Artykuł metodologiczny

Jednokomórkowy pomiar uwalniania dopaminy z jednoczesnym cęgowaniem napięcia i amperometrią

DOI:

10.3791/3798

⸱

21 listopada 2012

 ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Florida , 2Department of Psychiatry, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki, wykrywając prąd oksydacyjny wytwarzany przez spontaniczne utlenianie dopaminy. Jednoczesna metodologia cęgowania napięcia i amperometrii ujawnia mechanistyczny związek między ogólną "aktywnością" transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w odwrotnym transporcie dopaminy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po uwolnieniu do szczeliny synaptycznej, dopamina wywiera swoje właściwości biologiczne poprzez swoje cele pre- i postsynaptyczne1. Sygnał dopaminy jest przerywany przez dyfuzję2-3, enzymy zewnątrzkomórkowe4 i transportery błonowe5. Transporter dopaminy, znajdujący się w szczelinie okołosynaptycznej neuronów dopaminy, usuwa uwolnione aminy poprzez wewnętrzny strumień dopaminy (wychwyt). Transporter dopaminy może również działać w odwrotnym kierunku, aby uwolnić aminy od wewnątrz na zewnątrz w procesie zwanym transportem zewnętrznym lub wypływem dopaminy5. Ponad 20 lat temu Sulzer i wsp. stwierdzili, że transporter dopaminy może działać w dwóch trybach aktywności: do przodu (wychwyt) i do tyłu (wypływ)5. Neuroprzekaźnik uwalniany przez wypływ przez transporter może przenosić dużą ilość dopaminy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i wykazano, że odgrywa główną rolę regulacyjną w zewnątrzkomórkowej homeostazie dopaminy6. Tutaj opisujemy, w jaki sposób jednoczesny zapis patch clamp i amperometrii może być wykorzystany do pomiaru uwolnionej dopaminy za pośrednictwem mechanizmu wypływu z milisekundową rozdzielczością, gdy potencjał błonowy jest kontrolowany. W tym celu prąd całego ogniwa i sygnały oksydacyjne (amperometryczne) są mierzone jednocześnie za pomocą wzmacniacza Axopatch 200B (Molecular Devices, z dolnoprzepustowym filtrem Bessela ustawionym na 1,000 Hz do rejestracji prądu całego ogniwa). Do rejestracji amperometrycznej elektroda z włókna węglowego jest podłączona do drugiego wzmacniacza (Axopatch 200B) i umieszczana w sąsiedztwie błony plazmatycznej i utrzymywana pod napięciem +700 mV. Prądy całokomórkowe i utleniające (amperometryczne) mogą być rejestrowane, a zależność prąd-napięcie może być generowana za pomocą protokołu krokowego napięcia. W przeciwieństwie do zwykłej kalibracji amperometrycznej, która wymaga konwersji na stężenie, prąd jest podawany bezpośrednio, bez uwzględniania efektywnej objętości7. W związku z tym uzyskane dane reprezentują dolną granicę wypływu dopaminy, ponieważ część nadajnika jest tracona na rzecz roztworu masowego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sprzęt i zaopatrzenie

  1. Zamontuj klatkę Faradaya na stole antywibracyjnym (TMI), aby zmniejszyć hałas tła.
  2. Jednoczesny system rejestracji amperometrii z zaciskiem krosowym wymaga odwróconego mikroskopu z doskonałą optyką DIC i obiektywem o dużej odległości roboczej. Podłącz latarnię mikroskopową do akumulatora samochodowego. To źródło światła DC dla systemu jeszcze bardziej zmniejszy szum elektryczny.
  3. Mikromanipulatory hydrauliczne (Siskiyou) dodatkowo redukują hałas. W naszej konfiguracji używamy praworęcznego manipulatora do zapisu całej komórki, a leworęcznego do amperometrii.

2. Przygotuj elektrody do nagrania

  1. Wyciągnij elektrody krosowe za pomocą pipet kwarcowych na ściągaczu P-2000 (Sutter). Nasze ciągnięcie trwa około 5 sekund, z dwoma cyklami grzewczymi. Ten czas nagrzewania zaowocował stałą rezystancją (3-4 MΩ) w naszych pipetach z plastrami do całych komórek.
  2. Napełnij elektrodę roztworem pipety zawierającym 2 mM dopaminy i zamontuj ją na prawym manipulatorze. Owinąć pojemnik z roztworem pipety zawierającym DA folią aluminiową. Trzymaj na lodzie. Dopamina ulega utlenieniu. Trzymanie roztworu na lodzie, chronionego przed światłem, zmniejszy szybkość utleniania dopaminy.
  3. Delikatnie wyjmij elektrodę amperometryczną z włókna węglowego ProCFE (Dagan) o niskim poziomie hałasu z pudełka do przechowywania, napełnij rtęcią, zamontuj na adapterze amperometrycznym (jak pokazano na rysunku 1), a następnie zamontuj na prawym manipulatorze. Chroń końcówkę włókna węglowego przed uszkodzeniem, przytrzymując drugi koniec włókna węglowego. Sprawdź elektrodę za pomocą mikroskopu laboratoryjnego, aby upewnić się, że końcówka jest czysta i nienaruszona.
  4. Zbadać integralność elektrody amperometrycznej, umieszczając elektrodę na płytce Petriego ze szklanym dnem zawierającej roztwór zewnętrzny. Zapisz prąd bazowy przy braku dopaminy. Do naczynia dodać 10 μl 1mM roztworu DA. Dobra elektroda amperometryczna rejestruje wzrost prądu utleniającego. Powtórz ten krok na początku i na końcu każdego eksperymentu, aby upewnić się, że elektroda amperometryczna działa prawidłowo.

