Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Podsumowanie

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Streszczenie

W niniejszym badaniu opisujemy skuteczny protokół do zastosowania w multipleksowej wysokoprzepustowej mikrotablicy przeciwciał z detekcją białek wiążących glikany, który umożliwia profilowanie glikozylacji specyficznych białek. Glikozylacja białek jest najpowszechniejszą modyfikacją potranslacyjną występującą w białkach, która prowadzi do zróżnicowanych zmian ich właściwości fizycznych, chemicznych i biologicznych. Ponieważ mechanizm glikozylacji jest szczególnie podatny na postęp choroby i transformację złośliwą, aberracyjna glikozylacja została uznana za biomarker wczesnego wykrywania raka i innych schorzeń. Jednakże obecne metody badania glikozylacji białek są zazwyczaj zbyt skomplikowane lub kosztowne, aby można je było stosować w większości standardowych warunków laboratoryjnych lub klinicznych, w związku z czym istnieje potrzeba opracowania bardziej praktycznej metody badania glikozylacji białek. Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu wykorzystuje chemicznie blokowaną mikrotablicę przeciwciał z detekcją białek wiążących glikany (GBP), co znacząco redukuje czas, koszty oraz wymagania sprzętowe niezbędne do badania glikozylacji białek. W tej metodzie wiele unieruchomionych przeciwciał specyficznych dla glikoprotein jest nanoszonych bezpośrednio na szkiełka mikrotablicy, a N-glikany na przeciwciałach zostają zablokowane. Zablokowane, unieruchomione przeciwciała specyficzne dla glikoprotein są w stanie wychwycić i wyizolować glikoproteiny z kompleksowej próbki naniesionej bezpośrednio na szkiełka mikrotablicy. Detekcja glikanów może być następnie przeprowadzona poprzez naniesienie biotynylowanych lektyn i innych GBP na szkiełko mikrotablicy, natomiast poziomy wiązania można określić przy użyciu Dylight 549-Streptavidiny. Dzięki zastosowaniu panelu przeciwciał i sondowaniu wieloma biotynylowanymi lektynami, metoda ta pozwala na skuteczne opracowanie profilu glikozylacji różnych białek obecnych w danej próbce ludzkiej lub zwierzęcej.

Wstęp

Glikozylacja białek, będąca najpowszechniejszą modyfikacją potranslacyjną białek, zmienia ich właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne oraz odgrywa fundamentalną rolę w różnych procesach biologicznych^1-6. Ponieważ aparat glikozylacyjny jest szczególnie podatny na progresję chorób i transformację złośliwą, aberracyjna glikozylacja została uznana za biomarker wczesnego wykrywania raka i innych schorzeń ^7-12. W rzeczywistości większość obecnych biomarkerów nowotworowych, takich jak frakcja L3 α-1 fetoproteiny (AFP) dla raka hepatokomórkowego ^13-15 oraz CA199 dla raka trzustki ^{16, 17}, to aberracyjne fragmenty glikanów w glikoproteinach. Jednak metody badania glikozylacji białek są skomplikowane i nie nadają się do rutynowego zastosowania w warunkach laboratoryjnych i klinicznych. Chen et al. opracowali niedawno macierz przeciwciał z blokowaniem chemicznym wraz z metodą detekcji białek wiążących glikany (GBP) do wysokoprzepustowego i multipleksowego profilowania glikozylacji natywnych glikoprotein w złożonej próbce ¹⁸. W tej metodzie macierzy opartej na powinowactwie wiele unieruchomionych przeciwciał specyficznych dla glikoprotein wychwytuje i izoluje glikoproteiny z złożonej mieszaniny bezpośrednio na płytce macierzy, a następnie glikany na każdym poszczególnym wychwyconym białku są mierzone za pomocą GBP. Ponieważ wszystkie normalne przeciwciała zawierają N-glikany, które mogłyby być rozpoznawane przez większość GBP, krytycznym krokiem tej metody jest chemiczne zablokowanie glikanów na przeciwciałach, aby zapobiec ich wiązaniu z GBP. W procedurze grupy cis-diolowe glikanów w przeciwciałach zostały najpierw utlenione do grup aldehydowych przy użyciu NaIO₄ w buforze octanu sodu z osłoną przed światłem. Grupy aldehydowe skoniugowano następnie z grupą hydrazydową łącznika, 4-(4-N-maleimidylofenylo)maślanu hydrazydowego HCl (MPBH), a następnie skoniugowano didektyd Cys-Gly z grupą maleimidową MPBH. W ten sposób grupy cis-diolowe w glikanach przeciwciał zostały przekształcone w rozbudowane grupy niehydroksylowe, co uniemożliwiło wiązanie lektyn i innych GBP do przeciwciał wychwytujących. Procedura blokowania ta sprawia, że GBP i lektyny wiążą się wyłącznie z glikanami wychwyconych białek. Po tym chemicznym blokowaniu próbki surowicy inkubowano z macierzą przeciwciał, a następnie wykryto glikany za pomocą różnych biotynylowanych lektyn i GBP, wizualizując je za pomocą Cy3-streptawidyny. Równoległe zastosowanie panelu przeciwciał i wielu sond lektynowych pozwala na uzyskanie oddzielnych profili glikozylacji wielu białek w danej próbce ^18-20. Metoda ta była z sukcesem stosowana w wielu różnych laboratoriach ^{1, 7, 13, 19-31}. Jednak stabilność MPBH i Cys-Gly oraz skomplikowana i czasochłonna procedura wpływają na powtarzalność, skuteczność i wydajność tej metody. W nowym protokole zastąpiliśmy zarówno MPBH, jak i Cys-Gly jednym, znacznie bardziej stabilnym odczynnikiem – hydrazydem kwasu glutaminowego (Glu-hydrazydem), co znacząco poprawiło powtarzalność metody oraz uprościło i skróciło całą procedurę tak, aby można było ją ukończyć w ciągu jednego dnia roboczego. W tym nowym protokole opisujemy szczegółową procedurę, która może zostać łatwo przyjęta przez standardowe laboratoria do rutynowych badań glikozylacji białek, oraz techniki niezbędne do uzyskania powtarzalnych i odtwarzalnych wyników.

