Chemicznie blokowana mikromacierz przeciwciał do multipleksowanego profilowania wysokoprzepustowego specyficznej glikozylacji białek w złożonych próbkach

Summary

W tym badaniu opisujemy ulepszony protokół dla multipleksowanej mikromacierzy przeciwciał o wysokiej przepustowości z metodą wykrywania lektyny, która może być wykorzystana do profilowania glikozylacji określonych białek. Protokół ten obejmuje nowe, niezawodne odczynniki i znacznie skraca czas, koszty i wymagania dotyczące sprzętu laboratoryjnego w porównaniu z poprzednią procedurą.

Abstract

W tym badaniu opisujemy skuteczny protokół do użycia w multipleksowanej mikromacierzy przeciwciał o wysokiej przepustowości z detekcją białka wiążącego glikany, która pozwala na profilowanie glikozylacji określonych białek. Glikozylacja białek jest najbardziej rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną występującą w białkach i prowadzi do zróżnicowanych modyfikacji właściwości fizycznych, chemicznych i biologicznych białek. Ponieważ maszyneria glikozylacji jest szczególnie podatna na progresję choroby i transformację złośliwą, nieprawidłowa glikozylacja została uznana za biomarkery wczesnego wykrywania raka i innych chorób. Jednak obecne metody badania glikozylacji białek są zazwyczaj zbyt skomplikowane lub drogie, aby można je było stosować w większości normalnych warunków laboratoryjnych lub klinicznych i potrzebna jest bardziej praktyczna metoda badania glikozylacji białek. Nowy protokół opisany w tym badaniu wykorzystuje chemicznie zablokowaną mikromacierz przeciwciał z detekcją białka wiążącego glikany (GBP) i znacznie skraca czas, koszty i wymagania dotyczące sprzętu laboratoryjnego potrzebnego do badania glikozylacji białek. W tej metodzie wiele immobilizowanych przeciwciał specyficznych dla glikoproteiny jest drukowanych bezpośrednio na szkiełkach mikromacierzy, a N-glikany na przeciwciałach są blokowane. Zablokowane, unieruchomione przeciwciała specyficzne dla glikoproteiny są w stanie wychwycić i wyizolować glikoproteiny ze złożonej próbki, która jest nakładana bezpośrednio na szkiełka mikromacierzy. Wykrywanie glikanów można następnie przeprowadzić poprzez zastosowanie biotynylowanych lektyn i innych GBP do szkiełka mikromacierzy, podczas gdy poziomy wiązania można określić za pomocą Dylight 549-Streptavidin. Dzięki zastosowaniu panelu przeciwciał i sondowaniu wieloma biotynylowanymi lektynami, metoda ta pozwala na opracowanie skutecznego profilu glikozylacji różnych białek znajdujących się w danej próbce ludzkiej lub zwierzęcej.

Wprowadzenie

Glikozylacja białka, która jest najbardziej wszechobecną modyfikacją potranslacyjną białek, modyfikuje fizyczne, chemiczne i biologiczne właściwości białka i odgrywa fundamentalną rolę w różnych procesach biologicznych^1-6. Ponieważ maszyneria glikozylacji jest szczególnie podatna na progresję choroby i transformację złośliwą, nieprawidłowa glikozylacja została uznana za biomarkery wczesnego wykrywania raka i innych chorób ^7-12. W rzeczywistości większość obecnych biomarkerów raka, takich jak frakcja L3 α-1 fetoproteiny (AFP) dla raka wątrobowokomórkowego ^13-15 i CA199 dla raka trzustki ^{16, 17} to nieprawidłowe ugrupowania glikanów na glikoproteinach. Jednak metody badania glikozylacji białek są skomplikowane i nie nadają się do rutynowych warunków laboratoryjnych i klinicznych. Chen i in. wynaleźli niedawno chemicznie zablokowaną mikromacierz przeciwciał z metodą wykrywania białka wiążącego glikan (GBP) do wysokoprzepustowej i multipleksowanej glikozylacji o profilu natywnym glikoprotein w złożonej próbce ¹⁸. W tej metodzie mikromacierzy opartej na powinowactwie wiele immobilizowanych przeciwciał specyficznych dla glikoproteiny wychwytuje i izoluje glikoproteiny ze złożonej mieszaniny bezpośrednio na szkiełku mikromacierzy, a glikany na każdym pojedynczym wychwyconym białku są mierzone za pomocą GBP. Ponieważ wszystkie normalne przeciwciała zawierają N-glikany, które mogą być rozpoznane przez większość GBP, krytycznym krokiem tej metody jest chemiczne zablokowanie glikanów na przeciwciałach przed wiązaniem się z GBP. W procedurze grupy ci-s-diol glikanów na przeciwciałach zostały najpierw utlenione do grup aldehydowych przy użyciu NaIO₄ w buforze octanu sodu, unikając światła. Grupy aldehydowe zostały następnie sprzężone z grupą hydrazydową sieciownika, chlorowodorkiem hydrazydu kwasu 4-(4-N-maleimidofenylo)masłowego HCl (MPBH), a następnie sprzężono dipeptyd Cys-Gly z grupą maleimidową MPBH. W ten sposób grupy cis-diolowe na glikanach przeciwciał zostały przekształcone w duże grupy bezhydroksylowe, co utrudniało wiązanie się lektyn i innych GBP z przeciwciałami wychwytującymi. Ta procedura blokowania sprawia, że GBP i lektyny wiążą się tylko z glikanami wychwyconych białek. Po tym chemicznym zablokowaniu, próbki surowicy inkubowano z mikromacierzą przeciwciał, a następnie wykrywano glikany za pomocą różnych biotynylowanych lektyn i GBP, a następnie wizualizowano za pomocą Cy3-streptawidyny. Równoległe zastosowanie panelu przeciwciał i wielokrotne sondowanie lektyny zapewnia dyskretne profile glikozylacji wielu białek w danej próbce ^18-20. Ta metoda została z powodzeniem zastosowana w wielu różnych laboratoriach ^{1, 7, 13, 19-31}. Jednak stabilność MPBH i Cys-Gly, skomplikowana i rozbudowana procedura w tej metodzie wpływają na odtwarzalność, skuteczność i wydajność metody. W tym nowym protokole zastąpiliśmy zarówno MPBH, jak i Cys-Gly jednym znacznie stabilniejszym odczynnikiem hydrazydem kwasu glutaminowego (Glu-hydrazide), co znacznie poprawiło powtarzalność metody, uprościło i skróciło całą procedurę, dzięki czemu można ją wykonać w ciągu jednego dnia roboczego. W tym nowym protokole opisujemy szczegółową procedurę protokołu, która może być łatwo przyjęta przez normalne laboratoria do rutynowych badań glikozylacji białek i technik, które są niezbędne do uzyskania powtarzalnych i powtarzalnych wyników.

