W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym badaniu opisujemy skuteczny protokół do zastosowania w multipleksowej wysokoprzepustowej mikrotablicy przeciwciał z detekcją białek wiążących glikany, który umożliwia profilowanie glikozylacji specyficznych białek. Glikozylacja białek jest najpowszechniejszą modyfikacją potranslacyjną występującą w białkach, która prowadzi do zróżnicowanych zmian ich właściwości fizycznych, chemicznych i biologicznych. Ponieważ mechanizm glikozylacji jest szczególnie podatny na postęp choroby i transformację złośliwą, aberracyjna glikozylacja została uznana za biomarker wczesnego wykrywania raka i innych schorzeń. Jednakże obecne metody badania glikozylacji białek są zazwyczaj zbyt skomplikowane lub kosztowne, aby można je było stosować w większości standardowych warunków laboratoryjnych lub klinicznych, w związku z czym istnieje potrzeba opracowania bardziej praktycznej metody badania glikozylacji białek. Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu wykorzystuje chemicznie blokowaną mikrotablicę przeciwciał z detekcją białek wiążących glikany (GBP), co znacząco redukuje czas, koszty oraz wymagania sprzętowe niezbędne do badania glikozylacji białek. W tej metodzie wiele unieruchomionych przeciwciał specyficznych dla glikoprotein jest nanoszonych bezpośrednio na szkiełka mikrotablicy, a N-glikany na przeciwciałach zostają zablokowane. Zablokowane, unieruchomione przeciwciała specyficzne dla glikoprotein są w stanie wychwycić i wyizolować glikoproteiny z kompleksowej próbki naniesionej bezpośrednio na szkiełka mikrotablicy. Detekcja glikanów może być następnie przeprowadzona poprzez naniesienie biotynylowanych lektyn i innych GBP na szkiełko mikrotablicy, natomiast poziomy wiązania można określić przy użyciu Dylight 549-Streptavidiny. Dzięki zastosowaniu panelu przeciwciał i sondowaniu wieloma biotynylowanymi lektynami, metoda ta pozwala na skuteczne opracowanie profilu glikozylacji różnych białek obecnych w danej próbce ludzkiej lub zwierzęcej.
Wstęp
Glikozylacja białek, będąca najpowszechniejszą modyfikacją potranslacyjną białek, zmienia ich właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne oraz odgrywa fundamentalną rolę w różnych procesach biologicznych1-6. Ponieważ aparat glikozylacyjny jest szczególnie podatny na progresję chorób i transformację złośliwą, aberracyjna glikozylacja została uznana za biomarker wczesnego wykrywania raka i innych schorzeń 7-12. W rzeczywistości większość obecnych biomarkerów nowotworowych, takich jak frakcja L3 α-1 fetoproteiny (AFP) dla raka hepatokomórkowego 13-15 oraz CA199 dla raka trzustki 16, 17, to aberracyjne fragmenty glikanów w glikoproteinach. Jednak metody badania glikozylacji białek są skomplikowane i nie nadają się do rutynowego zastosowania w warunkach laboratoryjnych i klinicznych. Chen et al. opracowali niedawno macierz przeciwciał z blokowaniem chemicznym wraz z metodą detekcji białek wiążących glikany (GBP) do wysokoprzepustowego i multipleksowego profilowania glikozylacji natywnych glikoprotein w złożonej próbce 18. W tej metodzie macierzy opartej na powinowactwie wiele unieruchomionych przeciwciał specyficznych dla glikoprotein wychwytuje i izoluje glikoproteiny z złożonej mieszaniny bezpośrednio na płytce macierzy, a następnie glikany na każdym poszczególnym wychwyconym białku są mierzone za pomocą GBP. Ponieważ wszystkie normalne przeciwciała zawierają N-glikany, które mogłyby być rozpoznawane przez większość GBP, krytycznym krokiem tej metody jest chemiczne zablokowanie glikanów na przeciwciałach, aby zapobiec ich wiązaniu z GBP. W procedurze grupy cis-diolowe glikanów w przeciwciałach zostały najpierw utlenione do grup aldehydowych przy użyciu NaIO4 w buforze octanu sodu z osłoną przed światłem. Grupy aldehydowe skoniugowano następnie z grupą hydrazydową łącznika, 4-(4-N-maleimidylofenylo)maślanu