Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Po uwolnieniu do szczeliny synaptycznej dopamina wykazuje swoje właściwości biologiczne poprzez cele presynaptyczne i postsynaptyczne1. Sygnał dopaminergiczny jest przerywany przez dyfuzję2-3, enzymy zewnątrzkomórkowe4 oraz transportery błonowe5. Transporter dopaminy, zlokalizowany w szczelinie perisynaptycznej neuronów dopaminergicznych, usuwa uwolnione aminy poprzez dośrodkowy strumień dopaminy (wychwyt). Transporter dopaminy może również działać w kierunku odwrotnym, uwalniając aminy z wnętrza na zewnątrz w procesie zwanym transportem odśrodkowym lub efleuksem dopaminy5. Ponad 20 lat temu Sulzer et al. zgłosili, że transporter dopaminy może działać w dwóch trybach aktywności: w przód (wychwyt) i w tył (efleuks)5. Neuroprzekaźnik uwalniany poprzez efleuks przez transporter może przemieścić dużą ilość dopaminy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i wykazano, że odgrywa on kluczową rolę regulacyjną w homeostazie zewnątrzkomórkowej dopaminy6. W niniejszej pracy opisujemy, w jaki sposób jednoczesny pomiar metodą patch clamp i amperometrii może być wykorzystany do pomiaru uwalnianej dopaminy poprzez mechanizm efleuksu z milisekundową rozdzielczością czasową przy kontrolowanym potencjale błonowym. W tym celu prąd z całej komórki (whole-cell) oraz sygnały oksydacyjne (amperometryczne) są mierzone jednocześnie przy użyciu wzmacniacza Axopatch 200B (Molecular Devices, z filtrem dolnoprzepustowym Bessela ustawionym na 1,000 Hz dla pomiaru prądu whole-cell). Do pomiaru amperometrycznego elektroda z włókna węglowego jest podłączona do drugiego wzmacniacza (Axopatch 200B), umieszczona w sąsiedztwie błony plazmatycznej i utrzymywana przy potencjale +700 mV. Prądy whole-cell i oksydacyjne (amperometryczne) mogą być rejestrowane, a zależność prąd-napięcie może zostać wygenerowana przy użyciu protokołu skoków napięcia. W przeciwieństwie do zwykłej kalibracji amperometrycznej, która wymaga przeliczenia na stężenie, prąd jest raportowany bezpośrednio bez uwzględnienia objętości efektywnej7. Zatem wynikowe dane reprezentują dolną granicę efleuksu dopaminy, ponieważ część przekaźnika jest tracona do roztworu objętościowego.
Protokół
1. Sprzęt i materiały
- Zamontuj klatkę Faradaya na stole antywibracyjnym (TMI), aby zmniejszyć szum tła.
- System do jednoczesnego rejestrowania prądów metodą patch-clamp i amperometrii wymaga mikroskopu odwróconego z doskonałą optyką DIC i obiektywem o dużej odległości roboczej. Podłącz oświetlenie mikroskopu do akumulatora samochodowego. To źródło światła prądu stałego (DC) dla systemu pozwoli na dalszą redukcję szumów elektrycznych.
- Hydrauliczne mikromanipulatory (Siskiyou) dodatkowo zmniejszają poziom szumów. W naszej konfiguracji używamy manipulatora praworęcznego do rejestracji z całej komórki (whole cell recording), a leworęcznego do amperometrii.
2. Przygotowanie elektrod do rejestracji
- Wytocz elektrody do patch-clampu za pomocą pipet kwarcowych w wyciągaczu P-2000 (Sutter). Nasz proces wyciągania trwa około 5 s i obejmuje dwa cykle grzania. Taki czas nagrzewania pozwolił uzyskać powtarzalną rezystancję (3-4 MΩ) w naszych pipetach do konfiguracji whole-cell.
- Napełnij elektrodę roztworem do pipety zawierającym 2 mM dopaminy i zamocuj ją w prawym manipulatorze. Pojemnik z roztworem zawierającym DA owiń folią aluminiową. Przechowuj w lodzie. Dopamina ulega utlenianiu. Przechowywanie roztworu w lodzie, z ochroną przed światłem, zmniejszy tempo utleniania dopaminy.
- Ostrożnie wyjmij z pudełka do przechowywania niskoszumową amperometryczną elektrodę z włókna węglowego ProCFE (Dagan), napełnij ją rtęcią, zamocuj w adapterze amperometrycznym (jak pokazano na Rysunku 1), a następnie zamocuj w prawym manipulatorze. Chroń końcówkę włókna węglowego przed uszkodzeniem, trzymając włókno za dalny koniec. Sprawdź elektrodę pod mikroskopem laboratoryjnym, aby upewnić się, że końcówka jest czysta i nieuszkodzona.