Protokół

1. Wydruk mikrotablicy przeciwciał do analizy

1. Rozcieńcz wszystkie przeciwciała do stężenia 0,5 mg/ml w buforze fosforanowym z solą fizjologiczną, pH 7,2 (PBS).
2. Nanieś aliquoty po 40 μl każdego przeciwciała na płytkę źródłową z 384 dołkami.
3. Wstaw płytkę źródłową z 384 dołkami do urządzenia do mikroarrayów Scienion sciFLEXARRAYER.
4. Wstaw 20 szkiełek do mikroarrayów PATH do urządzenia jako cel.
5. Skonfiguruj urządzenie tak, aby wydrukowało 48 identycznych podmacierzy, w których 27 przeciwciał i białek kontrolnych jest naniesionych w trzech powtórzeniach w układzie 9x9 (Rysunek 1E, 1F).
6. Uruchom urządzenie w celu wydrukowania szkiełek z mikroarrayami przeciwciał.
7. Zbierz szkiełka z mikroarrayami przeciwciał i przechowuj je w kasecie na szkiełka z osuszaczem. Zamknij kasetę próżniowo w plastikowej torbie za pomocą zgrzewarki próżniowej (Foodsaver).
8. Przechowuj zamknięte szkiełka do mikroarrayów w temperaturze 4 °C w lodówce.

2. Chemiczne blokowanie mikroarray przeciwciał w celu zapobiegania wiązaniu GBP z przeciwciałami wychwytującymi

Analiza mikromacierzy rozpoczyna się po chemicznym blokowaniu szkiełek z mikromacierzami i trwa około 8 godzin. Po rozpoczęciu analiza mikromacierzy musi zostać ukończona (kroki 2–8).

1. Wyjąć preparaty mikromacierzy z lodówki i pozostawić je na 30 minut w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.
2. Wyjąć preparat z pudełka do przechowywania i krótko opłukać go w kuwecie do mycia preparatów najpierw w buforze fosforanowym z solą pH 7,2 z 0,1% Tween 20 (PBST0.1), a następnie w buforze octanu sodu 15 mM pH 5,0 z 0,1% Tween (CBT0.1). Inkubować preparaty w CBT0.1 przez 10 minut w kuwecie do mycia preparatów.
3. Przygotować świeży roztwór 150 mM NaIO₄ w buforze octanu sodu 15 mM pH 5,0 (CB) i przechowywać go w kuwecie do mycia preparatów w lodówce, chroniąc przed światłem do momentu użycia.
4. Wyjąć preparat z CB i przełożyć go do kuwety zawierającej świeży NaIO₄ stroną z przeciwciałami skierowaną do góry. Przykryć kuwetę folią aluminiową, aby uniknąć dostępu światła, a następnie inkubować preparaty w kuwecie przez 2 godziny przy łagodnym wstrząsaniu w temperaturze 4 °C w lodówce.
5. Przygotować 300 mL 10 mM hydrazydowego kwasu glutaminowego (bloker) w CB.
6. Wyjąć preparat z kuwety i krótko opłukać go w CB 3 razy po 5 minut za każdym razem w kuwecie do mycia preparatów.
7. Inkubować preparaty w blokerze w kuwecie do mycia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu.
8. Wyjąć preparaty z kuwety i przemyć je PBST0.1 przez 3 minuty.