hydrazydowego HCl (MPBH), a następnie skoniugowano didektyd Cys-Gly z grupą maleimidową MPBH. W ten sposób grupy cis-diolowe w glikanach przeciwciał zostały przekształcone w rozbudowane grupy niehydroksylowe, co uniemożliwiło wiązanie lektyn i innych GBP do przeciwciał wychwytujących. Procedura blokowania ta sprawia, że GBP i lektyny wiążą się wyłącznie z glikanami wychwyconych białek. Po tym chemicznym blokowaniu próbki surowicy inkubowano z macierzą przeciwciał, a następnie wykryto glikany za pomocą różnych biotynylowanych lektyn i GBP, wizualizując je za pomocą Cy3-streptawidyny. Równoległe zastosowanie panelu przeciwciał i wielu sond lektynowych pozwala na uzyskanie oddzielnych profili glikozylacji wielu białek w danej próbce 18-20. Metoda ta była z sukcesem stosowana w wielu różnych laboratoriach 1, 7, 13, 19-31. Jednak stabilność MPBH i Cys-Gly oraz skomplikowana i czasochłonna procedura wpływają na powtarzalność, skuteczność i wydajność tej metody. W nowym protokole zastąpiliśmy zarówno MPBH, jak i Cys-Gly jednym, znacznie bardziej stabilnym odczynnikiem – hydrazydem kwasu glutaminowego (Glu-hydrazydem), co znacząco poprawiło powtarzalność metody oraz uprościło i skróciło całą procedurę tak, aby można było ją ukończyć w ciągu jednego dnia roboczego. W tym nowym protokole opisujemy szczegółową procedurę, która może zostać łatwo przyjęta przez standardowe laboratoria do rutynowych badań glikozylacji białek, oraz techniki niezbędne do uzyskania powtarzalnych i odtwarzalnych wyników.
Protokół
1. Wydrukuj mikroarray przeciwciał do analizy
- Rozcieńczyć wszystkie przeciwciała do stężenia 0,5 mg/ml w buforze fosforanowym (PBS), pH 7,2.
- Nanieść aliquoty po 40 μl każdego przeciwciała na płytkę źródłową 384-dołkową.
- Załadować płytkę źródłową 384-dołkową do urządzenia do nanoszenia mikromacierzy Scienion sciFLEXARRAYER.
- Załadować 20 szkiełek do mikromacierzy PATH jako docelowe do urządzenia.
- Skonfigurować urządzenie tak, aby nanosić 48 identycznych podmacierzy, w których 27 przeciwciał i białek kontrolnych jest naniesionych w trzech powtórzeniach w układzie 9x9 (Rycina 1E, 1F).
- Uruchomić proces nanoszenia mikromacierzy przeciwciał na szkiełka.
- Zebrać szkiełka z mikromacierzami przeciwciał i przechowywać je w kasecie na szkiełka z pochłaniaczem wilgoci. Zamknąć kasetę próżniowo w plastikowej torebce za pomocą zgrzewarki próżniowej (Foodsaver).
- Przechowywać szczelnie zamknięte szkiełka z mikromacierzami w temperaturze 4 °C w lodówce.
2. Chemiczne blokowanie mikroarray przeciwciał w celu zapobiegania wiązaniu GBP z przeciwciałami wychwytującymi
Analiza mikromacierzy rozpoczyna się po chemicznym blokowaniu szkiełek i trwa około 8 godzin. Po rozpoczęciu analiza mikromacierzowa musi zostać przeprowadzona do końca (Kroki 2–8).
- Wyjąć preparaty mikroarray z lodówki i pozostawić je na 30 minut w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.
- Wyjąć preparat z pudełka do przechowywania i krótko opłukać go najpierw w buforze fosforanowym z solą pH 7,2 z dodatkiem 0,1% Tween 20 (PBST0.1), a następnie w buforze octanu sodu 15 mM pH 5,0 z dodatkiem 0,1% Tween (CBT0.1), kolejno w kuwecie do mycia preparatów. Inkubować preparaty w CBT0.1 przez 10 minut w kuwecie do mycia.
- Przygotować świeży roztwór 150 mM NaIO4 w buforze octanu sodu 15 mM pH 5,0 (CB) i przechowywać go w kuwecie do mycia preparatów w lodówce, chroniąc przed światłem do momentu użycia.
- Wyjąć preparat z CB i umieścić go w kuwecie zawierającej świeży NaIO4 stroną z przeciwciałami do góry. Przykryć kuwetę folią aluminiową, aby uniknąć dostępu światła, i inkubować preparat przez 2 godziny przy delikatnym wstrząsaniu w temperaturze 4 °C w lodówce.
- Przygotować 300 mL 10 mM hydrazydowego kwasu glutaminowego (blokera) w CB.
- Wyjąć preparat z kuwety i krótko opłukać go w CB 3 razy po 5 minut za każdym razem w kuwecie do mycia preparatów.
