Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w normalnym ludzkim mózgu

1. Przygotowanie frakcji rozpuszczalnych (S2) i -nierozpuszczalnych (P2) w mózgu, homogenatów i detergentów.

1. Weź 100 mg zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej i dodaj 100 μl buforu do lizy (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
2. Homogenizuj go na lodzie za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem akumulatorowym, zamrażaj w suchym lodzie przez 5 minut i homogenizuj ponownie, używając najpierw tłuczka napędzanego ręcznie, a następnie silnikiem i dodaj 300 μl lub 800 μl buforu do lizy (jest to odpowiednio 20% lub 10% całkowitego homogenatu mózgu).
3. Odwirować 20% lub 10% całkowity homogenat mózgu przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania supernatantu (S1) za pomocą wirówki stołowej.
4. Ultrawirować 10% S1 przy 35 000 obr./min (100 000 x g) w wirniku SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty (S2) zawierające frakcję rozpuszczalną w detergentach do czystej probówki. Zawiesić granulki zawierające frakcję nierozpuszczalną w detergentach (P2) w 100 μl lub 200 μl buforu do lizy, aby uzyskać 10- lub 5-krotnie skoncentrowany preparat.
5. W przypadku mineralizacji farmakokinetycznej należy inkubować próbkę z tymi samymi ilościami PK w temperaturze 50 μg/ml w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę zarówno dla frakcji S2, jak i P2. Dodać fluorek fenylometylosulfonylu o końcowym stężeniu 5 mM i równej objętości buforu próbki SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-merkaptoetanol, 10% glicerol, 50 mM Tris, pH 6,8), aby zakończyć trawienie farmakokinetyczne. Gotować próbki przez 10 minut i schładzać je w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Są gotowe na Western blotting.

2. Sedymentacja prędkości w gradientach schodkowych sacharozy

1. Inkubować 450 μl 20% S1 o równej objętości 2% sarkozylu w H₂O przez 30 minut na lodzie.
2. Dodaj po 0,5 ml 60%, 30%, 25%, 20%, 15% i 10% sacharozy do probówki Beckman o maksymalnej pojemności 5 ml.
3. Załaduj 0,4 ml S1 na wierzch 10-60% gradientów krokowych sacharozy.
4. Wirować z prędkością 48 000 obr./min (200 000 x g, wirnik SW55) przez 1 godzinę, w temperaturze 4 °C.
5. Zbierz po 283 μl frakcji z górnej części probówki i uzyskaj w sumie 12 frakcji.
6. Pobrać 20 μl każdej frakcji do nowej probówki Eppendorfa, dodać 20 μl buforu do próbek i gotować przez 10 minut.
7. Schłodzić próbki przez 4 minuty w kapturze, odwirować przy 1 000 x g przez 1 minutę i zawirować. Załaduj próbki na wstępnie odklejony żel.

3. Chromatografia wykluczająca rozmiar

1. Użyj kulek Superdex 200 HR (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) w kolumnie 1 x 30 cm, aby określić stan oligomeryczny cząsteczek PrP.
2. Siedem markerów masy cząsteczkowej (Sigma, St. Louis, MI), w tym błękit dekstranowy (2 000 kDa), tyreoglobulina (669 kDa), apoferrytyna (443 kDa), β-amylaza (200 kDa), dehydrogenaza alkoholowa (150 kDa), albumina (66 kDa) i anhydraza węglanowa (29 kDa) jest ładowanych niezależnie w stężeniach zalecanych przez Sigma w objętości 200 μl.
3. Objętość elucji niebieskiego dekstranu służy do określenia objętości pustek (V₀ = 8,45 ml), a całkowita objętość (V_t = 24 ml) jest podana w instrukcji produktu. Objętości pików elucji (V_e) oblicza się na podstawie chromatogramu i retencji frakcyjnej. K_av, współczynnik podziału (definiujący zachowanie próbki), oblicza się za pomocą równania: K_av = (V_e - V₀)/(V_t - V₀). Krzywą kalibracyjną wyznacza się, wykreślając K_av wzorców białka w stosunku do logarytmu MW wzorców⁸.
4. Masę cząsteczkową (MW) różnych gatunków PrP odzyskanych w różnych frakcjach FPLC ocenia się zgodnie z krzywą kalibracyjną wygenerowaną podczas filtracji żelowej o różnych wzorcach.
5. Wstrzyknąć 200 μl S1 do buforu do lizy zawierającego 1% sarkozylu do kolumny dla każdego przebiegu.
6. Chromatografia wykonywana jest w systemie FPLC (GE Healthcare) przy natężeniu przepływu 0,25 ml/min, a frakcje po 0,25 ml każda są zbierane za pomocą kolektora frakcji (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Inkubować 0,125 ml każdej frakcji z 0,5 ml wstępnie schłodzonego metanolu w temperaturze -20 °C przez 2 godziny.
8. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce laboratoryjnej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl buforze do próbek SDS, jak wspomniano powyżej, gotować przez 10 minut, schłodzić do temperatury pokojowej, załadować je na wstępnie obsadzony żel.