3. Blokowanie niespecyficznych wiązań na mikroarray za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA)

1. Przygotuj 300 ml 1% BSA w buforze fosforanowym z solą pH 7,2 z dodatkiem 0,5% Tween (PBST0,5) w kuwecie do mycia szkiełek i inkubuj szkiełko z mikroarray w kuwecie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
2. Przepłucz szkiełka w PBST0,1 trzy razy, po 3 minuty za każdym razem.
3. Umieść szkiełko na statywie i wiruj w wirówce z prędkością 1 200 x g przez 2 minuty, aby osuszyć szkiełko z mikroarray.

4. Odciśnięcie siatki woskowej na płytce mikroarray w celu odseparowania poszczególnych podmacierzy

1. Podgrzewanie urządzenia do odciskania wosku w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
2. Włożenie zablokowanego slajdu mikropróbki do urządzenia do odciskania wosku stroną z przeciwciałami skierowaną w stronę wosku. Delikatne pociągnięcie uchwytem w celu równomiernego odciśnięcia wosku na slajdzie.

5. Nanieś próbki surowicy na szkiełko mikromacierzy

1. Podczas kroku 2.4 przygotować próbki surowicy do analizy profilu glikanowego w jednej próbce (5.1.1) lub pomiaru pojedynczego epitopu glikanowego w wielu próbkach (5.1.2).
   1. W eksperymencie dotyczącym profilowania glikanów wielu glikoprotein surowiczych w jednej próbce surowicy z użyciem wielu GBP (patrz: eksperyment próbny 1), jedną próbkę surowicy nanosi się na wszystkie podmacierze. W tym przypadku 40 μl próbki surowicy rozcieńcza się w 360 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 μg/mL IgG mysiego, 100 μg/mL IgG szczurzego, 100 μg/mL IgG króliczego, 100 μg/mL IgG koziego oraz 100 μg/ml IgG oslego. Taka objętość jest wystarczająca do naniesienia 6 μl rozcieńczonego roztworu surowicy na każdą podmacierz.
   2. W eksperymencie dotyczącym pomiaru jednego glikanu w wielu białkach surowiczych w wielu próbkach surowicy z użyciem detekcji jednym GBP (patrz: eksperyment próbny 2), 1 μl próbki surowicy rozcieńcza się w 9 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 μg/mL IgG mysiego, 100 μg/mL IgG szczurzego, 100 μg/mL IgG króliczego, 100 μg/mL IgG koziego oraz 100 μg/mL IgG oslego. Taka objętość jest wystarczająca do naniesienia 6 μL rozcieńczonego roztworu surowicy na każdą podmacierz.
2. Po wykonaniu odcisku woskowego w kroku 4, ostrożnie nanieść 6 μL rozcieńczonej próbki lub próbek kontrolnych (PBST0.1) na każdą podmacierz szkiełka. Inkubować szkiełko w nawilżonej kasecie z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Płukać szkiełko trzy razy w PBST0.1, za każdym razem przez 3 minuty.
4. Osuszyć szkiełko poprzez wirowanie przy 1200 x g przez 2 minuty.

6. Nanieś biotynilowany GBP (lektynę lub przeciwciało antyglikanowe) na preparat

1. W kroku 2.4 przygotować 10 μg/ml biotynilowanych lektyn/GBP w PBST0.1.
   1. W eksperymencie profilowania glikanów, w którym jedna próbka jest badana za pomocą wielu lektyn (eksperyment próbny 1), przygotować 350 μL biotynilowanej lektyny, co jest ilością wystarczającą dla wszystkich podmacierzy.
   2. W przypadku przesiewania pojedynczego epitopu glikanu/biomarkera w wielu próbkach przy użyciu wielu lektyn, przygotować po 10 μl każdej biotynilowanej lektyny, co jest ilością wystarczającą dla jednej podmacierzy.
2. Nanieść 6 μL rozcieńczonej biotynilowanej lektyny (lektyn) na każdą podmacierz slajdu, a następnie inkubować w nawilżonym pudełku na slajdy z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Przepłukać slajdy w PBST0.1 trzykrotnie, po 3 minuty każdego razu.
4. Osuszyć slajd poprzez wirowanie w wirówce przy 1200 x g przez 2 minuty.

7. Przygotowanie znakowanego barwnikiem NeutrAvidinu do detekcji fluorescencyjnej

1. Przygotować 350 μL NeutrAvidyny znakowanej Dylight 549 w ilości wystarczającej dla wszystkich podmacierzy.
2. Nanieść 6 μL NeutrAvidyny znakowanej Dylight 549 na każdą podmacierz, a następnie inkubować preparat w nawilżonej kasecie na slajdy w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Przepłukać slajd buforem PBST0.1 trzykrotnie, po 3 minuty każdego razu.
4. Osuszyć slajd, wirując go w wirówce przy 1200 x g przez 2 minuty.

