Długoterminowy test toksyczności letalnej z wykorzystaniem skorupiaka Artemia franciscana

Podsumowanie

Niniejsza praca dotyczy opracowania i standaryzacji wartościowego protokołu metodycznego służącego do określania długoterminowej (14-dniowej) toksyczności letalnej substancji chemicznych, ścieków przemysłowych lub komunalnych oraz ciekłych próbek środowiskowych wobec słonawodnego skorupiaka Artemia franciscana.

Streszczenie

Nasza działalność badawcza koncentruje się na wykorzystaniu metod biologicznych do oceny jakości środowiska, ze szczególnym uwzględnieniem wód słonych/sosnowych oraz osadów. Wybór wskaźników biologicznych musi opierać się na rzetelnej wiedzy naukowej i, w miarę możliwości, na dostępności zestandaryzowanych procedur. W niniejszym artykule przedstawiamy zestandaryzowany protokół wykorzystujący morskiego skorupiaka Artemia do oceny toksyczności substancji chemicznych i/lub morskich matryc środowiskowych. Naukowcy sugerują, że solniczka (Artemia) jest odpowiednim kandydatem do opracowania standardowego bioanalizy do powszechnego zastosowania na świecie. Opublikowano szereg prac na temat toksycznego wpływu różnych substancji chemicznych i toksyn na solniczkę (Artemia). Główną zaletą tego skorupiaka w badaniach toksyczności jest ogólna dostępność suchych cyst; mogą one być natychmiast użyte w testach, co eliminuje konieczność prowadzenia trudnych hodowli^1,2. Testy toksyczności oparte na cystach są tanie, stale dostępne, proste i wiarygodne, stanowiąc tym samym istotną odpowiedź na rutynowe potrzeby screeningu toksyczności, wymogi monitoringu przemysłowego lub cele regulacyjne³. Zaproponowana metoda przyjmuje śmiertelność jako punkt końcowy. Zliczono liczbę osobników, które przeżyły, i obliczono procent zgonów. Larwy uznawano za martwe, jeśli nie wykazywały żadnego ruchu wewnętrznego ani zewnętrznego podczas kilkusekundowej obserwacji⁴. Procedura ta została zestandaryzowana poprzez przetestowanie substancji referencyjnej (dodecylosiarczan sodu); niektóre wyniki przedstawiono w niniejszej pracy. Artykuł ten towarzyszy filmowi opisującemu przeprowadzenie procedury testowania toksyczności, prezentującemu wszystkie kroki związane z protokołem.

Protokół

1. Standard Metoda

Nasze badanie polega na narażeniu larw Artemia na szereg stężeń substancji lub próbkę testową w celu wyznaczenia stężenia lub stopnia rozcieńczenia, które spowoduje śmierć 50% organizmów (LC₅₀) narażonych przez 14 dni w warunkach zdefiniowanych w niniejszej metodzie. Jeśli jest to konieczne i możliwe, można również wyznaczyć: a) poziom stężenia powodujący śmierć 20% narażonych organizmów (LC₂₀); b) najwyższy analizowany poziom stężenia, który nie powoduje wyższej śmiertelności niż w przypadku kontroli negatywnej (NOEC); najniższy testowany poziom stężenia, który po 14 dniach powoduje wyższą śmiertelność niż w przypadku kontroli negatywnej (LOEC).

2. Materiały do badań

2.1 Jaja Artemia

Do przeprowadzenia testów wymagane są larwy Artemia franciscana w wieku poniżej 48 godzin (naupliusy), w stadium II lub III, uzyskane z nowo wyklutych jaj⁵. Certyfikowane jaja lub cysty wykorzystywane do testów są dostępne w sprzedaży, np. z Quality Assurance Research Division, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, U.S.A. lub z Laboratory for Biological Research in Aquatic Pollution, University of Ghent, Belgia.

2.2 Rozcieńczenie wodą

Jako woda do rozcieńczeń można zastosować syntetyczną wodę morską, przygotowaną poprzez rozpuszczenie uznanych odczynników o czystości analitycznej lub dostępnego komercyjnie preparatu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. W sprzedaży dostępne są gotowe mieszanki soli do przygotowania optymalnej wody morskiej, np. mieszanki Instant Ocean. Zaleca się stosowanie wody do rozcieńczeń o zasoleniu równym 35 (±2) PSU, stężeniu tlenu rozpuszczonego przekraczającym 80% wartości nasycenia oraz temperaturze 25 (±2) °C. Po napowietrzaniu przez 48 godzin i filtracji przez filtry o porowatości co najmniej 0,45 μm, roztwór do rozcieńczeń może być przechowywany przez maksymalnie 30 dni w ciemności w temperaturze 0-4 °C.