Protocol

1. Wydrukuj mikromacierz przeciwciał do testu

1. Rozcieńczyć wszystkie przeciwciała do 0,5 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej z buforu fosforanowego, pH 7,2 (PBS).
2. Podać 40 μl każdego przeciwciała do 384-dołkowej płytki źródłowej.
3. Załaduj 384-dołkową płytkę źródłową do mikromacierzy Scienion sciFLEXARRAYER.
4. Załaduj 20 szkiełek mikromacierzy PATH do mikromacierzy jako cel.
5. Ustaw mikromacierz tak, aby wydrukowała 48 identycznych podtablic, w których 27 przeciwciał i białek kontrolnych jest wykrywanych w trzech egzemplarzach we wzorze 9x9 (Figura 1E, 1F).
6. Uruchom mikromacierz, aby wydrukować szkiełka mikromacierzy przeciwciał.
7. Zebrać szkiełka z mikromatrycą przeciwciał i przechowywać je w kasecie ze szkiełkami ze środkiem osuszającym. Zamknij próżniowo kasetę w plastikowej torbie za pomocą zgrzewarki próżniowej (Foodsaver).
8. Szczelnie zamknięte szkiełka do mikromacierzy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.

2. Chemicznie zablokuj mikromacierz przeciwciał, aby zapobiec wiązaniu GBP z przeciwciałami wychwytującymi

Test mikromacierzy rozpoczyna się, gdy szkiełka mikromacierzy są chemicznie zablokowane i trwa około 8 godzin. Po uruchomieniu test mikromacierzy musi zostać zakończony (kroki od 2 do 8).

1. Wyjmij szkiełka z mikromacierzy z lodówki i zrównoważ je do temperatury pokojowej przez 30 minut.
2. Wyjąć szkiełko z pudełka do przechowywania i krótko wypłukać je w buforze fosforanowym soli o pH 7,2 z 0,1% Tween 20 (PBST0,1) raz w płynnej umywalce, a następnie w 15 mM buforze octanu sodu o pH 5,0 z 0,1% Tween (CBT0,1) w sposób sekwencyjny. Inkubować szkiełka w CBT0,1 przez 10 minut w umywalce do szkiełka.
3. Przygotuj świeży 150 mM NaIO₄ w 15 mM bufor octanu sodu o pH 5,0 (CB) i przechowuj go w umywalce na suwaku w lodówce, unikając światła przed użyciem.
4. Wyjąć szkiełko z CB i umieścić je w misce zawierającej świeży NaIO₄ stroną z przeciwciałami skierowaną do góry. Przykryj miskę folią aluminiową, aby uniknąć światła, i inkubuj miskę szkiełkową przez 2 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze 4 °C w lodówce.
5. Przygotuj 300 ml 10 mM hydrazydu kwasu glutaminowego (blokera) w CB.
6. Wyjmij szkiełko z umywalki i krótko opłucz je w CB 3 razy przez 5 minut za każdym razem w umywalce przesuwnej.
7. Inkubować szkiełka w blokerze w umywalce przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
8. Wyjmij szkiełka z umywalki i myj je PBST0,1 przez 3 minuty.