- Inkubować preparaty w blokerze w kuwecie do mycia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu.
- Wyjąć preparaty z kuwety i przemyć je w PBST0.1 przez 3 minuty.
3. Blokowanie nieswoistych wiązań na mikromacie za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
- Przygotuj 300 ml 1% BSA w buforze fosforanowym pH 7.2 z 0.5% Tween (PBST0.5) w kuwecie do mycia szkiełek i inkubuj szkiełko z mikromacierzą w kuwecie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu.
- Płucz szkiełka w PBST0.1 trzykrotnie, za każdym razem przez 3 minuty.
- Umieść szkiełko w statywie i wirować przy 1,200 x g w wirówce przez 2 minuty, aby osuszyć szkiełko z mikromacierzą.
4. Odciśnięcie woskowej siatki na szkiełku mikromacierzy w celu oddzielenia poszczególnych podmacierzy
- Podgrzewanie urządzenia do odcisków woskowych w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
- Umieszczenie zablokowanego slajdu mikromacierzy w urządzeniu do odcisków woskowych stroną z przeciwciałami do wosku. Delikatne pociągnięcie za uchwyt, aby równomiernie odcisnąć wosk na slajdzie.
5. Nanieś próbki surowicy na szkiełko mikromacierzy
- Podczas kroku 2.4 należy przygotować próbki surowicy do analizy profilu glikanowego w jednej próbce (5.1.1) lub pomiaru pojedynczego epitopu glikanowego w wielu próbkach (5.1.2).
- W eksperymencie dotyczącym profilowania glikanów wielu glikoprotein surowiczych w jednej próbce surowicy z wykorzystaniem wielu GBP (patrz: przykład eksperymentu 1), jedna próbka surowicy zostanie naniesiona na wszystkie podmacierze. W tym przypadku 40 μl próbki surowicy rozcieńcza się w 360 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 μg/mL mysiego IgG, 100 μg/mL szczurzego IgG, 100 μg/mL króliczego IgG, 100 μg/mL koziego IgG oraz 100 μg/ml osiołkowego IgG. Objętość ta jest wystarczająca do naniesienia 6 μl rozcieńczonego roztworu surowicy na każdą podmacierz.
- W eksperymencie dotyczącym pomiaru jednego glikanu w wielu białkach surowiczych w wielu próbkach surowicy z wykorzystaniem detekcji jednym GBP (patrz: przykład eksperymentu 2). W tym przypadku 1 μl próbki surowicy rozcieńcza się w 9 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 μg/mL mysiego IgG, 100 μg/mL szczurzego IgG, 100 μg/mL króliczego IgG, 100 μg/mL koziego IgG oraz 100 μg/mL osiołkowego IgG. Objętość ta jest wystarczająca do naniesienia 6 μL rozcieńczonego roztworu surowicy na każdą podmacierz.
- Po wykonaniu odcisku woskowego w kroku 4, należy ostrożnie nanieść 6 μL rozcieńczonej próbki lub próbek kontrolnych (PBST0.1) na każdą podmacierz preparatu. Inkubować preparat w nawilżonej kasecie z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Płukać preparat PBST0.1 trzy razy, za każdym razem przez 3 minuty.
- Wysuszyć preparat poprzez wirowanie przy 1200 x g przez 2 minuty.
6. Nanieś biotynilowany GBP (lektynę lub przeciwciało antyglikanowe) na preparat
- W kroku 2.4 przygotować 10μg/ml biotynilowanych lektyn/GBP w PBST0.1.
- W eksperymencie profilowania glikanów, w którym jedną próbkę bada się za pomocą wielu lektyn (eksperyment próbny 1), przygotować 350 μL biotynilowanej lektyny, co jest ilością wystarczającą dla wszystkich podmacierzy.
- W przypadku przesiewania pojedynczego epitopu glikanu/biomarkera w wielu próbkach z użyciem wielu lektyn, przygotować 10 μl każdej biotynilowanej lektyny, co jest ilością wystarczającą dla jednej podmacierzy.
- Nanieść 6 μL rozcieńczonej biotynilowanej lektyny (lektyn) na każdą podmacierz preparatu i inkubować w nawilżonej kasecie do slajdków z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Płukać preparaty w PBST0.1 trzykrotnie, po 3 minuty za każdym razem.
- Osuszyć preparat, wirując go w wirówce przy 1200 x g przez 2 minuty.
7. Nałożenie NeutrAvidyny znakowanej barwnikiem do detekcji fluorescencyjnej
- Przygotować 350 μL NeutrAvidyny znakowanej Dylight 549 w ilości wystarczającej dla wszystkich podmacierzy.