2.3 Hodowla alg

Zaleca się, aby organizmy testowe były karmione mikroalgami Dunaliella tertiolecta, które rosną wykładniczo i osiągają zagęszczenie od 1,3x10⁶ do 2,0x10⁶ cells/ml. Badania na próbkach środowiskowych wymagają kultur o zagęszczeniu przekraczającym 2,0x10⁶ cells/ml⁶. Sugeruje się, aby Dunaliella tertiolecta rosła w pożywce zawierającej wodę morską (30 (±2) PSU i 20 (±1) °C) z dodatkiem niezbędnych składników odżywczych, minerałów i witamin. Niektóre wskazówki dotyczące składu i przygotowania pożywki dla alg znajdują się w Dodatku. Sugerowane początkowe zagęszczenie komórek wynosi około 10⁵ cells/ml. Kulturę alg utrzymuje się w pomieszczeniu z termostatem w temperaturze 20 (± 1) °C, oświetlonej lampami fluorescencyjnymi o natężeniu 3000 (± 300) lx, z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin światła i 8 godzin ciemności.

Do karmienia można wykorzystać również inne gatunki fitoplanktonu, jednak konieczne byłoby przeprowadzenie badań porównawczych z tymi gatunkami w celu znalezienia gatunku „równoważnego” Dunaliella tertiolecta, ponieważ warunki eksperymentalne (np. początkowe zagęszczenie komórek, oświetlenie, temperatura, skład pożywek i czas ekspozycji) różnią się w zależności od gatunku fitoplanktonu. Ponadto należy wziąć pod uwagę tolerancję mikroalg na różne zanieczyszczenia, ponieważ wpływ zanieczyszczeń na wzrost i rozwój fitoplanktonu oddziałuje również na Artemia.

2.4 Substancja referencyjna

Substancją odniesienia w tym teście jest dodecylosiarczan sodu.

2.5 Szkło laboratoryjne

Oprócz standardowego wyposażenia laboratoryjnego potrzebne są następujące materiały:

1. Pojemniki testowe, w tym zlewki borokrzemowe o pojemności 100 ml (18 do przeprowadzania testów i 18 do przenoszenia roztworów).
2. Kolba (np. kolba 500 ml) do przygotowania roztworu wzorcowego.
3. Sześć kolb (np. kolby 200 ml) do przygotowania roztworów testowych.
4. Szklane lub polistyrenowe płytki Petri o średnicy 5 cm z wyjmowanymi pokrywkami, służące do aktywacji cyst i przenoszenia Artemia z naczynia wylęgowego do pojemników testowych.
5. Szklane pipety Pasteura (z końcówkami zaokrąglonymi nad płomieniem) do przenoszenia naupliów.
6. Szklane kaniule lub jednorazowe plastikowe pipety Pasteura o pojemności 3 ml (do przycięcia) do przenoszenia Artemia.
7. Mikropipety i pipety pomiarowe do przygotowania roztworów testowych.
8. Sześć cylindrów miarowych (np. cylindry 50 ml) do przenoszenia roztworów testowych z kolb do pojemników testowych.

3. Aktywacja cyst

3.1. Szalki Petriego zawierające cysty + dolewanie wody

W celu przygotowania organizmów testowych, na 48 godzin przed badaniem, 20 mg cyst umieszcza się w płytce Petri zawierającej 12 ml wody do rozcieńczeń.

3.2. Inkubacja na świetle i w ciemności

Szalkę Petriego utrzymuje się w temperaturze 25 (±2) °C i przy natężeniu światła 4000 (±1000) lux (lumenów na metr kwadratowy) przez jedną godzinę.

3.3. Wymiana pożywki z wykorzystaniem mikroskopu

Po 24 godzinach wykluwające się larwy przenosi się do nowej szalki Petriego wypełnionej sztuczną wodą. Przenoszenie odbywa się przy użyciu mikroskopu, tj. z wykorzystaniem źródła światła, dzięki któremu fototropowe larwy migrują w stronę wiązki światła. Do przenoszenia używa się szklanej pipety Pasteura, dbając o to, aby przenosić wyłącznie nowo wyklute larwy, a nie cysty lub larwy wciąż znajdujące się w błonach.

3.4. Inkubacja w ciemności

Szalkę zawierającą larwy umieszcza się w ciemnej komorze termostatycznej na 24 godziny w temperaturze 25 (±2) °C.