8. Pozyskanie obrazu płytki mikromacierzy poprzez skanowanie płytki

1. Przeskanuj preparat za pomocą fluorescencyjnego skanera mikroarrayów z rozdzielczością 10 μm. Ustawienia lasera i PMT powinny być jak najwyższe, tak aby nie zaobserwowano nasycenia sygnału.

9. Ekstrakcja i analiza danych

1. Otwórz obraz w programie ArrayPro 3.2.
2. Skonfiguruj szablon matrycy zgodnie z mapą układu, która wskazuje położenie plamek przeciwciał. Precyzyjnie dopasuj każdy okrąg szablonu do odpowiadającej mu plamki na obrazie.
3. Wyeksportuj intensywność każdej plamki do pliku Excel w celu dalszej analizy.

10. Reprezentatywne wyniki

Przykładowy eksperyment 1

Profilowanie glikozylacji wielu glikoprotein surowiczych w próbce surowicy pacjenta z rakiem hepatokomórkowym z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał z blokowaniem chemicznym i detekcją za pomocą wielu lektyn.

Celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie indywidualnego profilu glikozylacji 20 glikoprotein w próbkach surowicy pacjentów z rakiem hepatokomórkowym (HCC), z wykorzystaniem chemicznie blokowanej macierzy przeciwciał z detekcją lektynową. Macierz przeciwciał, zawierająca 48 identycznych podmacierzy, w skład których wchodzi 26 przeciwciał oraz biotyna-BSA, została zaprojektowana i wykonana zgodnie z opisem w Kroku 1. Te 26 przeciwciał było skierowanych przeciwko 20 glikoproteinom surowicy, które zidentyfikowano jako obiecujące markery wczesnej diagnostyki pacjentów z HCC, wykorzystując immunoprecypitację opartą na lektynach w połączeniu z identyfikacją białek metodą spektrometrii masowej^{12, 32}, jak pokazano w Tabeli 1. Wzór i rozmieszczenie plamek przeciwciał naniesionych w trzech powtórzeniach w jednej reprezentatywnej podmacierzy przedstawiono odpowiednio na Ryc. 1E i 1F. Aby wykazać znaczenie procedury blokowania chemicznego dla analizy, do przeprowadzenia tego samego eksperymentu profilowania glikozylacji wykorzystano dwa identyczne szkiełka z macierzą: jedno nieblokowane chemicznie (Ryc. 1A), a drugie blokowane chemicznie (Ryc. 1B). W przypadku szkiełka blokowanego chemicznie (Ryc. 1B) eksperyment rozpoczęto od Kroku 2; w przypadku szkiełka nieblokowanego chemicznie (Ryc. 1A) eksperyment rozpoczęto od Kroku 3. Eksperyment przeprowadzono zgodnie ze wszystkimi etapami opisanymi w protokole, z wyjątkiem Kroków 5.1.2 i 6.1.2. W Kroku 5.2 na podmacierze w kolumnach 1 i 3 naniesiono próbkę kontrolną PBST0.1, a na podmacierze w kolumnach 2 i 4 naniesiono połączoną próbkę surowicy HCC (jak pokazano na Ryc. 1G). Porównanie to ma na celu wykazanie skuteczności i wydajności procedury, a także powinowactwa wiązania antygenów przez przeciwciała po blokowaniu chemicznym. Do profilowania glikozylacji na każdą podmacierz naniesiono 22 biotynilowane lektyny (pokazane w Tabeli 1), specyficzne dla różnych glikanów^{18, 20}, jak pokazano na Ryc. 1G. Przedstawiono obrazy macierzy blokowanej chemicznie (Ryc. 1B) oraz nieblokowanej chemicznie (Ryc. 1A) po przeprowadzeniu analizy profilowania glikozylacji zgodnie z protokołem. Jak widać na podmacierzach w kolumnach 1 i 3 w nieblokowanych chemicznie macierzach (Ryc. 1A i Ryc. 1C), na które naniesiono wyłącznie PBST0.1, większość lektyn związała się z przeciwciałami wychwytującymi, wykazując bardzo wysokie tło, porównywalne z podmacierzami w kolumnach 2 i 4, na które naniesiono próbkę surowicy. Z tego szkiełka z macierzą nie jest możliwe uzyskanie informacji o profilu glikanów. Przeciwnie, gdy ten sam eksperyment przeprowadzono na chemicznie blokowanym szkle z macierzą przeciwciał, na podmacierzach w kolumnach 1 i 3, na które naniesiono tylko PBST0.1, większość lektyn nie wykazała lub wykazała bardzo słabe wiązanie z przeciwciałami wychwytującymi; podczas gdy w podmacierzach w kolumnach 2 i 4, na które naniesiono próbkę surowicy, nadal obserwowano silne wiązanie antygenów (Ryc. 1B i 1D). Wyniki te wykazały, że procedura blokowania chemicznego jest krytycznym etapem pomiaru glikanów w glikoproteinach wychwyconych przez przeciwciała. Postępując zgodnie z protokołem, można uzyskać profile glikozylacji 22 glikoprotein w surowicy pacjentów z HCC.