- Nanieść 6 μL NeutrAvidyny znakowanej Dylight 549 na każdą podmacierz, a następnie inkubować preparat w nawilżonej kasecie na slajdy w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Przepłukać slajd roztworem PBST0.1 trzykrotnie, za każdym razem przez 3 minuty.
- Osuszyć slajd, wirując go w wirówce przy 1200 x g przez 2 minuty.
8. Uzyskanie obrazu płytki mikromacierzy poprzez skanowanie płytki
- Zeskanuj preparat za pomocą fluorescencyjnego skanera mikroarrayów z rozdzielczością 10 μm. Ustawienia lasera i PMT powinny być tak wysokie, jak to możliwe, pod warunkiem, że nie wystąpi nasycenie sygnału w żadnym punkcie.
9. Ekstrakcja i analiza danych
- Otwórz obraz w programie ArrayPro 3.2.
- Skonfiguruj szablon macierzy zgodnie z mapą macierzy przedstawiającą lokalizację plamek przeciwciał. Precyzyjnie dopasuj każde koło szablonu do odpowiadającej mu plamki na obrazie.
- Wyeksportuj intensywność każdej plamki do pliku Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy.
10. Reprezentatywne wyniki
Przykładowy eksperyment 1
Profilowanie glikozylacji wielu glikoprotein surowiczych w próbce surowicy pacjenta z rakiem hepatokomórkowym przy użyciu mikrotablicy przeciwciał z blokowaniem chemicznym z detekcją wieloma lektynami.
Celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie indywidualnego profilu glikozylacji 20 glikoprotein w próbce surowicy pacjenta z rakiem hepatokomórkowym (HCC) przy użyciu chemicznie blokowanego mikroarrayu przeciwciał z detekcją lektynami. Mikroarray przeciwciał, zawierający 48 identycznych podmacierzy obejmujących 26 przeciwciał oraz biotynę-BSA, został zaprojektowany i wykonany zgodnie z opisem w Kroku 1. Te 26 przeciwciał było skierowanych przeciwko 20 glikoproteinom surowicy, które zidentyfikowano jako obiecujące w kontekście wczesnej diagnostyki pacjentów z HCC, wykorzystując immunoprecypitację opartą na lektynach w połączeniu z identyfikacją białek metodą spektrometrii mas12, 32, jak przedstawiono w Tabeli 1. Schemat i rozmieszczenie plamek przeciwciał naniesionych w trzech powtórzeniach w jednej reprezentatywnej podmacierzy pokazano odpowiednio na Rycini 1E i 1F. Do przeprowadzenia tego samego eksperymentu profilowania glikozylacji użyto dwóch identycznych szkiełek mikroarrayu, z których jedno nie było blokowane chemicznie (Rycina 1A), a drugie było (Rycina 1B>), aby wykazać znaczenie procedury blokowania chemicznego dla analizy. W przypadku szkiełka blokowanego chemicznie (Rycina 1B) eksperyment rozpoczęto od Kroku 2; w przypadku szkiełka nieblokowanego chemicznie (Rycina 1A) eksperyment rozpoczęto od Kroku 3. Eksperyment przeprowadzono zgodnie ze wszystkimi krokami opisanymi w protokole, z wyjątkiem Kroków 5.1.2 i 6.1.2. W Kroku 5.2 na podmacierze w kolumnach 1 i 3 naniesiono próbkę kontrolną PBST0.1, a na podmacierze w kolumnach 2 i 4 naniesiono zpoolowaną próbkę surowicy HCC (jak pokazano na Rycini 1G). Porównanie to ma na celu wykazanie skuteczności, wydajności procedury oraz powinowactwa wiązania antygenów przez przeciwciała po blokowaniu chemicznym. Do profilowania glikozylacji na każdą podmacierz naniesiono 22 biotynowane lektyny (przedstawione w Tabeli 1), specyficzne dla różnych glikanów18, 20, jak pokazano na Rycini 1G. Obrazy mikroarrayów blokowanych chemicznie (Rycina 1B) i nieblokowanych chemicznie (Rycina 1A) po przeprowadzeniu analizy profilowania glikozylacji zgodnie z protokołem. Jak widać na podmacierzach w kolumnach 1 i 3 w nieblokowanych chemicznie mikroarrayach (Rycina 1A i Rycina 1C), na które naniesiono wyłącznie PBST0.1, większość lektyn związała się z przeciwciałami wychwytującymi, wykazując bardzo wysokie tło, porównywalne z podmacierzami w kolumnach 2 i 4, na które naniesiono próbkę surowicy. Uzyskanie informacji o profilu glikanów z tego szkiełka mikroarrayu jest niemożliwe. Przeciwnie, gdy ten sam eksperyment wykonano na chemicznie blokowanym szkiełku mikroarrayu przeciwciał, w podmacierzach w kolumnach 1 i 3, na które naniesiono wyłącznie PBST0.1, większość lektyn nie wykazała wiązania lub wykazała bardzo niskie wiązanie z przeciwciałami wychwytującymi; natomiast w podmacierzach w kolumnach 2 i 4, na które naniesiono próbkę surowicy, nadal obserwowano silne wiązanie antygenów (Rycina 1B i 1D). Wyniki te wykazały, że procedura blokowania chemicznego była krytycznym etapem pomiaru glikanów na glikoproteinach wychwyconych przez przeciwciała. Postępując zgodnie z protokołem, można uzyskać profile glikozylacji 22 glikoprotein w surowicy HCC.