4. Przygotowanie roztworów testowych

4.1. Odważenie substancji i przeniesienie do kolby

Zaleca się, aby roztwór wzorcowy substancji badanej przygotować poprzez rozpuszczenie 0,5 g substancji w kolbie o pojemności 500 ml. Kolbę dopełnia się wodą dejonizowaną lub destylowaną, a roztwór miesza do całkowitego rozpuszczenia substancji badanej. Roztwory należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem, chyba że nie jest znane, czy substancja jest stabilna w roztworze. W takim przypadku roztwór wzorcowy można przygotować do dwóch dni przed badaniem.

4.2. Przygotowanie kontroli negatywnej, dodawanie wody do rozcieńczania i alg za pomocą pipety 10 ml

Kontrolę negatywną przygotowuje się w kolbie (np. o objętości 200 ml), dodając alikwot zawiesiny glonów do wody do rozcieńczeń w taki sposób, aby uzyskać gęstość 10⁵ cells/ml.

4.3. Przygotowanie roztworów testowych: dodawanie wody do rozcieńczenia, alg i roztworu standardowego

Sugeruje się, aby roztwory testowe przygotować w pięciu kolbach o pojemności 200 ml, dodając roztwór wzorcowy do wody rozcieńczającej w określonych ilościach, tak aby uzyskać pożądane stężenia do testów. W celu karmienia organizmów można zastosować alikwoty zawiesiny mikroalg Dunaliella tertiolecta, dodając je podczas przygotowywania roztworów testowych do osiągnięcia gęstości 10⁵ cells/ml. Zaleca się następującą kolejność dodawania: woda rozcieńczająca, zawiesina alg i roztwór wzorcowy. Po przygotowaniu roztwory testowe należy wykorzystać w analizie tak szybko, jak to możliwe.

4.4. Przenoszenie roztworów z kolby do naczyń testowych, a następnie na szalki Petriego

Do naczyń testowych za pomocą cylindra miarowego wprowadza się równe ilości (50 ml) roztworów testowych. Dla każdego stężenia wykonuje się trzy powtórzenia. Dla każdej serii testów przygotowuje się naczynie kontrolne z ilością wody do rozcieńczeń równą objętości roztworów testowych. Do szalek Petriego wprowadza się równe objętości (około 12 ml) roztworów testowych. Dla każdej serii testów wykorzystuje się kontrolną szalkę Petriego.

5. Przygotowanie do testów

5.1. Nauplii w stadium II-III

Czterdzieści osiem godzin po aktywacji cyst nauplii osiągają II-III stadium larwalne i mogą być wówczas wykorzystane do testów.

5.2. Przenoszenie naupliów do szalek Petriego przy użyciu mikroskopu

Szalka Petriego używana do aktywacji cyst zostaje wyjęta z komory termostatycznej. Niewielka ilość larw zostaje przeniesiona do szalek Petriego zawierających roztwory kontrolne i badawcze. Czynność tę należy przeprowadzić pod mikroskopem, używając pipety o odpowiednio dużej średnicy, tak aby nie uszkodzić organizmów. Na tym etapie testu przenoszenie można przeprowadzić za pomocą szklanej pipety Pasteura (z końcówką zaobloną nad płomieniem) oraz przy zastosowaniu bocznego źródła światła, które pobudza Artemia do agregacji.

5.3. Przenoszenie naupliów z szalek Petriego do naczyń testowych przy użyciu mikroskopu

Dziesięć larw przenosi się z szalek Petri z roztworami testowymi do pojemników testowych. Operację tę należy przeprowadzić przy użyciu pipety Pasteura i mikroskopu. Zaleca się, aby podczas przenoszenia larw nie przekraczać objętości 1 mL, aby nie wpływać na całkowitą objętość układu testowego.

5.4. Wypełnione pojemniki przykryto parafilmem

Zlewki testowe są przykryte parafilmem (z pozostawieniem szczeliny dla przepływu powietrza) i utrzymywane w temperaturze 25 (±2) °C przez cały czas trwania testu oraz przy oświetleniu 900 (±100) lx z fotoperiodem wynoszącym 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.

6. Wymiana pożywki i suplementu pokarmowego

6.1. Kontrola przeżywalności

Dwa dni po rozpoczęciu testu, a następnie po 5, 7, 9 i 12 dniach, Artemia jest obserwowana pod mikroskopem w celu weryfikacji przeżywalności oraz wymiany medium i suplementu pokarmowego.