3. Blokuj niespecyficzne wiązania z mikromacierzą za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA)

1. Przygotować 300 ml 1% BSA w buforze fosforanowym soli fizjologicznej o pH 7,2 z 0,5% Tween (PBST0,5) w szkiełkowej umywalce i inkubować szkiełko do mikromacierzy w misce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
2. Przepłukać szkiełka w PBST0.1 trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.
3. Umieść szkiełko na stojaku do szkiełek i wiruj w temperaturze 1 200 x g na wirowaniu przez 2 minuty, aby wysuszyć szkiełko do mikromatrycy.

4. Odcisk woskowej siatki na szkiełku mikrotablicy, aby oddzielić każdą podtablicę

1. Wstępne podgrzewanie wosku w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
2. Załaduj zablokowany szkiełko mikromacierzy do drukarki woskowej stroną z przeciwciałem skierowaną w stronę wosku. Delikatnie pociągnij za uchwyt, aby równomiernie odcisnąć wosk na szkiełku.

5. Nałóż próbki surowicy na szkiełko Microarray

1. Podczas etapu 2.4 należy przygotować próbki surowicy do oznaczenia profilowania glikologicznego w jednej próbce (5.1.1) lub do pomiaru pojedynczego epitopu glikologicznego wśród wielu próbek (5.1.2).
   1. W eksperymencie dotyczącym profilowania glikanów wielu glikoprotein surowicy w jednej próbce surowicy przy użyciu wielu GBP (patrz przykładowy eksperyment 1), jedna próbka surowicy zostanie nałożona na wszystkie podmaszerze. W tym przypadku 40 μl surowicy rozcieńcza się w 360 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 μg/ml mysiej IgG, 100 μg/ml szczurzej IgG, 100 μg/ml króliczej IgG, 100 μg/ml koziej IgG i 100 μg/ml IgG osła. Objętość ta jest wystarczająca do nałożenia 6 μl rozcieńczonego roztworu surowicy na każdy podukład.
   2. W eksperymencie dotyczącym pomiaru jednego glikanu na wielu białkach surowicy wśród wielu próbek surowicy przy użyciu jednej detekcji GBP (patrz przykładowy eksperyment 2). W tym przypadku 1 μl surowicy rozcieńcza się do 9 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 μg/ml mysiej IgG, 100 μg/ml szczurzej IgG, 100 μg/ml króliczej IgG, 100 μg/ml koziej IgG i 100 μg/ml IgG osła. Objętość ta jest wystarczająca do nałożenia 6 μl rozcieńczonego roztworu surowicy na każdy podukład.
2. Po odcisku wosku w kroku 4 ostrożnie nanieść 6 μl rozcieńczonej próbki lub próbki kontrolnej (PBST0,1) na każdą podmatrycę szkiełka. Inkubuj szkiełko w nawilżonej kasecie z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Przepłukać szkiełko PBST0,1 trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.
4. Wysuszyć szkiełko, obracając je w temperaturze 1200 x g przez 2 minuty.

6. Nałóż biotynylowane GBP (lektyna lub przeciwciało antyglikańskie) na szkiełko

1. W kroku 2.4 przygotuj 10 μg/ml biotynylowanych lektyn/GBP w PBST0.1.
   1. W eksperymencie z profilowaniem glikanów, w którym bada się jedną próbkę wieloma lektynami (eksperyment próbki 1), przygotuj 350 μl biotynylowanej lektyny, która jest wystarczająca dla wszystkich podukładów.
   2. W badaniach przesiewowych pojedynczego epitopu/biomarkera glikanowego w wielu próbkach przy użyciu wielu lektyn należy przygotować 10 μl każdej biotynylowanej lektyny, która jest wystarczająca dla jednej podmatrycy.
2. Nałożyć 6 μl rozcieńczonej lektyny(-ów) biotynylowanej na każdą podmatrycę szkiełka i inkubować w nawilżonym pudełku na szkiełka z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Przepłukać szkiełka PBST0.1 trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.
4. Wysuszyć szkiełko, obracając je w wirówce o masie 1200 x g przez 2 minuty.

7. Zastosuj barwnik oznaczony NeutrAwidin do wykrywania fluorescencji

1. Przygotuj 350 μl Dylight 549 znakowanej NeutrAvidin, która jest wystarczająca dla wszystkich podukładów.
2. Nałóż 6 μl Dylight 549 oznaczonego jako NeutrAvidin na każdy podukład i inkubuj szkiełko w kasecie z nawilżanym szkiełkiem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Przepłukać szkiełko PBST0,1 trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.
4. Wysuszyć szkiełko, obracając je w wirówce o sile 1200 x g przez 2 minuty.

8. Uzyskaj obraz slajdu z mikrotablicy, skanując slajd

1. Zeskanuj szkiełko za pomocą skanera fluorescencyjnego o rozdzielczości 10 μm. Ustawienia lasera i PMT powinny być jak najmocniejsze, ale nie obserwuje się punktu nasycenia.

9. Ekstrakcja i analiza danych

1. Otwórz obraz w ArrayPro 3.2.
2. Skonfiguruj szablon macierzy zgodnie z mapą macierzy, która pokazuje lokalizacje miejsc przeciwciał. Ostrożnie wyrównaj każdy okrąg szablonu do odpowiedniego miejsca na obrazie.
3. Wyodrębnij intensywność każdego punktu do pliku Excel w celu dalszej analizy.