Eksperyment 2
Przesiewowe badanie zmian fukozylacji specyficznych glikoprotein surowicy jako biomarkerów służących do rozróżnienia pacjentów z marskością wątroby i rakiem wątrobowokomórkowym.
Celem niniejszego eksperymentu jest przesiewowe badanie zmienionej fukozylacji specyficznych glikoprotein surowiczych jako biomarkerów różnicujących pacjentów z marszczyzną wątroby i rakiem hepatokomórkowym (HCC). W przeciwieństwie do eksperymentu 1, w którym tylko jedna próbka surowicy była nanoszona na wszystkie macierze i inkubowana z różnymi lektynami, w tym badaniu łącznie 40 różnych próbek surowicy od pacjentów z HCC i marszczyzną naniesiono na każdą macierz i inkubowano z jedną lektyną (AAL). Przeprowadzono analizę statystyczną, taką jak test T oraz analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiorcy (ROC), aby ocenić rozkład lub wydajność diagnostyczną epitopu glikanowego/biomarkera dla każdego białka we wszystkich próbkach surowicy. Wykorzystano tę samą macierz przeciwciał, co w eksperymencie 1, z wyjątkiem przeciwciał anty-CA19-9 i anty-Lewis X. Eksperyment przeprowadzono od kroku 2 do kroku 9, z wyjątkiem kroków 5.1.1 i 6.1.1. Łącznie 40 próbek surowicy od 20 pacjentów z marszczyzną i 20 pacjentów z HCC naniesiono na losowe macierze z 48 dostępnych macierzy, wraz z próbkami PBS jako kontrolą negatywną. Fukozylację każdego z uchwyconych białek wykryto następnie za pomocą biotynilowanej lektyny specyficznej dla fukozy. Obraz macierzy przedstawiony na Rysunku 1 wykazał, że lektyna AAL wiązała się wyłącznie z białkami surowiczymi uchwyconymi na macierzy (Rysunek 2D), a nie z uchwyconymi przeciwciałami (Rysunek 2E). Następnie wyekstrahowano intensywności wiązania AAL dla wszystkich plamek i przeanalizowano je za pomocą testu T oraz krzywych ROC, aby ocenić wpływ fukozylacji (intensywności wiązania AAL) każdego białka surowiczego na rozróżnienie między grupą HCC a grupą z marszczyzną. Wyniki wykazały, że fukozylacja białka GP73 zapewniała najlepsze rozróżnienie między dwiema grupami przy p = 0.03 i polu pod krzywą (AUC) ROC równym 0,72. Eksperyment ten wykazał, że procedura ta jest szybką i wydajną metodą przesiewania epitopów glikanowych/biomarkerów w wielu próbkach i dla wielu białek.