- Sprawdź sprawność elektrody amperometrycznej, umieszczając ją w szalce Petriego z szklanym dnem zawierającej roztwór zewnętrzny. Zarejestruj prąd bazowy w obecności dopaminy. Dodaj do szalki 10 μl roztworu DA o stężeniu 1mM. Sprawna elektroda amperometryczna zarejestruje wzrost prądu utleniania. Powtarzaj ten krok na początku i na końcu każdego eksperymentu, aby upewnić się, że elektroda amperometryczna działa prawidłowo.
3. Przygotowanie pierwotnej hodowli neuronów dopaminergicznych lub komórek zmodyfikowanych w celu ekspresji transportera dopaminy w szalkach Petriego z szklanym dnem
- Komórki lub neurony dopaminergiczne należy delikatnie przemyć trzykrotnie ciepłym roztworem zewnętrznym.
- Szalkę Petriego z szklanym dnem należy zamocować na stoliku mikroskopu.
4. Wizualizacja komórki i przeprowadzenie eksperymentu
- Znajdź odpowiednią płaszczyznę ogniskowania, aby wyraźnie zwizualizować komórki. Przyłóż dodatnie ciśnienie do elektrody patch. Następnie ostrożnie wprowadź obie elektrody do roztworu, blisko komórki.
- Ustaw elektrodę amperometryczną obok komórki (po lewej stronie), a elektrodę patch po prawej stronie.
- Uzyskaj uszczelnienie gigaohmiczne (gigaohm seal) na komórce za pomocą elektrody patch. Przerwij uszczelnienie za pomocą ssania, aby uzyskać konfigurację whole cell.
- Odczekaj 5-8 min na dializę roztworu wewnętrznego zawierającego dopaminę do wnętrza komórki.
- Zastosuj wybrany protokół skokowy lub rampowy napięcia. Jednocześnie zbieraj dane z pipety patch oraz elektrody amperometrycznej, aby zmierzyć prądy whole cell i transport wsteczny dopaminy przez transporter dopaminy, podczas gdy potencjał błonowy jest kontrolowany za pomocą pipety patch.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Połączenie techniki patch clamp z amperometrią pozwala na pomiar zależnego od napięcia wypływu DA pośredniczonego przez DAT. Rycina 2A przedstawia reprezentatywną konfigurację eksperymentalną oraz zapis wypływu DA pośredniczonego przez DAT, gdy środowisko wewnątrzkomórkowe i potencjał błonowy są stabilizowane przez pipetę do patch clampu w konfiguracji whole-cell. Przy użyciu tej techniki komórki wykazujące ekspresję białek YFP-DAT są poddawane stabilizacji napięcia za pomocą pipety whole-cell, podczas g...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jednoczesne zastosowanie techniki clamp voltage (zacisk potencjału) oraz amperometrii niesie ze sobą następujące korzyści. Dostępne są wszystkie typy komórek, które mogą być wykorzystane do rejestracji. Identyfikacja komórek lub neuronów, w których prowadzone są pomiary, jest prosta i bezpośrednia. W szczególności, jeśli komórka jest znakowana fluorescencyjnie poprzez dodanie znacznika do białka zainteresowania, badacz może łatwo wybrać docelową komórkę lub neuron. Konfiguracja eksperymentalna umożliwia jednorodne i kont...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Sanice Chirwie za krytyczną recenzję niniejszego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (DA026947, DA021471 oraz NS071122).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt | |||
| Stół antywibracyjny z klatką Faradaya | Technical Manufacturing Corporation | seria 63-500 | używamy modelu 63-543 |
| Mikroskop odwrócony Nikon TE-2000 | Nikon | wycofany z produkcji | obecnie Eclipse Ti |
| Dwa niskoszumowe wzmacniacze axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| Głowica 1-CV 203 BU | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| Uchwyt do pipet 1-HL-U | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Przetwornik A/C Digidata 1440A | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Dwa manipulatory Siskyou, lewostronny i prawostronny | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laserowy wyciągacz pipet | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Niskoszumowa amperometryczna elektroda z włókna węglowego | ProCFE | www.dagan.com | |
| Niskoszumowa pipeta kwarcowa | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| Akumulator samochodowy 12 V | powszechnie dostępny | ||
| Ładowarka do akumulatorów samochodowych | powszechnie dostępna | ||
| Odczynniki | |||
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dekstroza | Sigma | G7528 | |
| Siarczan magnezu (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Fosforan potasu jednopodstawny (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Chlorek potasu (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
Bibliografia
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382(2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