Eksperyment 2

Przesiewowe badanie zmian fukozylacji specyficznych glikoprotein surowicy jako biomarkerów służących do rozróżnienia pacjentów z marskością wątroby i rakem wątrobowokomórkowym.

Celem niniejszego eksperymentu jest przesiewowe badanie zmienionej fukozylacji specyficznych glikoprotein surowiczych jako biomarkerów umożliwiających rozróżnienie pacjentów z marszczyzną wątroby i rakem hepatokomórkowym (HCC). W przeciwieństwie do Eksperymentu 1, w którym do każdego podzespołu (subarray) naniesiono tylko jedną próbkę surowicy i poddano ją reakcji z różnymi lektynami, w tym badaniu do każdego podzespołu naniesiono łącznie 40 różnych próbek surowicy od pacjentów z HCC i marszczyną, a następnie poddano je reakcji z jedną lektyną (AAL). Analizę statystyczną, taką jak test T oraz krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), przeprowadzono w celu oceny rozkładu lub wydajności diagnostycznej epitopu glikanu/biomarkera dla każdego białka w obrębie wszystkich próbek surowicy. Użyto tego samego mikrozespołu przeciwciał, który został zastosowany w Eksperymencie 1, z wyjątkiem przeciwciał anty-CA19-9 i anty-Lewis X w niniejszym badaniu. Eksperyment przeprowadzono od Kroku 2 do Kroku 9, z wyjątkiem Kroków 5.1.1 i 6.1.1. Łącznie 40 próbek surowicy od 20 pacjentów z marszczyną i 20 pacjentów z HCC naniesiono na losowe podzespoły spośród 48 dostępnych, wraz z próbkami PBS jako kontrolą negatywną. Fukozylację każdego z uchwyconych białek wykryto następnie za pomocą biotynilowanej lektyny specyficznej dla fukozy. Obraz mikrozespołu przedstawiony na Rysunku 1 wykazał, że lektyna AAL wiązała się wyłącznie z białkami surowiczymi uchwyconymi na mikrozespole (Rysunek 2D), a nie z uchwyconymi przeciwciałami (Rysunek 2E). Intensywności wiązania AAL dla wszystkich plamek zostały następnie wyekstrahowane i przeanalizowane za pomocą testu T i krzywych ROC, aby ocenić wydajność fukozylacji (intensywność wiązania AAL) każdego białka surowiczego w rozróżnianiu grupy HCC od grupy z marszczyną. Wyniki wykazały, że fukozylacja białka GP73 zapewniła najlepsze rozróżnienie między obiema grupami, przy p = 0.03 i polu pod krzywą ROC równym 0.72. Eksperyment ten wykazał, że procedura ta jest szybką i wydajną metodą przesiewową epitopów glikanów/biomarkerów w wielu próbkach w obrębie wielu białek.