10. Reprezentatywne wyniki

Przykładowy eksperyment 1

Profilowanie glikozylacji wielu glikoprotein w surowicy w próbce surowicy pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym przy użyciu chemicznie zablokowanej mikromacierzy przeciwciał z wykrywaniem wielu lektyn.

Celem tego eksperymentu jest zbadanie indywidualnego profilu glikozylacji 20 glikoprotein w próbce surowicy pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym (HCC) za pomocą chemicznie zablokowanej mikromacierzy przeciwciał z detekcją lektyny. Mikromacierz przeciwciał, która zawiera 48 identycznych podmacierzy, w tym 26 przeciwciał i biotynę-BSA, została zaprojektowana i wyprodukowana zgodnie z opisem w kroku 1. Te 26 przeciwciał było skierowanych przeciwko 20 glikoproteinom surowicy, które zidentyfikowano jako obiecującą wartość wczesnej diagnozy dla pacjentów z HCC przy użyciu immunoprecypitacji opartej na lektynie w połączeniu z identyfikacją białek metodą spektrometrii mas^{12, 32}, jak pokazano w Tabeli 1. Wzór i rozmieszczenie plamek przeciwciał wydrukowanych w trzech egzemplarzach w jednej reprezentatywnej podmatrycy pokazano odpowiednio na rysunku 1E i 1F. Dwa identyczne szkiełka mikromacierzy, z których jeden nie był chemicznie zablokowany (ryc. 1A), podczas gdy drugi był (ryc. 1B), wykorzystano do przeprowadzenia tego samego eksperymentu profilowania glikozylacji w celu zademonstrowania znaczenia procedury blokowania chemicznego dla analizy. W przypadku chemicznie zablokowanego szkiełka (ryc. 1B) eksperyment rozpoczął się od kroku 2; w przypadku szkiełka bez blokady chemicznej (rysunek 1A) eksperyment rozpoczął się od kroku 3. Eksperyment został przeprowadzony, wykonując wszystkie kroki opisane w protokole, z wyjątkiem kroku 5.1.2 i 6.1.2. W kroku 5.2 próbkę kontrolną PBST0,1 nałożono na podmacierze w kolumnie 1 i 3, a zbiorczą próbkę surowicy HCC nałożono na podtablice odpowiednio w kolumnie 2 i 4 (jak pokazano na rysunku 1G). Porównanie to ma na celu pokazanie skuteczności, efektywności zabiegu, a także powinowactwa do wiązania antygenu przez przeciwciała po chemicznej blokadzie. 22 biotynylowane lektyny (jak pokazano w Tabeli 1), które są specyficzne dla różnych glikanów^{18, 20} nałożono na każdą podmatrycę, jak pokazano na rysunku 1G w celu profilowania glikozylacji. Obrazy chemicznie zablokowanych (Rysunek 1B) i niezablokowanych chemicznie (Rysunek 1A) mikromacierzy po teście profilowania glikozylacji zgodnie z protokołem. Jak pokazano w podmaszerach w kolumnach 1 i 3 w mikromacierzach nieblokowanych chemicznie (Figura 1A i Figura 1C), na które nałożono tylko PBST0,1, większość lektyn wiązała się z przeciwciałami wychwytującymi i wykazywała bardzo wysokie tło, które jest porównywalne z podmatrycami w kolumnach 2 i 4, na które nałożono próbkę surowicy. Niemożliwe jest uzyskanie informacji o profilu glikanowym z tego szkiełka mikromacierzy. Wręcz przeciwnie, gdy ten sam eksperyment przeprowadzono na chemicznie zablokowanym szkiełku mikromatrycowym przeciwciał, podmacierze w kolumnie 1 i 3, na które nałożono tylko PBST0,1, większość lektyn nie wykazywała żadnych lub bardzo niskie wiązania w celu wychwytywania przeciwciał; podczas gdy wysokie wiązania antygenu nadal obserwowano w podtablicach w kolumnie 2 i 4, na które nałożono próbkę surowicy (Figura 1B i 1D). Wyniki te pokazały, że procedura chemicznego blokowania była krytycznym krokiem przed pomiarem glikanów na glikoproteinach wychwyconych przez przeciwciała. Postępując zgodnie z protokołem, można uzyskać profile glikozylacji 22 glikoprotein w surowicy HCC.

Eksperyment 2

Badanie przesiewowe pod kątem zmienionej fukozylacji na określonych glikoproteinach surowicy jako biomarkerach dla pacjentów z dyskryminowaną marskością wątroby i rakiem wątrobowokomórkowym.