| Identyfikator | Nazwa odczynnika | Skrót | Firma | Katalog nr |
| L1 | Biotynilowana konkanawalina A | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L2 | biotynilowana lektyna z Sambucus nigra | SNA | Vector Laboratories | B-1305 |
| L3 | biotynylowana aglutynina z *Lens culinaris* | LCA (analiza cyklu życia) | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L4 | Biotynilowana aglutynina I z Ricinus Communis | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L5 | Biotynilowana lektyna z Aleuria aurantia | AAL | Vector Laboratories | B-1395 |
| L6 | Biotynilowana lektyna z Erythrina cristagalli | ECL (elektroluminescencja) | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L7 | lektyna II z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia znakowana biotyną | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L8 | Biotynilowana aglutynina zarodków pszenicy | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L9 | biotynilowana erytroaglutynina z Phaseolus vulgaris | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L10 | biotynilowana leukoagglutynina z Phaseolus vulgaris | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L11 | Biotynilowana lektyna z orzeszków ziemnych (peanut agglutinin) | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L12 | biotynilowana aglutynina z grochu zwyczajnego (Pisum sativum) | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L13 | biotynilowana aglutynina z *Dolichos biflorus* | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L14 | Biotynilowana lektyna z Datura stramonium | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L15 | Biotynilowana aglutynina z Sophora Japonica | SJA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L16 | Biotynilowana aglutynina soi | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L17 | Biotynilowana lektyna Solanum Tuberosum (ziemniaka) | STL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L18 | Biotynowana lektyna I z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia | GSL I | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L19 | Biotynilowana lektyna z Vicia villosa | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L20 | Biotynilowana lektyna z Lycopersicon esculentum (pomidora) | LEL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L21 | biotynilowana aglutynina I z Ulex Europaeus | UEA I | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L22 | Biotynilowana jakalina | JAKALINA | Vector Laboratories | BK-3000 |
| A1 | Fragment F(ab')2 przeciwciała koziego przeciwko ludzkiej IgM, Fc5μ anticiało | IgM | Jackson Immuno Research | 109-006-129 |
| A2 | przeciwciało anty-ludzkie IgG (H+L) fragment F(ab')2 osła | AB1 | Jackson Immuno Research | 709-006-149 |
| A3 | mysi monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiemu IgG F(ab')2 | AB3 | Jackson Immuno Research | 209-005-097 |
| A4 | Kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-2-makroglobulinie | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie | A1AT | Lee Biosciences | CA1T-80A |
| A6 | mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
| A7 | Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie | ACT | NeoMarkery | RB-367-A1 |
| A8 | Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1-antychymotrypsynie | ACT | Fisher Scientific | RB9213R7 |
| A9 | Mysi monoklonalne przeciwciało anty-ludzka transferryna | Transferryna | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | Królicze poliklonalne przeciwciało anty-ludzka transferryna | Transferryna | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | Kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej apolipoproteinie J | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GP73 | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
| A13 | Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu białku GP73 | GP73 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 |
| A14 | Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | mysi monoklonalne przeciwciało anty-ludzka alfa-1 fetoproteina | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
| A16 | Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiej hemopeksynie | Hemopeksyna | Assaypro | 60190-05011 |
| A17 | mysi przeciwciało monoklonalne anty-ludzki glipikan-3 (1G12) | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65443 |
| A18 | Mysia monoklonalna przeciwciało przeciwko ludzkiemu kininogenowi (LMW) | Kininogen | Assaypro | 20333-05011 |
| A19 | Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej MMP-21 | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu CEACAM-1 | CEACAM | R&Systemy D | MAB1180 |
| A21 | Przeciwciało monoklonalne szczura przeciwko ludzkiemu DPPIV/CD26 | DPPIV | R&Systemy D | MAB22441 |
| A22 | mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu PIVKA II | PIVICA | Chemia kryształów | 8040 |
| A23 | Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi rakowo-embrionalnemu | CEA | biologiczne USA | C1300 |
| A24 | Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA125 | CA125 | biologiczne USA | C0050-01D |
| A25 | Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA19-9 | CA19-9 | biologiczne USA | C0075-18 |
| A26 | Mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko Lewis x | Lewis X | Calbiochem | 434631 |
| biologia | Biotynilowana BSA (kontrola pozytywna) | Biologia | Własnego wykonania | Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przygotowania wiernego i precyzyjnego przekładu zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i terminologii specjalistycznej. |
Tabela 1. Lista lektyn i przeciwciał wykorzystanych w niniejszym protokole.
| Nazwa odczynnika/sprzętu | Firma | Numer katalogowy |
| Bezkontaktowy robot do mikroarrayów | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
| Mikropłytka 384-dołkowa | Fisher | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ulcienkie szkiełka do mikroarrayów powlekane nitrocelulozą | Gentel | PATH |
| Imprinter do szkiełek (opcjonalnie) | The Gel Company | WSP60-1 |
| Wstrząsarka | Fisher | 15-453-211 |
| Wirówka | Eppendorf | 5804 000.013 |
| Kuweta do mycia szkiełek/kuweta do barwienia szkiełek z wyjmowanym stelażem | Fisher | 08-812 |
| Komora do inkubacji szkiełek/pudełko na szkiełka mikroskopowe | Fisher | 03-448-5 |
| Brij 35, roztwór 30 w/v% w wodzie | Acros Organics | AC32958-0025 |
| Tween-20 | Fisher | P337-100 |
| Jodarczan sodu (NaIO4) | Sigma | 311448 |
| L-kwas glutaminowy γ-hydrazyd | Sigma | G-7257 |
| Octan sodu bezwodny (CH3COONa) | Sigma | S2889 |
| Albuminy surowicy bydlęcej (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 |
| Bufor fosforanowo-solny (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 |
| NeutrAvidyna sprzężona z Dylight 549 | Thermo | 22837 |
| Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz | Roche | 4693159001 |
| ChromPure Human IgG, fragment Fc | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure Human IgG, cała cząsteczka | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure Mouse IgG, cała cząsteczka | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure Mouse IgG, fragment Fc | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure Rabbit IgG, cała cząsteczka | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure Donkey IgG, cała cząsteczka | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
| Skaner do mikroarrayów | Tecan | LS Reloaded |
Tabela 2. Lista sprzętu i odczynników użytych w tym protokole.