Identyfikacja	Nazwa odczynnika	Skrót	Firma	Katalog nr
L1	Biotynilowana konkanawalina A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	biotynilowana lektyna z Sambucus Nigra	SNA (analiza sieci społecznych)	Vector Laboratories	B-1305
L3	biotynilowana aglutynina z *Lens culinaris*	LCA (ocena cyklu życia)	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotynilowana aglutynina z *Ricinus communis* I	RCA (łańcuchowa reakcja amplifikacji)	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotynilowana lektyna z Aleuria aurantia	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotynilowana lektyna z Erythrina cristagalli	ECL (elektrochemiluminescencja)	Vector Laboratories	BK-3000
L7	biozynowana lektyna II z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotynilowana aglutynina zarodków pszenicy	WGA (aglutynina z pszenicy)	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Biotynilowana erytroaglutynina z Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	biotynilowana lekukoagglutynina z Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	biotynilowana aglutynina fistaszkowa	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	biotynilowana lektyna Pisum Sativum Agglutinin	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotynilowana aglutynina Dolichos Biflorus	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Biotynilowana lektyna z Datura stramonium	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotynilowana aglutynina z Sophora japonica	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Biotynilowana aglutynina soi	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotynilowana lektyna z Solanum tuberosum (ziemniaka)	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	lektyna I z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia biotynilowana	GSL I	Vector Laboratories	BK-2000
L19	lektyna Vicia villosa biotynilowana	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotynilowana lektyna z Lycopersicon esculentum (pomidora)*	DOL (dolna granica wybuchowości)	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Biotynilowana aglutynina I z Ulex europaeus	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotynilowana jakalina	JAKALINA	Vector Laboratories	BK-3000
A1	Fragment F(ab')2 przeciwciała koziego przeciwko ludzkiej IgM, Fc5μ przeciwciało	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	przeciwciało osiole F(ab')2 Frag anty-ludzkie IgG (H+L)	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	mysia monoklonalna przeciwciała przeciwko ludzkim IgG F(ab')2	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	Kozie przeciwciała poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-2-makroglobulinie	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie	A1AT	Lee Biosciences	CA1T-80A
A6	mysia monoklonalna przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie	ACT	NeoMarkery	RB-367-A1
A8	Królicze wielomiejsce przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1-antychymotrypsynie	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Mysie monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej transferrynie	Transferryna	GeneTex	GTX101035
A10	Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej transferrynie	Transferyna	GeneTex	GTX77130
A11	Kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej apolipoproteinie J	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu białku GP73	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu GP73	GP73	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC	sc-101275
A14	Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiej hemopeksynie	Hemopeksyna	Assaypro	60190-05011
A17	mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzki glipikan-3 (1G12)	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu kininogenowi (LMW)	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	Królicze monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej MMP-21	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzkie CEACAM-1	CEACAM	R&Systemy D	MAB1180
A21	Przeciwciało monoklonalne szczurze przeciwko ludzkiemu DPPIV/CD26	DPPIV	R&Systemy D	MAB22441
A22	mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu PIVKA II	PIVICA	Chemia krystaliczna	8040
A23	Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi carcinoembryonalnemu	CEA	biologiczne USA	C1300
A24	Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA125	CA125	biologia USA	C0050-01D
A25	Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi rakowemu CA19-9	CA19-9	biologia USA	C0075-18
A26	Mysia przeciwciała monoklonalne anty-Lewis x	Lewis X	Calbiochem	434631
biologia	BSA biotynyl化した (kontrola dodatnia)	Biologia	Własnej produkcji	Nie dotyczy

Tabela 1. Lista lektyn i przeciwciał wykorzystanych w niniejszym protokole.

Nazwa odczynników/sprzętu	Firma	Numer katalogowy
Bezkontaktowy system do nanoszenia macierzy* (microarrayer)*	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
mikropłytka 384-dołkowa	Fisher	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrazcieńkie szkiełka do mikroarray pokryte nitrocelulozą	Gentel	Ścieżka
Aparat do przygotowywania preparatów (opcjonalnie)	The Gel Company	WSP60-1
Mieszadło wstrząsowe	Fisher	15-453-211
Wirówka	Eppendorf	5804 000.013
Kuweta do płukania/barwienia preparatów z wyjmowanym wkładem	Fisher	08-812
Komora inkubacyjna do szkiełek / pudełko na szkiełka mikroskopowe	Fisher	03-448-5
roztwór Brij 35 w wodzie o stężeniu 30% w/v	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Fisher	P337-100
Periodynian sodu (NaIO4)4)	Sigma	311448
Kwas L-glutaminowy γ-hydrazyd	Sigma	G-7257
Octan sodu bezwodny (CH3COONa)	Sigma	S2889
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Lampire Biological Labs	7500804
bufor fosforanowo-solny (PBS) (10X)	Denville Scientific	CP4390-48
NeutrAvidyna znakowana DyLight 549	Thermo	22837
Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz	Roche	4693159001
ChromPure ludzka IgG, fragment Fc	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure ludzka IgG, cała cząsteczka	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure Mouse IgG, cząsteczka pełna	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure Mouse IgG, fragment Fc	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, cała cząsteczka	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, cała cząsteczka	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Skaner mikromacierzy	Tecan	LS Reloaded

Tabela 2. Lista sprzętu i odczynników użytych w tym protokole.

Schemat 1. Schemat przedstawiający proces odkrywania biomarkerów glikanowych w oparciu o mikroarray przeciwciał z lektynami. 1 (Kroki 2–4): Blokowanie mikroarray przeciwciał przy użyciu blokera (Glu-hydrazyd) i BSA; 2 (Krok 5): naniesienie próbek surowicy i wychwytywanie specyficznych glikoprotein za pomocą specyficznych przeciwciał; 3 (Krok 6): naniesienie biotynylowanych lektyn; 4 (Krok 7): detekcja biotynylowanej AAL przy użyciu NeutrAvidyny znakowanej Dylight 549 w celu obrazowania mikroarray.