Celem tego eksperymentu jest badanie przesiewowe pod kątem zmienionej fukozylacji na określonych glikoproteinach surowicy jako biomarkerach, które dyskryminują pacjentów z marskością wątroby i rakiem wątrobowokomórkowym (HCC). W odróżnieniu od Eksperymentu 1, w którym tylko jedną próbkę surowicy nałożono na każdą podmatrycę i sondowano różnymi lektynami, w tym teście na każdą podmatrycę nałożono łącznie 40 różnych próbek surowicy od pacjentów z HCC i marskością wątroby i sondowano ją jedną lektyną (AAL). Przeprowadzono analizę statystyczną, taką jak test T, krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), w celu oceny rozkładu lub wydajności diagnostycznej epiptopu/biomarkera glikanowego na każdym białku we wszystkich próbkach surowicy. Użyliśmy tej samej mikromacierzy przeciwciał wyprodukowanej w eksperymencie 1, z wyjątkiem przeciwciał anty-CA19-9 i anty-Lewis X w tym badaniu. Eksperyment został przeprowadzony od 2 września do Kroku 9, z wyjątkiem Kroku 5.1.1 i 6.1.1. Łącznie 40 próbek surowicy od 20 pacjentów z marskością wątroby i 20 pacjentów z HCC zastosowano w losowej podmatrycy 48 podtablic wraz z kontrolnymi próbkami PBS jako kontrolę ujemną. Fukozylacja każdego z wychwyconych białek została następnie wykryta za pomocą biotynylowanej lektyny specyficznej dla fukozy. Obraz mikromacierzy pokazany na rycinie 1 wykazał, że lektyna AAL wiąże się tylko z białkami surowicy wychwyconymi na mikromacierzy (ryc. 2D), a nie z wychwyconymi przeciwciałami (ryc. 2E). Intensywność wiązania AAL wszystkich plamek została następnie wyekstrahowana i przeanalizowana za pomocą testu T i krzywych ROC w celu oceny wydajności fukozylacji (intensywności wiązania AAL) każdego białka surowicy na dyskryminację między grupami HCC i marskością wątroby. Wyniki wykazały, że fukozylacja białka GP73 dała najlepszą dyskryminację między obiema grupami przy p = 0,03 i krzywej pola pod krzywą ROC równą 0,72. Eksperyment ten wykazał, że procedura ta jest szybką i skuteczną metodą badania przesiewowego epitopów/biomarkerów glikanowych na wielu próbkach w wielu białkach.

id Nazwa odczynnika skrót firma Katalog # L1 Biotynylowana konkanawalina A ConA Laboratoria wektorowe BK-1000 L2 Biotynylowany lektyn Sambucus Nigra Sna Laboratoria wektorowe Zobacz materiał B-1305 L3 Biotynylowana soczewka Culinaris Aglutynina Lca Laboratoria wektorowe BK-2000 L4 Biotynylowana aglutynina Ricinus communis I Rca Laboratoria wektorowe BK-1000 Zobacz materiał L5 Biotynylowana Aleuria Aurantia Lectin Aal Laboratoria wektorowe Zobacz materiał B-1395 L6 Biotynylowany lektyn Erythrina Cristagalli Ecl Laboratoria wektorowe BK-3000 L7 Biotynylowana Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II GSL II (wersja angielska) Laboratoria wektorowe BK-3000 L8 Biotynylowana aglutynina z kiełków pszenicy WGA (Dyrekcja Generalna Laboratoria wektorowe BK-1000 L9 Biotynylowany Phaseolus vulgaris Erytroaglutynina PHA-E Laboratoria wektorowe BK-2000 L10 Biotynylowany Phaseolus vulgaris Leucoagglutynina PHA-L Laboratoria wektorowe BK-2000 Zobacz materiał L11 Biotynylowana aglutynina z orzeszków ziemnych Pna Laboratoria wektorowe BK-1000 L12 Biotynylowana aglutynina Pisum Sativum PSA (PSA) Laboratoria wektorowe BK-2000 Zobacz materiał L13 Biotynylowana aglutynina Dolichos Biflorus Dba Laboratoria wektorowe BK-1000 L14 Biotynylowana lektyna Datura Stramonium Język DSL Laboratoria wektorowe BK-3000 L15 Biotynylowana aglutynina Sophora japonica SJA Laboratoria wektorowe BK-2000 L16 Biotynylowana aglutynina sojowa Sba Laboratoria wektorowe BK-1000 L17 Biotynylowany lektyna Solanum Tuberosum (ziemniak) Stl Laboratoria wektorowe BK-3000 L18 Biotynylowana gryfa (Bandeiraea) Simplicifolia lektyna I GSL I Laboratoria wektorowe BK-2000 L19 Biotynylowany lektyn Vicia Villosa VVL (język VVL) Laboratoria wektorowe BK-2000 L20 Biotynylowany lektyn Lycopersicon Esculentum (pomidor) DGW Laboratoria wektorowe BK-3000 Zobacz materiał L21 Biotynylowana aglutynina Ulex Europaeus I UEA I Laboratoria wektorowe BK-1000 L22 Biotynylowana Jakalina JACALIN Laboratoria wektorowe BK-3000 Klasa A1 Kozioł F(ab')2 Fragment anty-ludzkiego IgM, przeciwciało Fc5μ Igm Jackson Immuno Research (Badania Immunologiczne Jacksona) Numer katalogowy: 109-006-129 Klasa A2 Przeciwciało przeciwko ludzkiej IgG (H+L) osiołkowi F(ab')2 Frag Zobacz materiał AB1 Jackson Immuno Research (Badania Immunologiczne Jacksona) Tel. 709-006-149 Klasa A3 Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie IgG F(ab')2 Zobacz materiał AB3 Jackson Immuno Research (Badania Immunologiczne Jacksona) 209-005-097 Format A4 Kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej makroglobulinie alfa 2 A2M GeneTex (Certyfikat genetyczny) GTX62924 Klasa A5 Królicze przeciwciało poliklonalne anty-ludzkiej alfa-1-antytrypsyny A1AT Lee Biosiences powiedział: CA1T-80A Klasa A6 Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkiej alfa-1-antytrypsyny A1AT Sigma Aldrich SAB4200198 Klasa A7 Królicze przeciwciało poliklonalne anty-ludzkiej alfa-1-antytrypsyny akt Znaczniki NeoMarkers RB-367-A1 Ciąg A8 Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1-antychymotrypsynie akt Fisher Naukowy RB9213R7 A9 Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej transferynie Transferyna GeneTex (Certyfikat genetyczny) GTX101035 A10 Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej transferynie Transferyna GeneTex (Certyfikat genetyczny) GTX77130 Autostrada A11 Przeciwciało poliklonalne kozy przeciwko ludzkiej apolipoproteinie J ApoJ (ApoJ) Księga Abcam ab7610 powiedział: Ciąg A12 Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GP73 Płyta główna GP73 Abbott godz. 14H4-23 Autostrada A13 Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GP73 Płyta główna GP73 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC SC-101275 powiedział: Autostrada A14 Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie Afp Droga genowa GWB-41C966 Ciąg obudowy A15 Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie Afp Fitzgerald 10-A05A Autostrada A16 Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej hemopeksynie Hemopeksyna Assaypro powiedział: Nr kat. 60190-05011 Ciąg A17 Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie glypican-3(1G12) Licencja GPL3 Życiorys Santa Cruz SC-65443 powiedział: Ciąg A18 Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzki Kininogen (LMW) Kininogen Assaypro powiedział: 20333-05011 Ciąg A19 Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu MMP-21 Złącze MMP21 Epitomiczny Lata 1955-1 Ciąg A20 Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CEACAM-1 CEACAM (CEACAM) Systemy badawczo-rozwojowe MAB1180 A21 Szczurze przeciwciało monoklonalne przeciwko człowiekowi DPPIV/CD26 Szczepionka DPPIV Systemy badawczo-rozwojowe MAB22441 Ciąg A22 Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu PIVKA II PIVICA (PIŁKA) Kryształowa chemia Numer katalogowy 8040 Ciąg A23 Mysi antygen przeciwnowotworowy Cea Biologiczny w USA Zobacz materiał C1300 Sieć A24 Mysi antygen nowotworowy anty-CA125 Zobacz materiał CA125 Biologiczny w USA C0050-01D Autostrada A25 Mysi anty -CA19-9 Antygen nowotworowy Zobacz materiał CA19-9 Biologiczny w USA Zobacz materiał C0075-18 Ciąg obudowy A26 Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Lewisa x Lewisa X Calbiochem (Elektrownia Jądrowa) 434631 bio Biotynylowane BSA (kontrola pozytywna) bio Domowej roboty N/a