4. Przejęcie PrP przez g5p

1. Cząsteczka g5p (100 μg) (uprzejmie dostarczona przez dr Geoffa Kneale'a i Johna McGeehana z Uniwersytetu w Portsmouth, Wielka Brytania) jest sprzężona z kulkami magnetycznymi aktywowanymi 7 x 10⁸ tozylonem przez inkubację 100 μg g5p i 350 μl g5p w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 37 °C przez 20 godzin. Przyciągnij kulki g5p do ścianki bocznej probówek Eppendorfa za pomocą zewnętrznej siły magnetycznej, a następnie usuń cały roztwór. Przemyć kulki 1 ml PBS zawierającego 0,1 % albuminy surowicy bydlęcej (BSA) trzy razy.
2. Inkubować kulki sprzężone z g5p w 1 ml 0,2 M Tris-HCl o pH 7,4 i pH 0,1 % BSA w temperaturze 37 °C przez 5 godzin w celu zablokowania niespecyficznego wiązania, a następnie przemyć kulki 1 ml PBS zawierającego 0,1% BSA trzykrotnie, jak wspomniano powyżej. Usuń roztwór i dodaj 1 ml PBS do kulek. Przygotowane kulki g5p są stabilne przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze 4 °C.
3. Wychwyt PrP przez g5p przeprowadza się przez inkubację 100 μl frakcji S1 lub P2 z 60 μl sprzężonych kulek g5p (10 μg białka/6 X 10⁷ kulek) w 1 ml buforu wiążącego (3% Tween-20, 3% NP-40 w PBS, pH 7,5).
4. Po inkubacji ze stałą rotacją przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, kulki g5p zawierające PrP są przyciągane do ścianki bocznej probówek Eppendorfa przez zewnętrzną siłę magnetyczną, co pozwala na łatwe usunięcie wszystkich niezwiązanych cząsteczek z roztworu.
5. Po trzech przemyciach w buforze do przemywania (2% Tween-20 i 2% NP-40 w PBS, pH 7,5), kulki g5p zbiera się i podgrzewa w temperaturze 95 °C przez 5 minut w buforze próbki SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glicerol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
6. Po schłodzeniu próbek przez 5 minut w temperaturze pokojowej, próbki są odwirowywane przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Supernatanty są gotowe do Western blot.

5. Western Blotting

1. Załaduj próbki ugotowane w buforze próbek SDS na 15% żele prefabrykowane Tris-HCl Criterion (Bio-Rad) pod napięciem 150 V przez ~80 min.
2. Białka na żelach są przenoszone do PVDF na 2 godziny przy napięciu 70 V.
3. Po zablokowaniu błon w 5% mleku w soli fizjologicznej buforowanej tris zawierającej 0,01% Tween-20 (TBS-T), błony inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z pierwszorzędowym przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym 3F4 (1:40 000), 1E4 (1:1 000), anty-N⁸ (1:6 000) lub anty-C⁸ (1:6 000) w celu sondowania cząsteczki PrP.
4. Po inkubacji z przeciwciałem anty-mysim IgG sprzężonym z HRP w stosunku 1:3000 lub IgG przeciwko królikom w stosunku 1:3000 pasma PrP są wizualizowane na kliszy Kodak przy użyciu ECL Plus, zgodnie z protokołem producenta.

6. Reprezentatywne wyniki

W porównaniu do sporadycznych próbek CJD, niewielka ilość iPrP^C została wykryta we frakcji P2 w normalnych mózgach, chociaż większość PrP^C została odzyskana we frakcji S2 (Rysunek 1). Jak wskazano wcześniej⁸, iPrP stanowi około 5-25% całkowitego PrP, w tym gatunki pełnowymiarowe i N-końcowo ścięte.

Analizy z użyciem sedymentacji w gradimencie sacharozy wykazały, że podczas gdy większość PrP^C z mózgów nie-CJD została odzyskana w górnych frakcjach 1-3, niewielkie ilości PrP zostały również wykryte w dolnych frakcjach 9-11, które zwykle zawierają duże agregaty⁸ (Rysunek 2).

Różnorodność gatunków PrP^Sc, począwszy od monomerów, małych oligomerów do większych agregatów, została wyizolowana przez filtrację żelową w mózgu z chorobą Creutzfeldta-Jakoba (Rysunek 3A). Jednak niewielką ilość większych agregatów o masie cząsteczkowej większej niż 2000 kDa wykryto również w nierozpuszczalnych frakcjach normalnych mózgów (ryc. 3C). Co więcej, dimery i tetramery PrP^C wykryto nie tylko we frakcjach nierozpuszczalnych, ale także we frakcjach rozpuszczalnych (ryc. 3B i 3C).

