Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w prawidłowym ludzkim mózgu

Podsumowanie

Nowy gatunek komórkowego białka prionowego (PrP^C) został niedawno zidentyfikowany w niezakażonych ludzkich mózgach przy użyciu opisanych tutaj metod. Metody te mogą być wykorzystane do izolacji różnych gatunków PrP, a niektóre z nich są również przydatne w izolacji innych agregatów białek o błędnej strukturze z ludzkich mózgów.

Streszczenie

Kluczowe zdarzenie w patogenezie chorób prionowych polega na konwersji kodowanego przez gospodarza komórkowego białka prionowego PrP^C w jego patogenną izoformę PrP^{Sc 1}. PrP^C jest rozpuszczalne w detergentach i wrażliwe na trawienie proteinazą K (PK), podczas gdy PrP^Sc tworzy nierozpuszczalne w detergentach agregaty i jest częściowo oporne na PK^2-6. Wiadomo, że konwersja PrP^C do PrP^Sc wiąże się z przejściem konformacyjnym struktur białka z helis α w harmonijki β. Jednak ścieżka in vivo pozostaje wciąż słabo poznana. Próba zidentyfikowania w nieinfected mózgu endogennego PrP^Sc, pośredniego PrP* lub „cichego prionu”, nie zakończyła się jeszcze sukcesem⁷.

Wykorzystując kombinację podejść biofizycznych i biochemicznych, zidentyfikowaliśmy nierozpuszczalne agregaty PrP^C (oznaczone jako iPrP^C) w niezinfekowanych mózgach ssaków oraz w hodowlanych komórkach neuronalnych^{8, 9}. W niniejszym materiale opisujemy szczegółowe procedury tych metod, w tym ultrawirowanie w buforze z detergentem, sedymentację w gradientowym stopniu stężeń sacharozy, chromatografię wykluczania cząsteczkowego, wzbogacanie iPrP za pomocą białka genu 5 (g5p), które specyficznie wiąże się ze strukturalnie zmienionymi formami PrP¹⁰, oraz traktowanie PK. Połączenie tych podejść pozwala wyizolować z prawidłowego ludzkiego mózgu nie tylko nierozpuszczalne agregaty PrP^Sc i PrP^C, ale również rozpuszczalne oligomery PrP^C. Ponieważ protokoły opisane w niniejszym opracowaniu były stosowane do izolacji zarówno PrP^Sc z zakażonych mózgów, jak i iPrP^C z niezinfekowanych mózgów, dają nam one możliwość porównania różnic w cechach fizykochemicznych, neurotoksyczności i zakaźności między tymi dwiema izoformami. Takie badanie znacząco poszerzy naszą wiedzę na temat zakaźnych patogenów białkowych. Fizjologia i patofizjologia iPrP^C nie są obecnie jasne. Co istotne, w nowo zidentyfikowanej ludzkiej chorobie prionowej, określanej jako zmiennie wrażliwa na proteazy prionopatia, odkryliśmy nowy PrP^Sc, który wykazuje podobne zachowanie immunoreaktywne i fragmentację co iPrP^{C 11, 12}. Ponadto niedawno wykazaliśmy, że iPrP^C jest głównym gatunkiem oddziałującym z białkiem amyloid-β w chorobie Alzheimera¹³. W tym samym badaniu metody te zostały wykorzystane do izolacji agregatów i oligomerów Abeta w chorobie Alzheimera¹³, co sugeruje możliwość ich zastosowania w przypadku agregatów białek nieprionowych zaangażowanych w inne zaburzenia neurodegeneracyjne.