3. Przygotuj pierwotną hodowlę neuronów dopaminowych lub komórek zaprojektowanych do wyrażania transportera dopaminy na szklanych płytkach Petriego

  1. Delikatnie umyj komórki lub neurony dopaminowe trzy razy ciepłym roztworem zewnętrznym.
  2. Zamontuj szalkę Petriego ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu.

4. Wizualizacja komórki i przeprowadzenie eksperymentu

  1. Znajdź właściwy punkt ogniskowy, aby wyraźnie zwizualizować komórki. Umieść nadciśnienie na elektrodzie plastrowej. Następnie delikatnie zanurz obie elektrody w roztworze i zbliż je do ogniwa.
  2. Umieść elektrodę amperometryczną obok ogniwa (po lewej stronie), a elektrodę krosową po prawej stronie.
  3. Uzyskaj gigaomową uszczelkę na ogniwie za pomocą elektrody krosowej. Rozerwij uszczelkę za pomocą ssania, aby uzyskać konfigurację całego ogniwa.
  4. Odczekaj 5-8 minut na dializę wewnętrznego roztworu zawierającego dopaminę do komórki.
  5. Użyj żądanego kroku napięcia lub protokołu rampy. Jednocześnie należy zbierać dane zarówno z pipety plastrowej, jak i elektrody amperometrycznej, aby zmierzyć prądy całych ogniw i odwrócić transport dopaminy przez transporter dopaminy, podczas gdy potencjał błonowy jest kontrolowany przez pipetę z plastrem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombinowany zacisk krosowy z amperometrią może mierzyć zależny od napięcia wypływ DAT za pośrednictwem DAT. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywną konfigurację eksperymentalną i zapis wypływu DA za pośrednictwem DAT, gdy środowisko wewnątrzkomórkowe i potencjał błonowy są zaciskane przez pipetę z łatą na całe komórki. Korzystając z tej techniki, komórki wykazujące ekspresję białek YFP-DAT są zaciskane napięciowo za pomocą pipety z całym plastrem komórkowym, podczas gdy elektroda amperometryczna jest umie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoczesne stosowanie cęgów napięciowych i amperometrii ma następujące zalety. Wszystkie typy komórek są dostępne i mogą być używane do nagrywania. Identyfikacja komórek lub neuronów, w których wykonywane są nagrania, jest prosta i nieskomplikowana. W szczególności, jeśli komórka jest znakowana fluorescencyjnie poprzez dodanie znacznika fluorescencyjnego do białka będącego przedmiotem zainteresowania, eksperymentator może łatwo wybrać komórkę docelową lub neuron. Konfiguracja eksperymentalna pozwala na równomierne i kon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Sanice Chirwa za krytyczną recenzję tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (DA026947, DA021471 i NS071122).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Stół antywibracyjny z klatką FaradayaManufacturing CorporationSeria 63-500używamy modelu 63-543
Mikroskop odwrócony Nikon TE-2000Nikonwycofanyz produkcji Eclipse Ti
Dwa wzmacniacze o niskim poziomie szumów axopatch 200bUrządzenia800-635-5577
1-CV 203 BU headstageUrządzenia molekularne800-635-5578
Uchwyt do pipet 1-HL-UUrządzenia molekularne800-635-5579
Przetwornik analogowo-cyfrowy Digidata 1440AUrządzenia800-635-5580
Dwa manipulatory Siskyou, leworęczny i praworęcznySiskiyouMX6600R MX6600L877-313-6418
Laserowy ściągacz do pipetSutter InstrumentsP-2000888-883-0128
Elektroda amperometryczna z włókna węglowego o niskim poziomie hałasuProCFEa href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com
Pipeta kwarcowa o niskim poziomie hałasuSutter InstrumentsQF100-70-7.5888-883-0128
Akumulatorszeroko dostępny
Ładowarkasamochodowapowszechnie dostępne
Odczynnik
Chlorek sodu (NaCl)SigmaS7653
HEPESSigmaH3375
DekstrozaSigmaG7528
Siarczan magnezu (MgSO4)SigmaM2643
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)SigmaP5655
Chlorek potasu (KCl)SigmaP9333
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2∙ 2H20)Sigma223506
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2∙ 6H20)SigmaM2670
EGTASigmaE0396
Technical molekularne molekularne < samochodowy 12 V

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
  3. Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
  4. Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
  5. Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
  6. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
  7. Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
  8. Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
  9. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
  10. Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382(2010).
  11. Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Amperometria z blokad napi ciatransporter dopaminytransport wstecznypatch clamp ca ej kom rkielektroda z w kna w glowegopr d zale ny od DATjednoczesny pomiarkontrola potencja u b onowegopomiar pr du utleniania

Powiązane artykuły