Schemat 1. Schemat przedstawiający proces odkrywania biomarkerów glikanowych oparty na mikroarray przeciwciał lektynowych. 1 (Krok 2–4): Blokowanie mikroarray przeciwciał za pomocą blokera (Glu-hydrazyd) i BSA; 2 (Krok 5): nanoszenie próbek surowicy i wychwytywanie specyficznych glikoprotein za pomocą specyficznych przeciwciał; 3 (Krok 6): nanoszenie biotynilowanych lektyn; 4 (Krok 7): detekcja biotynilowanej AAL za pomocą NeutrAvidyny znakowanej Dylight 549 w celu obrazowania mikroarray.
Rysunek 1. Obrazy z mikromacierzy dla Próbnego Eksperymentu 1 dotyczące profilowania glikozylacji wielu glikoprotein surowiczych w próbce surowicy pacjenta z HCC, z wykorzystaniem chemicznie blokowanej mikromacierzy przeciwciał z detekcją za pomocą wielu lektyn. Dwa identyczne szkiełka z mikromacierzami, (A) nieblokowane chemicznie lub (B) blokowane chemicznie zgodnie z opisem w Kroku 2, zostały poddane wszystkim etapom od 2 do 9 profilowania glikozylacji, również w celu porównawczym. (A) i (B) to obrazy z mikromacierzy zeskanowane w Kroku 8 w rozdzielczości 10 mikronów. (C) powiększony obraz dwóch pierwszych rzędów nieblokowanego chemicznie szkiełka z mikromacierzą (A); (D) powiększony obraz dwóch pierwszych rzędów blokowanego chemicznie szkiełka z mikromacierzą (B); (E) schemat rozmieszczenia przeciwciał w obrębie każdej podmacierzy; (F) mapy macierzy: lokalizacja każdego przeciwciała w podmacierzy, nazwa każdego przeciwciała odpowiada 3 plamkom; (G) lokalizacja próbki surowicy i lektyn: schemat pokazujący, do której podmacierzy nałożono każdą próbkę surowicy i lektynę.
Rysunek 2. Obrazy mikromacierzy z eksperymentu próbnego 2 służącego do wykrywania zmian fukozylacji specyficznych glikoprotein surowiczych jako biomarkerów rozróżniających pacjentów z marskością wątroby i HCC. Analizę mikromacierzową przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji Eksperyment Próbny 2. (A) Obraz całego preparatu mikromacierzy z kroku 8; (B) schemat rozmieszczenia przeciwciał w obrębie każdej podmacierzy; (C) mapy macierzy: lokalizacja każdego przeciwciała w podmacierzy, nazwa każdego przeciwciała odpowiada 3 punktom; (D) powiększony obraz podmacierzy inkubowanej z próbką surowicy; (E) powiększony obraz podmacierzy inkubowanej z kontrolą PBS.