Protokół

1. Przygotowanie homogenatu mózgu oraz frakcji rozpuszczalnej w detergencie (S2) i nierozpuszczalnej w detergencie (P2)

1. Odważyć 100 mg zamrożonej tkanki mózgu człowieka i dodać 100 μl buforu lizującego (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7.4).
2. Homogenizować próbkę w lodzie za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem akumulatorowym, zamrozić w suchym lodzie przez 5 min, a następnie ponownie homogenizować, najpierw ręcznie, a potem za pomocą silnika, i dodać 300 μl lub 800 μl buforu lizującego (w zależności od tego, czy przygotowywany jest 20% czy 10% całkowity homogenat mózgu).
3. Wirować 20% lub 10% całkowity homogenat mózgu z prędkością 1,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki laboratoryjnej, aby zebrać nadsącz (S1).
4. Ultrawirować 10% S1 z prędkością 35,000 rpm (100,000 x g) w rotorze SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) przez 1 hr w temperaturze 4 °C. Przenieść nadsącze (S2) zawierające frakcję rozpuszczalną w detergencie do czystej probówki. Osad zawierający frakcję nierozpuszczalną w detergencie (P2) resuspendować w 100 μl lub 200 μl buforu lizującego, aby uzyskać preparat 10- lub 5-krotnie zagęszczony.
5. W celu trawienia PK inkubować próbki obu frakcji, S2 i P2, z taką samą ilością PK w stężeniu 50 μg/ml w temperaturze 37 °C przez 1 hr. Dodać fenylometylosulfonylofluorek do stężenia końcowego 5 mM oraz równą objętość buforu do próbek SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-merkaptoetanol, 10% glicerol, 50 mM Tris, pH 6.8), aby zatrzymać trawienie PK. Gotować próbki przez 10 min, a następnie schłodzić w temperaturze pokojowej przez 5 min. Próbki są gotowe do analizy Western blotting.

2. Sedymentacja prędkościowa w skokowych gradientach sacharozy

1. Inkubować 450 μl 20% S1 z równą objętością 2% sarkosylu w H₂O przez 30 min na lodzie.
2. Do probówki Beckman o maksymalnej pojemności 5 ml dodać po 0,5 ml sacharozy w stężeniach 60%, 30%, 25%, 20%, 15% i 10%.
3. Nanieść 0,4 ml S1 na górę skokowego gradientu sacharozy 10-60%.
4. Wirować przy 48 000 rpm (200 000 x g, rotor SW55) przez 1 h w temperaturze 4 °C.
5. Pobrać frakcje o objętości 283 μl każda, zaczynając od góry probówki, aż do uzyskania łącznie 12 frakcji.
6. Przenieść po 20 μl każdej frakcji do nowej probówki Eppendorf, dodać 20 μl buforu do próbek i gotować przez 10 min.
7. Schłodzić próbki przez 4 min pod wyciągiem, wirować przy 1 000 x g przez 1 min, a następnie wymieszać na wortexie. Nanieść próbki na gotowy żel.

3. Chromatografia wykluczania cząsteczkowego

1. Do oznaczenia stanu oligomerycznego cząsteczek PrP należy wykorzystać kulki Superdex 200 HR (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) w kolumnie o wymiarach 1 x 30 cm.
2. Siedem markerów masy cząsteczkowej (Sigma, St. Louis, MI), w tym błękitny dekstran (2,000 kDa), tyreoglobulina (669 kDa), apoferrytyna (443 kDa), β-amylaza (200 kDa), dehydrogenaza alkoholowa (150 kDa), albuminy (66 kDa) oraz anhydraza węglanowa (29 kDa), jest nanoszona niezależnie w stężeniach zalecanych przez firmę Sigma w objętościach próbki wynoszących 200 μl.
3. Objętość elucji błękitnego dekstranu służy do wyznaczenia objętości martwej (V₀ = 8.45 ml), natomiast całkowita objętość (V_t = 24 ml) jest podana w instrukcji produktu. Objętości elucji maksimów (V_e) oblicza się na podstawie chromatogramu i retencji frakcyjnych. Współczynnik podziału K_av (definiujący zachowanie próbki) oblicza się zgodnie z równaniem: K_av = (V_e - V₀)/(V_t - V₀). Krzywą kalibracyjną wyznacza się poprzez naniesienie wartości K_av standardów białkowych względem log MW standardów⁸.
4. Masę cząsteczkową (MW) poszczególnych form PrP odzyskanych w różnych frakcjach FPLC ocenia się na podstawie krzywej kalibracyjnej wygenerowanej podczas filtracji żelowej różnych standardów.
5. Dla każdego przebiegu do kolumny należy wstrzyknąć 200 μl S1 w buforze lizującym zawierającym 1% sarkosylu.
6. Chromatografię przeprowadza się w systemie FPLC (GE Healthcare) przy szybkości przepływu 0.25 ml/min, a frakcje o objętości 0.25 ml każda są zbierane za pomocą kolektora frakcji (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Każdą frakcję o objętości 0.125 ml inkubuje się z 0.5 ml schłodzonego wcześniej metanolu w temperaturze -20 °C przez 2 h.
8. Próbki wiruje się przy 13,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C w mikrowirówce nakładkowej. Należy odrzucić nadsącz, a osad resuspenderować w 20 μl buforu do próbek SDS (zgodnie z opisem powyżej), gotować przez 10 min, schłodzić do temperatury pokojowej, a następnie nanieść na gotowy żel.

