiły odpowiednio 47.2 ± 0.2 °C oraz 47.5 ± 0.5 °C.

Nie zaobserwowaliśmy ani istotnych dobowych wahań TNT u poszczególnych osobników (Rysunek 2A), ani istotnych różnic w TNT między osobnikami w tym samym wieku (Rysunek 2B). Nie odnotowano różnic w TNT wynikających z płci (nie pokazano).

TNT młodych dorosłych szczurów z cukrzycą wywołaną STZ określono w sposób analogiczny jak w przypadku szczurów zdrowych (kroki 3.1 do 3.3). Jednakże temperaturę początkową płyty ustawiono na 15 °C zamiast 28 °C. Zachowanie nocyceptywne szczurów z cukrzycą STZ oceniano co najmniej trzy razy u każdego osobnika w trybie dziennym, zaczynając od jedenastego dnia po wstrzyknięciu STZ. Jak pokazano na Rysunku 3, znaczący spadek (p<0,01) TNT szczurów z cukrzycą STZ staje się widoczny dwa tygodnie po wstrzyknięciu STZ. Średnia wartość TNT szczurów z cukrzycą STZ wyniosła 45,6 ± 0,1 °C (n=16, wartości zbiorcze z dni 14-23).

Szczury z cukrzycą wykazujące znacznie niższy TNT niż szczury zdrowe uznano za zwierzęta z PDN. Szczury te wykorzystano do zbadania ostrych właściwości przeciwbólowych preparatu przeciwbólowego (związek A). TNT oznaczono u szczurów zdrowych i cukrzycowych, którym na pięć minut przed testem podano pojedynczą dawkę związku lub samą substancję nośnikową. Jak pokazano na Rysunku 4, pojedyncza dawka związku podana domięśniowo znacząco zwiększyła TNT u szczurów z cukrzycą w porównaniu do szczurów traktowanych samą substancją nośnikową (odpowiednio 45,6 °C vs 47,6 °C). Działanie przeciwbólowe związku A zaobserwowano również u szczurów zdrowych; choć było ono istotne statystycznie (p<0,01), było mniej wyraźne (odpowiednio 47,4 °C vs 48,0 °C).

Rycina 1. Wyznaczanie TNT u zdrowych młodych dorosłych szczurów i myszy: Wartości TNT u młodych dorosłych szczurów (p21-24) lub myszy (p20-21) badano w iHPAM zgodnie z powyższą procedurą. Przebadano łącznie 12 szczurów i 25 myszy. Pomiary przeprowadzano przez kilka dni, a następnie połączono wyniki. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. Minimalna i maksymalna wartość TNT odnotowana u tych szczurów wynosiła odpowiednio 46,2 °C i 48,6 °C. W przypadku myszy maksymalna i minimalna wartość TNT wynosiła odpowiednio 48,8 °C i 44,9 °C.

Rycina 2. Zależność TNT od wieku u szczurów i myszy: A) Przedstawiono wartości TNT czterech prawidłowych szczurów (n=4) w wieku 21 dni, wyznaczane co najmniej trzy razy dziennie przez 5 dni. B) Wartości TNT u myszy z jednego miotu wyznaczone jednorazowo w określonym wieku. Liczby nad każdym punktem pomiarowym oznaczają liczbę wykorzystanych osobników z miotu.

Rysunek 3. Szczury cukrzycowe stają się nadwrażliwe na ból 3 tygodnie po wystąpieniu cukrzycy: Wartości TNT sześciu (n=6) młodych dorosłych szczurów z cukrzycą indukowaną STZ, dobranych pod względem wieku, określano codziennie, zaczynając od 11. dnia po indukcji cukrzycy. Przedstawiono średnie dzienne wartości TNT (średnia ± SEM). Wartości TNT u szczurów cukrzycowych określone między 11. a 13. dniem po wstrzyknięciu STZ mieściły się w zakresie normy (czerwona linia). Dwa tygodnie po wstrzyknięciu STZ wartości TNT znacząco spadły do 45.1 ± 0.4 °C, (p<0.05).

Rysunek 4. Ostre efekty przeciwbólowe związku B u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ. Młode dorosłe szczury prawidłowe (grupa niebieska n=12) oraz szczury z hiperalgezją w przebiegu cukrzycy indukowanej STZ w tym samym wieku (grupa zielona n=6) zostały poddane badaniu iHPAM po wstrzyknięciu dootrzewnowym nośnika (ciemne słupki) lub związku A (jasne słupki). Przedstawiono średnią wartość TNT ± SEM dla każdej grupy (kontrola nośnikiem lub leczona związkiem A). Gwiazdki oznaczają różnice statystyczne (p<0.05).

Dyskusja

Podobnie jak w klasycznym teście z płytką grzewczą służącym do ilościowego określania hiperalgezji termicznej^4,13, opisany tutaj pomiar nocycepcji umożliwia szybki i wiarygodny sposób oceny zachowań nocyceptywnych u szczurów i myszy. Jednak w przeciwieństwie do klasycznego testu, metoda przyrostowej temperatury płytki grzewczej jest nieinwazyjna i praktycznie pozbawiona stresu. Chociaż do przeprowadzenia testu niezbędne jest pewne ograniczenie swobody (i.e., zwierzę musi znajdować się w komorze obserw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkrementacyjny analizator analgesji na płytce grzejnej	IITC Inc. Life Science	Katalog nr PE34
Soft Series 8	IITC Inc. Life Science	Katalog nr Series8
Streptozotocyna	Calbiochem	572201