Rycina 1. Obrazy mikroarray z Eksperymentu Próbnego 1 dotyczące profilowania glikozylacji wielu glikoprotein surowiczych w próbce surowicy pacjenta z HCC, z wykorzystaniem chemicznie blokowanego mikroarray przeciwciał z wielokrotną detekcją lektynami. Dwa identyczne preparaty mikroarray, (A) nieblokowany chemicznie lub (B) blokowany chemicznie zgodnie z opisem w Kroku 2, zostały poddane wszystkim etapom od 2 do 9 w celu profilowania glikozylacji oraz w celu porównawczym. (A) i (B) to obrazy mikroarray zeskanowane w Kroku 8 z rozdzielczością 10 mikronów. (C) powiększony obraz dwóch pierwszych rzędów nieblokowanego chemicznie preparatu mikroarray (A); (D) powiększony obraz dwóch pierwszych rzędów blokowanego chemicznie preparatu mikroarray (B); (E) schemat rozmieszczenia przeciwciał w obrębie każdego podarray; (F) mapy array: lokalizacja każdego przeciwciała w podarray, nazwa każdego przeciwciała reprezentuje 3 punkty; (G) lokalizacja próbki surowicy i lektyn: schemat pokazuje, do którego podarray naniesiono każdą próbkę surowicy i lektynę.

Rycina 2. Obrazy mikroarray z eksperymentu próbnego 2 w badaniu zmian fukozylacji specyficznych glikoprotein surowicy jako biomarkerów różnicujących pacjentów z marskością wątroby i HCC. Analiza mikroarray została przeprowadzona zgodnie z opisem w sekcji Eksperyment próbny 2. (A) Obraz całego preparatu mikroarray z kroku 8; (B) schemat rozmieszczenia przeciwciał w obrębie każdej podmacierzy; (C) mapy macierzy: lokalizacja każdego przeciwciała w podmacierzy, nazwa każdego przeciwciała reprezentuje 3 punkty (spoty); (D) powiększony obraz podmacierzy inkubowanej z próbką surowicy; (E) powiększony obraz podmacierzy inkubowanej z kontrolą PBS.

Rysunek 3. Wyniki profilowania glikanów z eksperymentu próbnego 1. Każdy wykres słupkowy przedstawia profil wiązania lektyny (lub profile glikanów) jednego z 20 badanych białek. Do analizy profilu glikanów każdego białka użyto łącznie 22 różnych lektyn. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