Tabela 1. Wykaz lektyn i przeciwciał stosowanych w tym protokole.

Nazwa odczynników/urządzeń firma Numer katalogowy Mikromacierz bezkontaktowa BioDot Inc sciFLEXARRAYER (biblioteka sciFLEXARRAYER) 384 mikropłytka rybak Numer katalogowy: 14-230-243 Oszczędzanie żywności Oszczędzanie żywności Zobacz materiał V3835 Ultracienkie szkiełka do mikromatryc nitrocelulozowych coate Gentel ścieżka Drukarka suwakowa (opcjonalnie) Firma żelowa Zobacz materiał WSP60-1 Shakerze bostońskim rybak Numer katalogowy: 15-453-211 wirówka Eppendorf powiedział: 5804 000.013 Umywalka przesuwna/naczynie do barwienia slajdów ze zdejmowanym stojakiem rybak Numer katalogowy: 08-812 Komora inkubacyjna szkiełka / pudełko na szkiełka mikroskopowe rybak 03-448-5 Brij 35, 30 w/v% roztwór w wodzie Acros Organics AC32958-0025 Tween-20 (Kanał Telewizyjny) rybak Zobacz materiał P337-100 Periodynian sodu (NaIO₄) Sigma 311448 Kwas L-glutaminowy γ-hydrazyd Sigma G-7257 powiedział: Octan sodu bezwodny (_CH3COONa) Sigma Zobacz materiał S2889 Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Laboratoria biologiczne Lampire 7500804 Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) (10X) Naukowy Denville CP4390-48 Dylight 549 sprzężony NeutrAwidin Thermo Numer katalogowy: 22837 Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe Roche 4693159001 ChromPure Human IgG, fragment Fc Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) Numer katalogowy: 009-000-008 ChromPure Human IgG, cała cząsteczka Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) Numer telefonu 009-000-003 ChromPure Mouse IgG, cała cząsteczka Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) Numer katalogowy: 015-000-003 ChromPure IgG Myszy, fragment Fc Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) Numer katalogowy: 015-000-008 ChromPure IgG Królika, cała cząsteczka Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) Numer katalogowy: 011-000-003 ChromPure Donkey IgG, cała cząsteczka Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) Numer katalogowy: 017-000-003 Skaner mikromacierzy Tecan (tekan) LS Reaktywacja

Tabela 2. Wykaz urządzeń i odczynników stosowanych w niniejszym protokole.