4. Wychwytywanie PrP przez g5p

1. Cząsteczkę g5p (100 μg) (uprzejmie udostępnioną przez dr. Geoffa Kneale'a i dr. Johna McGeehana z University of Portsmouth, Wielka Brytania) sprzęga się z 7 x 10⁸ magnetycznymi kuleczkami aktywowanymi tosylanem poprzez inkubację 100 μg g5p oraz 350 μl kuleczek g5p w 1 ml fosforanu soli buforowej (PBS) w temperaturze 37 °C przez 20 hr. Kuleczki g5p przyciąga się do ścianki probówek Eppendorf za pomocą zewnętrznego pola magnetycznego, a następnie usuwa cały roztwór. Kuleczki przemywa się trzykrotnie 1 ml PBS zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
2. Kuleczki sprzężone z g5p inkubuje się w 1 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 zawierającego 0,1% BSA w temperaturze 37 °C przez 5 hr w celu zablokowania nieswoistego wiązania, a następnie przemywa się kuleczki trzykrotnie 1 ml PBS zawierającego 0,1% BSA w sposób opisany powyżej. Roztwór usuwa się i dodaje do kuleczek 1 ml PBS. Przygotowane kuleczki g5p są stabilne przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze 4 °C.
3. Wychwytywanie PrP przez g5p przeprowadza się poprzez inkubację 100 μl frakcji S1 lub P2 z 60 μl kuleczek sprzężonych z g5p (10 μg białka/6 X 10⁷ kuleczek) w 1 ml buforu wiążącego (3% Tween-20, 3% NP-40 w PBS, pH 7,5).
4. Po inkubacji przy stałej rotacji przez 3 hr w temperaturze pokojowej kuleczki g5p zawierające PrP są przyciągane do ścianki probótek Eppendorf za pomocą zewnętrznego pola magnetycznego, co umożliwia łatwe usunięcie wszystkich niewiązanych cząsteczek z roztworu.
5. Po trzykrotnym przemyciu w buforze płuczącym (2% Tween-20 i 2% NP-40 w PBS, pH 7,5) kuleczki g5p zbiera się i podgrzewa do 95 °C przez 5 min w buforze do próbek SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glicerolu, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
6. Po schłodzeniu próbek przez 5 min w temperaturze pokojowej, próbki wiruje się przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Nadosady są gotowe do analizy metodą Western blotting.

5. Western blotting

1. Próbki zagotowane w buforze do próbek SDS nanosi się na gotowe żele 15% Tris-HCl Criterion (Bio-Rad), prowadząc elektroforezę przy 150 V przez ok. 80 min.
2. Białka z żeli przenosi się na membranę PVDF przez 2 h przy 70 V.
3. Po zablokowaniu membran w 5% mleku w soli buforowanej trisem zawierającej 0,01% Tween-20 (TBS-T), membrany inkubuje się przez 2 h w temperaturze pokojowej z przeciwciałami pierwszorzędowymi: monoklonalnymi lub poliklonalnymi 3F4 (1:40 000), 1E4 (1:1 000), anti-N⁸ (1:6 000) lub anti-C⁸ (1:6 000) w celu detekcji cząsteczki PrP.
4. Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi: owczymi anty-mysimi IgG sprzężonymi z HRP w rozcieńczeniu 1:3000 lub osiołkowymi anty-króliczymi IgG w rozcieńczeniu 1:3 000, prążki PrP wizualizuje się na filmie Kodak przy użyciu zestawu ECL Plus, zgodnie z protokołem producenta.