1. Wybór białka docelowego i przeciwciała wychwytującego

Przed przeprowadzeniem analizy z użyciem mikroarray przeciwciał należy rozważyć i przygotować odpowiednie odczynniki oraz materiały. Aby zaprojektować mikroarray przeciwciał do profilowania glikanów lub przesiewania biomarkerów glikanowych, należy wyznaczyć panel przeciwciał specyficznych dla potencjalnych glikoprotein na podstawie literatury lub wcześniejszych wyników. Przeciwciała te były zazwyczaj nabywane od różnych dostawców, takich ja...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
biotynilowana konkanawalina A	Vector Laboratories	BK-1000	ConA
Biotynylowana lektyna z Sambucus nigra	Vector Laboratories	B-1305	SNA
Biotynilowana aglutynina z Lens culinaris	Vector Laboratories	BK-2000	LCA
Biotynilowana aglutynina I z Ricinus communis	Vector Laboratories	BK-1000	RCA (amplifikacja rolling-circle)
biotynilowana lektyna z Aleuria aurantia	Vector Laboratories	B-1395	AAL
Biotynilowana lektyna z Erythrina cristagalli	Vector Laboratories	BK-3000	ECL
biotynilowana lektyna II z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia	Vector Laboratories	BK-3000	GSL II
biotynilowana aglutynina zarodków pszenicy	Vector Laboratories	BK-1000	WGA
biotynilowana erytroaglutynina z Phaseolus vulgaris	Vector Laboratories	BK-2000	PHA-E
biotynilowana lekoglutynina z Phaseolus vulgaris	Vector Laboratories	BK-2000	PHA-L
Biotynilowana lektyna PNA (Peanut Agglutinin)	Vector Laboratories	BK-1000	PNA
biotynylowana aglutynina z grochu zwyczajnego (Pisum Sativum)	Vector Laboratories	BK-2000	PSA (antygen swoisty dla prostaty)
biotynilowana aglutynina Dolichos biflorus	Vector Laboratories	BK-1000	DBA
Biotynilowana lektyna z Datura stramonium	Vector Laboratories	BK-3000	DSL
Biotynilowana aglutynina z Sophora japonica	Vector Laboratories	BK-2000	SJA
Biotynilowana aglutynina sojowa	Vector Laboratories	BK-1000	SBA
Biotynilowana lektyna z Solanum tuberosum (ziemniaka)*	Vector Laboratories	BK-3000	STL
biotynilowana lektyna I z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia	Vector Laboratories	BK-2000	GSL I
Biotynilowana lektyna z Vicia villosa	Vector Laboratories	BK-2000	VVL
lektyna z pomidora (Lycopersicon esculentum) biotynilowana	Vector Laboratories	BK-3000	LEL
Biotynylowana aglutynina I z *Ulex europaeus*	Vector Laboratories	BK-1000	UEA I
biotynilowana jakalina	Vector Laboratories	BK-3000	jakalina
Fragment F(ab')2 przeciwciała koziego przeciwko ludzkiej IgM, Fc5μ przeciwciało	Jackson Immuno Research	109-006-129	IgM
przeciwciało donkey F(ab')2 Frag anty-ludzkie IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	709-006-149	AB1
mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzkie IgG F(ab')2	Jackson Immuno Research	209-005-097	AB3
Kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-2-makroglobulinie	GeneTex	GTX62924	A2M
Królicze wielomieszałkowe przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie	Lee Biosciences	CA1T-80A	A1AT
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie	Sigma-Aldrich	SAB4200198	A1AT
Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie	NeoMarkery	RB-367-A1	ACT
Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antychymotrypsynie	Fisher Scientific	RB9213R7	ACT
mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzka transferryna	GeneTex	GTX101035	Transferryna
Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej transferrynie	GeneTex	GTX77130	Transferryna
Kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej apolipoproteinie J	Abcam	ab7610	ApoJ
mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu GP73	Abbott Laboratories	14H4-23	GP73
mysi przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GP73	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC	sc-101275	GP73
Królicze wielomieszałkowe przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie	GenWay	GWB-41C966	AFP
Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie	Fitzgerald	10-A05A	AFP
Mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzka hemopeksyna	Assaypro	60190-05011	Hemopeksyna
mysi przeciwciało monoklonalne anty-ludzki glipikan-3 (1G12)	Santa Cruz Bio	sc-65443	GPL3
Mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu kininogenowi (LMW)	Assaypro	20333-05011	Kininogen
Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej MMP-21	Epitomic	1955-1	MMP21
mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzki CEACAM-1	R&R&D Systems	MAB1180	CEACAM
Przeciwciało monoklonalne szczurze przeciwko ludzkiemu DPPIV/CD26	R&R&D Systems	MAB22441	DPPIV
mysia przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie PIVKA II	Chemia kryształów	8040	PIVICA
Przeciwciało mysie anty-karcino...–antygen embrionalny	biologiczny USA	C1300	CEA
Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA125	biologia USA	C0050-01D	CA125
Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA19-9	biologia USA	C0075-18	CA19-9
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Lewis x	Calbiochem	434631	Lewis X
Biotynilowana BSA (kontrola pozytywna)	Własnej roboty	Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które mają zostać przełożone na język polski.	Bio
Tabela 1. Lista lektyn i przeciwciał użytych w tym protokole.
Bezkontaktowy system do nanoszenia mikromacierzy	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
płytka mikrotitracyjna 384-dołkowa	Fisher Scientific	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Slajdy do mikromacierzy z ultracienką powłoką z nitrocelulozy	Gentel	ŚCIEŻKA
Urządzenie do odcisków na szkiełkach (opcjonalnie)	The Gel Company	WSP60-1
Mieszadło orbitalne	Fisher Scientific	15-453-211
Wirówka	Eppendorf	5804 000.013
Kuweta do płukania/barwienia szkiełek z wyjmowaną wkładką	Fisher Scientific	08-812
Komora inkubacyjna do szkiełek / pudełko na szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	03-448-5
roztwór Brij 35 w stężeniu 30% w/v w wodzie	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Fisher Scientific	P337-100
Periodynian sodu (NaIO4)4)	Sigma-Aldrich	311448
Kwas L-glutaminowy γ-hydrazyd	Sigma-Aldrich	G-7257
Octan sodu bezwodny (CH3COONa)	Sigma-Aldrich	S2889
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Lampire Biological Labs	7500804
Bufor fosforanowy (PBS) (10X)	Denville Scientific	CP4390-48
NeutrAvidyna sprzężona z DyLight 549	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22837
Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz	Grupa Roche	4693159001
ChromPure Human IgG, fragment Fc	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
ChromPure Human IgG, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
ChromPure Mouse IgG, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
ChromPure Mouse IgG, fragment Fc	Jackson ImmunoResearch	015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	017-000-003
Skaner do mikromacierzy	Tecan Group Ltd.	LS Reloaded
Tabela 2. Lista aparatury i odczynników użytych w tym protokole.