Schemat 1. Schemat przedstawiający proces odkrywania biomarkerów glikanowych opartych na mikromacierzy przeciwciał lektynowych. 1 (Krok 2 do 4): Zablokuj mikromacierz przeciwciał za pomocą blokera (glu-hydrazydu) i BSA; 2 (Krok 5): nanieść próbki surowicy i wychwycić określone glikoproteiny ze specyficznymi przeciwciałami; 3 (Krok 6): zastosuj biotynylowane lektyny; 4 (Krok 7): Sonduj biotynylowany AAL za pomocą Dylight 549 znakowanego NeutrAvidin do obrazowania mikromacierzy.

Rysunek 1. Obrazy mikromacierzy z Eksperymentu Próbki1 profilowanie glikozylacji wielu glikoprotein w surowicy pacjenta z HCC w próbce surowicy pacjenta z HCC przy użyciu chemicznie zablokowanej mikromacierzy przeciwciał z wielokrotną detekcją lektyny. Dwa identyczne szkiełka mikromacierzy, (A) żadne nie były chemicznie zablokowane lub (B) były chemicznie zablokowane, jak opisano w kroku 2, przeszły przez wszystkie etapy od 2 do 9 w celu profilowania glikozylacji, a także w celu porównania. (A) i (B) to obrazy mikromacierzy zeskanowane w kroku 8 w rozdzielczości 10 mikronów. (C) powiększenie obrazu pierwszych dwóch rzędów szkiełka z mikromatrycą bez blokady chemicznej (A); (D) powiększenie obrazu pierwszych dwóch rzędów szkiełka z mikromatrycą niezablokowaną chemicznie (B)); (E) schemat rozmieszczenia przeciwciał w każdym podukładzie; (F) mapy tablicowe: lokalizacja każdego przeciwciała w podtablicy, każda nazwa przeciwciała reprezentuje 3 miejsca; (G) Próbka surowicy i lokalizacja lektyny: diagram pokazuje, na którą podmatrycę nałożono każdą próbkę surowicy i lektynę.

Rysunek 2. Obrazy mikromacierzy próbki eksperymentu 2 badają przesiewowo pod kątem zmienionej fukozylacji na określonych glikoproteinach surowicy jako biomarkerach, które dyskryminują marskość wątroby i pacjentów z HCC. Test mikromacierzy przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji Eksperyment z próbką 2. (A) Cały obraz slajdu z mikromacierzy z kroku 8; (B) schemat rozmieszczenia przeciwciał w każdym podukładzie; (C) mapy tablicowe: lokalizacja każdego przeciwciała w podtablicy, każda nazwa przeciwciała reprezentuje 3 miejsca; (D) powiększony obraz podmatrycy, która była inkubowana z próbką surowicy; (E) powiększony obraz podmacierzy, która była inkubowana za pomocą kontrolki PBS.

Rysunek 3. Wyniki profilowania glikanów z przykładowego eksperymentu 1. Każdy wykres słupkowy przedstawia profil wiązania lektyny (lub profile glikanów) jednego z 20 badanych białek. Do analizy profilu glikanowego każdego białka użyto łącznie 22 różnych lektyn. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