6. Reprezentatywne wyniki

W porównaniu z próbkami sporadycznego CJD, w frakcji P2 w normalnych mózgach wykryto niewielką ilość iPrP^C, choć większość PrP^C odzyskano we frakcji S2 (Rysunek 1). Jak wskazano wcześniej⁸, iPrP stanowi około 5-25% całkowitej ilości PrP, wliczając w to formy pełnowymiarowe oraz ucięte z N-końca.

Analizy z wykorzystaniem sedymentacji w gradientie stopniowym sacharozy wykazały, że o ile większość PrP^C z mózgów osób bez CJD odzyskano w górnych frakcjach 1-3, o tyle niewielkie ilości PrP wykryto również w dolnych frakcjach 9-11, które zazwyczaj zawierają duże agregaty⁸ (Rycina 2).

Za pomocą filtracji żelowej w mózgu z chorobą Creutzfeldta-Jakoba wyizolowano różne gatunki PrP^Sc, od monomerów i małych oligomerów po większe agregaty (Rysunek 3A). Jednakże w frakcjach nierozpuszczalnych prawidłowych mózgów wykryto również niewielką ilość większych agregatów o masie cząsteczkowej przekraczającej 2 000 kDa (Rysunek 3C). Co więcej, dimery i tetramery PrP^C wykryto nie tylko we frakcjach nierozpuszczalnych, ale również we frakcjach rozpuszczalnych (Rysunek 3B i 3C).

Po traktowaniu PK i PNGazą, PrP wychwycone przez g5p wykryto za pomocą przeciwciała 1E4 przeciwko PrP97-105 ⁸. Wykryto trzy oporne na PK fragmenty rdzenia, nazwane PrP*²⁰, PrP*¹⁹ oraz PrP*⁷, które migrowały odpowiednio na poziomie ~20 kDa, ~19 kDa i ~7 kDa (Rycina 4, panel lewy). Jednakże nie wykryto PrP, gdy przeciwciało 1E4 poddano inkubacji wstępnej z syntetycznym peptydem o sekwencji identycznej z epitopem 1E4 (Rycina 4, panel środkowy), co wskazuje, że prążki wykryte przez 1E4 są fragmentami PrP. Ponadto przeciwciało anty-C ujawniło dwa różne fragmenty PrP migrujące na poziomie ~18 kDa (PrP*¹⁸) i ~12-13 kDa (PrP-CTF12/13), oprócz PrP*²⁰ (Rycina 4, panel prawy).

Rysunek 1. Wykrywanie iPrP^C oraz iPrP^Sc. Po traktowaniu PNGazą F w ilości 1/10 całkowitej objętości reakcji w temperaturze 37 °C przez 1 hr w celu usunięcia glikanów z białka, pełnowymiarowe lub ucięte z końca N-końcowego formy PrP w frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych (S2 i P2) wyizolowanych przez ultrawirowanie z próbek mózgu od zdrowej kontroli (CTL) oraz pacjentów z sCJD (sCJD) wykryto za pomocą przeciwciał 3F4 przeciwko PrP106-112 (panel lewy), anti-N przeciwko PrP23-40 (panel środkowy) oraz anti-C przeciwko PrP220-231 (panel prawy). W próbkach CTL niewielka ilość PrP jest wykrywana w P2, podczas gdy duża ilość występuje w S2. W przeciwieństwie do tego, w próbkach sCJD w P2 wykrywanych jest więcej PrP niż w S2.