Po leczeniu PK i PNGazą, PrP wychwycone przez g5p zostało wykryte za pomocą przeciwciała 1E4 przeciwko PrP97-105 ⁸. Wykryto trzy odporne na PK fragmenty rdzenia oznaczone jako PrP*²⁰, PrP*¹⁹ i PrP*⁷, migrujące odpowiednio z prędkością ~20 kDa, ~19 kDa i ~7 kDa (Rysunek 4, lewy panel). Jednak nie wykryto PrP, gdy przeciwciało 1E4 było wstępnie inkubowane z syntetycznym peptydem, który ma sekwencję identyczną z epitopem 1E4 (Figura 4, środkowy panel), co wskazuje, że prążki wykryte przez 1E4 są fragmentami PrP. Co więcej, przeciwciało anty-C ujawniło dwa różne fragmenty PrP migrujące z prędkością ~18 kDa (PrP * ¹⁸) i ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12 / 13), oprócz PrP * ²⁰ (Figura 4, prawy panel).

Rysunek 1. Wykrywanie iPrP^C i iPrP^Sc. Po poddaniu działaniu PNGazy F w stężeniu 1/10 całkowitej objętości reakcji w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu usunięcia glikanów z białka, wykryto pełnowymiarowe lub N-końcowo skrócone gatunki PrP w frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych (S2 i P2) wyizolowane przez ultrawirowanie w próbkach mózgu z prawidłowej kontroli (CTL) i sporadycznej CJD (sCJD) za pomocą 3F4 przeciwko PrP106-112 (lewy panel), anty-N przeciwko PrP23-40 (panel środkowy) i anty-C przeciwko PrP220-231 (prawy panel). W próbkach CTL niewielka ilość PrP jest wykrywana w P2, podczas gdy duża ilość jest obecna w S2. Natomiast w próbkach sCJD wykrywa się więcej PrP niż w S2

Rysunek 2. Sedymentacja PrP w gradientach krokowych sacharozy. PrP w poszczególnych frakcjach od 1 do 11 próbki mózgu S1 bez CJD wykryto za pomocą Western blot z 3F4. Chociaż większość PrP^C wykryto w górnych frakcjach 1-3, niewielkie ilości PrP zaobserwowano również w dolnych frakcjach 9-11. Co więcej, wzór pasmowania PrP od góry i od dołu jest inny: PrP odzyskany w górnych frakcjach ma dominującą górną wstęgę, podczas gdy PrP odzyskany w dolnych frakcjach ma dominującą dolną wstęgę. PrP^Sc leczony PK został załadowany jako kontrola po prawej stronie blot.

Rysunek 3. Wykrywanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP^C. Rozpuszczalny i nierozpuszczalny PrP^C z normalnych ludzkich mózgów oddzielono za pomocą ultrawirowania, a następnie poddano odpowiednio filtracji żelowej. Rozmiary molekularne poszczególnych frakcji mierzono poprzez przeprowadzenie grupy markerów masy cząsteczkowej. (A) Gatunki PrP^Sc z próbek mózgu sCJD. Stwierdzono dwie populacje gatunków PrP: frakcje filtracji żelowej 49 - 65 zawierają monomery i małe oligomery, natomiast frakcje 27-33 zawierają duże agregaty. Wykryto gatunki PrP^C z frakcji rozpuszczalnej (S2) (B) i frakcji nierozpuszczalnej (P2) (C) normalnych kontroli. PrP badano przeciwciałem 3F4. Dimery (frakcja 55) i tetramery (frakcja 51) PrP wykryto nie tylko w P2, ale także w S2 prawidłowych próbek mózgu (B i C). Duże agregaty wykryto tylko w P2 normalnych próbek (C).

Rysunek 4. Wykrywanie różnych opornych na farmakokinetykę fragmentów iPrP w preparatach wzbogaconych w g5p z normalnych ludzkich mózgów. Próbki wzbogacone o g5p traktowano PK i PNGazą F przed sondowaniem Western blot z 1E4 (lewy panel), 1E4 wstępnie inkubowanym syntetycznym peptydem, który miał sekwencję identyczną z epitopem 1E4 (środkowy panel) i anty-C (prawy panel). 1E4 wykrył trzy oporne na PK fragmenty PrP oznaczone jako PrP*²⁰, PrP*¹⁹ i PrP*⁷ (lewy panel). Po zablokowaniu 1E4 peptydem nie wykryto^res PrP (panel środkowy), co wskazuje, że prążki wykryte za pomocą 1E4 są fragmentami PrP. Anti-C ujawnił dwa addycyjne fragmenty PrP odporne na PK, oznaczone jako PrP*¹⁸ i PrP-CTF12/13, oprócz PrP*²⁰.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.