W każdym naczyniu testowym zlicza się liczbę żywych organizmów. Po obserwacji pod mikroskopem i lekkiej stymulacji mechanicznej (np. dotknięciu larw szklaną pipetą Pasteura) organizmy, które nie wykazują żadnego ruchu przez około 10 sekund, należy uznać za martwe.

6.2. Przygotowanie roztworu testowego poprzez pobranie alg za pomocą pipety 10 ml oraz pobranie testowanej substancji za pomocą mikropipety. Przeniesienie roztworów z kolby do naczyń testowych

Podczas testowania roztwory testowe należy okresowo wymieniać i przygotowywać w dniu, w którym mają zostać użyte. Roztwory testowe sporządza się z wcześniej przygotowanego roztworu wzorcowego.

6.3. Przeniesienie Artemia za pomocą uciętej pipety Pasteura ze starych naczyń testowych do trzech nowych naczyń

Przenoszenie Artemia odbywa się za pomocą pipety o odpowiednio szerokiej średnicy, aby nie uszkodzić organizmów. Na tym etapie można zastosować plastikową pipetę Pasteura o pojemności 3 ml (po uprzednim odcięciu końcówki).

6.4. Larwy w zlewce zawierającej żywe lub martwe Artemia

Po 14 dniach ekspozycji, pod koniec testu, zlicza się liczbę przeżyłych larw i zapisuje ją w arkuszu roboczym. Oblicza się i zapisuje wartości LC₅₀ i/lub LC₂₀, NOEC oraz LOEC po 14 dniach, a także, w razie potrzeby, przedziały ufności na poziomie 95 % oraz zastosowane metody obliczeniowe.

7. Reprezentatywne wyniki

Po zakończeniu testu (14 dni) oblicz procent śmiertelności dla każdego stężenia zgodnie z poniższym wzorem:

(M_s/N) * 100

Gdzie:

M_s to średnia liczba osobników, które padły w analizowanej próbce

N to całkowita liczba osób narażonych

Tabela 1 przedstawia przykładowe dane z testu (14 d) z wykorzystaniem Artemia eksponowanych na dodecylosiarczan sodu.

Stężenia (mg/l)	Liczba martwych osobników w każdej powtórce			Śmiertelność (%)
	I	II	III
Kontrola negatywna	0	2	1	10
1.56	1	2	0	10
3.12	2	0	2	13
6.25	3	2	3	27
12.5	8	9	10	90
25.0	10	10	10	100
50.0	10	10	10	100

Ponadto należy wyznaczyć wartość LC₅₀ za pomocą graficznego wykresu logarytmicznego Gaussa lub stosując odpowiednie metody statystyczne (na przykład metodę Spearmana-Karbera lub metodę Probit). Obliczona wartość LC₅₀ dla danych z tabeli 1 wynosi 8,18 (7,15-9,37) mg/l. Jeśli maksymalne przetestowane stężenie spowodowało śmiertelność niższą niż 50%, nie należy przystępować do obliczania wartości LC₅₀, która byłaby wówczas niewiarygodna lub wręcz niemożliwa do obliczenia. W takim przypadku właściwe byłoby powtórzenie testu poprzez rozszerzenie zakresu badanych stężeń. Alternatywnie wartość LC₅₀ można określić jako większą niż najwyższe przetestowane stężenie, podając ewentualnie procent śmiertelności przy tym stężeniu oraz najwyższe stężenie, przy którym nie stwierdzono efektu.

Wyniki uznaje się za ważne, jeśli po zakończeniu testów spełnione zostały następujące warunki:

1. średnia śmiertelność w grupie kontrolnej wynosi ≤ 20 %;
2. w przypadku zastosowania dodecylosiarczanu sodu, wartość LC₅₀ po 14 dniach mieści się w przedziale 8,0 (±5) mg/l.

Jeśli powyższe warunki nie zostały spełnione, wszystkie dane uzyskane z tej samej partii organizmów należy uznać za nieważne i powtórzyć badanie.

Dyskusja

Artemia jest jednym z najcenniejszych organizmów testowych dostępnych do badań ekotoksyczności, a dotychczasowe badania pozwalają stwierdzić, że możliwe jest zastosowanie kilku opcji związanych z wykorzystaniem Artemia w toksykologii i ekotoksykologii. Cechy, które czynią ten organizm odpowiednim gatunkiem do bioassayów, to: szeroki zasięg geograficzny, wysoka zdolność adaptacji do niekorzystnych warunków środowiskowych i zróżnicowanych składników odżywczych, stosunkowo prosta hodowla i utrzymanie labor...