Rycina 3. Wyniki profilowania glikanów z eksperymentu próbnego 1. Każdy wykres słupkowy przedstawia profil wiązania lektyn (lub profile glikanów) jednego z 20 badanych białek. Do analizy profilu glikanów każdego białka wykorzystano łącznie 22 różne lektyny. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
1. Wybór białka docelowego i przeciwciała wychwytującego
Przed przeprowadzeniem analizy z użyciem mikroarray przeciwciał należy rozważyć i przygotować odpowiednie odczynniki oraz materiały. Aby zaprojektować mikroarray przeciwciał do profilowania glikanów lub przesiewania biomarkerów glikanowych, należy wyznaczyć panel przeciwciał specyficznych dla potencjalnych glikoprotein na podstawie literatury lub wcześniejszych wyników. Przeciwciała te były zazwyczaj nabywane od różnych dostawców, takich ja...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Institute for Hepatitis and Virus Research.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| biotynilowana konkanawalina A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
| Biotynylowana lektyna z Sambucus nigra | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
| Biotynilowana aglutynina z Lens culinaris | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
| Biotynilowana aglutynina I z Ricinus communis | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA (amplifikacja rolling-circle) |
| biotynilowana lektyna z Aleuria aurantia | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
| Biotynilowana lektyna z Erythrina cristagalli | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
| biotynilowana lektyna II z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
| biotynilowana aglutynina zarodków pszenicy | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
| biotynilowana erytroaglutynina z Phaseolus vulgaris | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
| biotynilowana lekoglutynina z Phaseolus vulgaris | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
| Biotynilowana lektyna PNA (Peanut Agglutinin) | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
| biotynylowana aglutynina z grochu zwyczajnego (Pisum Sativum) | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA (antygen swoisty dla prostaty) |
| biotynilowana aglutynina Dolichos biflorus | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
| Biotynilowana lektyna z Datura stramonium | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
| Biotynilowana aglutynina z Sophora japonica | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
| Biotynilowana aglutynina sojowa | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
| Biotynilowana lektyna z Solanum tuberosum (ziemniaka)* | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
| biotynilowana lektyna I z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
| Biotynilowana lektyna z Vicia villosa | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
| lektyna z pomidora (Lycopersicon esculentum) biotynilowana | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
| Biotynylowana aglutynina I z *Ulex europaeus* | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
| biotynilowana jakalina | Vector Laboratories | BK-3000 | jakalina |
| Fragment F(ab')2 przeciwciała koziego przeciwko ludzkiej IgM, Fc5μ przeciwciało | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
| przeciwciało donkey F(ab')2 Frag anty-ludzkie IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
| mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzkie IgG F(ab')2 | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
| Kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-2-makroglobulinie | GeneTex | GTX62924 | A2M |
| Królicze wielomieszałkowe przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie | Lee Biosciences | CA1T-80A | A1AT |
| Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
| Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie | NeoMarkery | RB-367-A1 | ACT |
| Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antychymotrypsynie | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
| mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzka transferryna | GeneTex | GTX101035 | Transferryna |
| Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej transferrynie | GeneTex | GTX77130 | Transferryna |
| Kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej apolipoproteinie J | Abcam | ab7610 | ApoJ |
| mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu GP73 | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
| mysi przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GP73 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
| Królicze wielomieszałkowe przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
| Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
| Mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzka hemopeksyna | Assaypro | 60190-05011 | Hemopeksyna |
| mysi przeciwciało monoklonalne anty-ludzki glipikan-3 (1G12) | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
| Mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu kininogenowi (LMW) | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
| Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej MMP-21 | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
| mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzki CEACAM-1 | R&R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
| Przeciwciało monoklonalne szczurze przeciwko ludzkiemu DPPIV/CD26 | R&R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
| mysia przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie PIVKA II | Chemia kryształów | 8040 | PIVICA |
| Przeciwciało mysie anty-karcino...–antygen embrionalny | biologiczny USA | C1300 | CEA |
| Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA125 | biologia USA | C0050-01D | CA125 |
| Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA19-9 | biologia USA | C0075-18 | CA19-9 |
| Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Lewis x | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
| Biotynilowana BSA (kontrola pozytywna) | Własnej roboty | Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które mają zostać przełożone na język polski. | Bio |
| Tabela 1. Lista lektyn i przeciwciał użytych w tym protokole. | |||
| Bezkontaktowy system do nanoszenia mikromacierzy | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
| płytka mikrotitracyjna 384-dołkowa | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
| Slajdy do mikromacierzy z ultracienką powłoką z nitrocelulozy | Gentel | ŚCIEŻKA | |
| Urządzenie do odcisków na szkiełkach (opcjonalnie) | The Gel Company | WSP60-1 | |
| Mieszadło orbitalne | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5804 000.013 | |
| Kuweta do płukania/barwienia szkiełek z wyjmowaną wkładką | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Komora inkubacyjna do szkiełek / pudełko na szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
| roztwór Brij 35 w stężeniu 30% w/v w wodzie | Acros Organics | AC32958-0025 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
| Periodynian sodu (NaIO4)4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
| Kwas L-glutaminowy γ-hydrazyd | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
| Octan sodu bezwodny (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
| Bufor fosforanowy (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
| NeutrAvidyna sprzężona z DyLight 549 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
| Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz | Grupa Roche | 4693159001 | |
| ChromPure Human IgG, fragment Fc | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| ChromPure Human IgG, cała cząsteczka | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, cała cząsteczka | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, fragment Fc | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
| ChromPure Rabbit IgG, cała cząsteczka | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
| ChromPure Donkey IgG, cała cząsteczka | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
| Skaner do mikromacierzy | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
| Tabela 2. Lista aparatury i odczynników użytych w tym protokole. |
Bibliografia
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