Rysunek 2. Sedymentacja PrP w gradientach schodkowych sacharozy. PrP w poszczególnych frakcjach od 1 do 11 próbki mózgu S1 (brak CJD) wykryto metodą Western blotting z użyciem przeciwciała 3F4. Chociaż większość PrP^C wykryto w górnych frakcjach 1-3, niewielkie ilości PrP zaobserwowano również w dolnych frakcjach 9-11. Ponadto wzór prążkowania PrP z górnych i dolnych frakcji jest inny: PrP odzyskane z frakcji górnych wykazuje dominujący prążek górny, natomiast PrP odzyskane z frakcji dolnych wykazuje dominujący prążek dolny. Jako kontrola, po prawej stronie blotu, naniesiono PrP^Sc traktowane PK.

Rysunek 3. Wykrywanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP^C. Rozpuszczalne i nierozpuszczalne PrP^C z normalnych ludzkich mózgów rozdzielono metodą ultrawirowania, a następnie poddano odpowiednio filtracji żelowej. Wielkości cząsteczkowe poszczególnych frakcji zmierzono za pomocą zestawu markerów masy cząsteczkowej. (A) Gatunki PrP^Sc z próbek mózgu sCJD. Wykryto dwie populacje gatunków PrP: frakcje filtracji żelowej 49 - 65 zawierają monomery i małe oligomery, natomiast frakcje 27-33 zawierają duże agregaty. Wykryto gatunki PrP^C z frakcji rozpuszczalnej (S2) (B) i frakcji nierozpuszczalnej (P2) (C) normalnych kontroli. PrP wykryto za pomocą przeciwciała 3F4. Dimery (frakcja 55) i tetramery (frakcja 51) PrP wykryto nie tylko w P2, ale także w S2 próbek normalnego mózgu (B i C). Duże agregaty wykryto wyłącznie w P2 próbek normalnych (C).

Rycina 4. Detekcja różnych PK-opornych fragmentów iPrP w preparatach wzbogaconych g5p z normalnych ludzkich mózgów. Próbki wzbogacone g5p poddano działaniu PK oraz PNGase F przed analizą Western blotting z użyciem przeciwciał 1E4 (panel lewy), 1E4 inkubowanych wcześniej z syntetycznym peptydem o sekwencji identycznej z epitopem 1E4 (panel środkowy) oraz przeciwciał anti-C (panel prawy). Przeciwciała 1E4 wykryły trzy PK-oporne fragmenty PrP nazwane PrP*²⁰, PrP*¹⁹ oraz PrP*⁷ (panel lewy). Po zablokowaniu 1E4 peptydem nie wykryto PrP^res (panel środkowy), co wskazuje, że prążki wykryte za pomocą 1E4 są fragmentami PrP. Przeciwciała anti-C ujawniły dwa dodatkowe PK-oporne fragmenty PrP nazwane PrP*¹⁸ oraz PrP-CTF12/13, poza PrP*²⁰.

Dyskusja

Opisana tutaj kombinacja podejść pozwala na wyizolowanie konsekwentnie nierozpuszczalnego białka PrP^C agregaty i rozpuszczalne PrP^C oligomery z normalnego ludzkiego mózgu. Ultracentryfugacja przy 100 000 x g przez jedną godzinę to klasyczna metoda, która była szeroko stosowana do oddzielania nierozpuszczalnego PrP^Sc z rozpuszczalnego PrP^{C 14}Mimo że metoda ta jest wydajna, jedną z kwestii wymagających ostrożności jest unikanie kontaminacji podczas pobierania supernatantu (S2) po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluorek fenylometylosulfonylowy	Sigma-Aldrich	P7626	72 mM w 2-propanolu
Proteinaza K	Sigma-Aldrich	P2308	2 mg/ml w H2O
PNGaza F	New England Biolabs	MWGF200
Ultracentryfuga LE-80K, rotor SW55	Beckman Coulter	Nr kat. 365668, 356860
Kuleczki Superdex 200 HR	GE Healthcare	17-1088-01
System AKTA FPLC	GE Healthcare	18-1900-26
Markery masy cząsteczkowej	Sigma-Aldrich	MWGF200	Różne
Magnetyczne kuleczki Dynabeads M-280	Invitrogen	143-01
Przeciwciało 3F4	Covance	SIG-39600
Przeciwciało 1E4	Cell Sciences	M1840
Gotowe żele odlewane 15% Tris-HCl	Bio-Rad	345-0020