1. Wybór białka docelowego i wychwytu przeciwciał

Przed testem mikromacierzy przeciwciał należy rozważyć i przygotować pewne odczynniki i materiały. Aby zaprojektować mikromacierz przeciwciał do profilowania glikanów lub badań przesiewowych biomarkerów glikanów, należy określić panel przeciwciał specyficznych dla kandydatów na glikoproteiny zgodnie z literaturą lub na podstawie wcześniejszych wyników. Przeciwciała te były zwykle kupowane od różnych dostawców, takich jak systemy badawczo-rozwojowe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotynylowana konkanawalina A	Vector Laboratories	BK-1000	ConA
Biotynylowana Sambucus Nigra Lectin	Vector Laboratories	B-1305	SNA
Biotynylowana soczewka Culinaris Agglutynina	Vector Laboratories	BK-2000	LCA
Biotynylowana Ricinus Communis Agglutynina I	Vector Laboratories	BK-1000	RCA
Biotynylowana Aleuria Aurantia Lectin	Vector Laboratories	B-1395	AAL
Biotynylowana Erythrina Cristagalli Laboratoria wektorowe lektyny		BK-3000	ECL
Biotynylowana gryfa (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II	Vector Laboratories	BK-3000	GSL II
Biotynylowana aglutynina z kiełków pszenicy	Vector Laboratories	BK-1000	WGA
Biotynylowany Phaseolus vulgaris Erythroagglutynin	Vector Laboratories	BK-2000	PHA-E
Biotinylowany Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	Vector Laboratories	BK-2000	PHA-L
Biotynylowana aglutynina	Vector Laboratories	BK-1000	PNA
Biotynylowana aglutynina Pisum Sativum	Vector Laboratories	BK-2000	PSA
Biotynylowane Dolichos Biflorus Wektor aglutyniny	Laboratoria	BK-1000	DBA
Biotynylowane Datura Stramonium Wektorowe	Laboratoria Wektorowe	BK-3000	DSL
Biotynylowane Wektory aglutyniny Sophora Japonica	Laboratoria wektorowe	BK-2000	SJA
Biotynylowane aglutyniny sojowej	Vector Laboratories	BK-1000	SBA
Biotynylowane Solanum Tuberosum (ziemniak) Lectin	Vector Laboratories	BK-3000	STL
Biotynylowana gryfa (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories	BK-2000	GSL I
Biotynylowana Vicia Villosa Vector	Laboratories	BK-2000	VVL
Biotynylowany Lycopersicon Esculentum (Pomidor) Lectin	Vector Laboratories	BK-3000	DGW
Biotynylowana Ulex Europaeus Agglutynina I	Vector Laboratories	BK-1000	UEA I
Biotynylowane	Laboratoria wektorowe	BK-3000	JACALIN
Koza F(ab')2 Fragment anty-ludzkiej IgM, Fc5μ przeciwciało	Jackson Immuno Research	109-006-129	Przeciwciało IgM
Donkey F(ab')2 Frag anty-ludzkie przeciwciało IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	709-006-149	Zobacz materiał AB1
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie IgG F(ab')2	Jackson Immuno Research	209-005-097	AB3
Kozioł anty-ludzki alfa 2 makroglobulina przeciwciało poliklonalne	GeneTex	GTX62924	A2M
Królik anty-ludzki alfa-1-antytrypsynowy przeciwciało poliklonalne	Lee Biosiences	CA1T-80A	A1AT
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkiej alfa-1-antytrypsyny	Sigma-Aldrich	SAB4200198	A1AT
Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie	NeoMarkers	RB-367-A1	ACT
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-ludzkie alfa-1-antychymotrypsyny	Fisher Scientific	RB9213R7	ACT
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej transferynie	GeneTex	GTX101035	Transferyna
Królik anty-ludzka transferyna przeciwciało poliklonalne	GeneTex	GTX77130	Transferyna
Koza anty-ludzka apolipoproteina J przeciwciało poliklonalne	Abcam	ab7610	ApoJ
Mysz anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne GP73	Abbott Laboratories	14H4-23	GP73
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GP73	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC	SC-101275	GP73
Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie	GenWay	GWB-41C966	AFP
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie	Fitzgerald	10-A05A	AFP
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej hemopeksynie	Assaypro	60190-05011	Hemopexin
Mysz anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne glypican-3 (1G12)	Santa Cruz Bio	sc-65443	GPL3
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie Kininogen (LMW)	Assaypro	20333-05011	Kininogen
Rabbit anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne MMP-21	Epitomic	1955-1	MMP21
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CEACAM-1	R& D Systems	MAB1180	CEACAM
Rat anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne DPPIV / CD26	R& D Systems	MAB22441	DPPIV
Mysz anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne PIVKA II	Crystal chem	8040	PIVICA
Mysz antyrakowa– Antygen mbryonowy	US biologiczny	C1300	CEA
Mysi antygen raka anty-CA125	US biologiczny	C0050-01D	CA125
Mysi anty -CA19-9 Antygen raka	US biologiczny	C0075-18	CA19-9
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Lewis x	Calbiochem	434631	Lewis X
Biotynylowane BSA (kontrola pozytywna)	Domowej roboty	N/A	bio
Tabela 1. Lista lektyn i przeciwciał używanych w tym protokole.
Mikromatryca bezkontaktowa	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 mikropłytka	Fisher Scientific	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultracienkie szkiełka do mikromatryc nitrocelulozowych coate	Gentel	PATH
Slide Imprinter (opcjonalnie)	Firma żelowa	Wytrząsarka WSP60-1
	Fisher Scientific	15-453-211
Wirówka	Eppendorf	5804 000.013
Umywalka do szkiełek/Naczynie do barwienia szkiełek z wyjmowanym stojakiem	Fisher Scientific	08-812
Komora inkubacyjna do szkiełek szkiełkowych/pudełko na szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	03-448-5
Brij 35, 30 w/v% roztwór w wodzie	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Fisher Scientific	P337-100
Periodynian sodu (NaIO4)	Sigma-Aldrich	311448
Kwas L-glutaminowy γ-hydrazyd	Sigma-Aldrich	G-7257
Octan sodu bezwodny (CH3COONa)	Sigma-Aldrich	S2889
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Lampire Biological Labs	7500804
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) (10X)	Denville Scientific	CP4390-48
Dylight 549 sprzężony NeutrAwidin	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22837
Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe	Roche Group	4693159001
ChromPure Human IgG, fragment Fc	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
ChromPure Human IgG, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
ChromPure IgG myszy, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
ChromPure Mysia IgG, fragment Fc	Jackson ImmunoResearch	015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, cała cząsteczka	Jackson ImmunoResearch	017-000-003
Skaner mikromacierzy	Tecan Group Ltd.	LS Reloaded
Table 2. Lista urządzeń i odczynników używanych w tym protokole.