Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Podsumowanie

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Streszczenie

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) są pluripotencjalne i stanowią nieocenione źródło komórkowe dla modelowania chorób in vitro oraz medycyny regeneracyjnej¹. Wykazano wcześniej, że ludzkie komórki somatyczne mogą zostać przeprogramowane do stanu pluripotencjalności poprzez ektopową ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych (Oct4, Sox2, Klf4 oraz Myc), stając się indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (iPSCs)^2-4. Podobnie jak hESCs, ludzkie iPSCs są pluripotencjalne i stanowią potencjalne źródło komórek autologicznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół przeprogramowania ludzkich fibroblastów przy użyciu czterech czynników przeprogramowania sklonowanych do retrowirusowego szkieletu zawierającego GFP⁴. Stosując poniższy protokół, generujemy ludzkie iPSCs w ciągu 3-4 tygodni w warunkach hodowli ludzkich ESC. Kolonie ludzkich iPSCs ściśle przypominają hESCs pod względem morfologicznym i wykazują utratę fluorescencji GFP w wyniku wyciszenia transgenu retrowirusowego. Kolonie iPSC izolowane mechanicznie pod mikroskopem fluorescencyjnym zachowują się w sposób podobny do hESCs. W komórkach tych wykrywamy ekspresję wielu genów pluripotencjalności oraz markerów powierzchniowych.

Protokół

1. Reprogramowanie za pomocą retrowirusa wykazującego ekspresję czynników reprogramujących

1. Ludzkie fibroblasty hoduje się w pożywce do fibroblastów (10% FBS w DMEM z Pen/Strep).
2. Na dzień przed infekcją wysiać 1x10⁵ ludzkich fibroblastów do jednego dołka płytki 6-dołkowej.
3. Odssać pożywkę, aby usunąć martwe komórki, i dodać 2 ml świeżej pożywki do fibroblastów. Dodać siarczan protaminy do końcowego stężenia 5 μg/ml.
4. Ostrożnie dodać odpowiednią ilość każdego wirusa wykazującego ekspresję GFP, odpowiadającą wielokrotności infekcji (MOI) 5⁵.
5. Na dzień po infekcji usunąć nadsącz wirusowy, trzykrotnie przemyć 2 ml PBS, a następnie dodać 2 ml pożywki do fibroblastów.
6. Trzy dni po infekcji sprawdzić fluorescencję GFP i uzupełnić dołek 2 ml pożywki do fibroblastów.
7. Cztery dni po infekcji wysiać 1x10⁴ /cm² naświetlanych komórek zasilających z embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) w pożywce do fibroblastów na 10-cm szalkę Petriego powleczoną 0,1% żelatyną. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
8. Pięć dni po infekcji odczepić zainfekowane ludzkie fibroblasty za pomocą 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wirować przez 5 minut przy 200 g. Odssać pożywkę i resuspendować komórki w 10 ml pożywki do fibroblastów. Przenieść komórki na uprzednio powleczoną płytkę 10-cm.
9. Po 24 godzinach wymienić pożywkę na pożywkę do hodowli hESC (20% Knock-Out serum replacement, DMEM/F12, 0,1 ml nieistotnych aminokwasów, 4 ng/ml bFGF, Pen/Strep/Glutamate, beta-merkaptoetanol). Wymieniać pożywkę codziennie. Kolonie przypominające ESC zaczną pojawiać się między 20. a 27. dniem po infekcji.

2. Izolacja i ekspansja iPSC

1. Pod mikroskopem fluorescencyjnym sprawdź brak fluorescencji GFP w kolonii wykazującej morfologię podobną do hESC.
2. Za pomocą pipety 10 μl wybierz poszczególne kolonie iPSC i przenieś je do jednego dołka płytki 12-dołkowej powlekanej żelatyną i MEF, uzupełnionej o pożywkę dla hESC. Wymieniaj pożywkę codziennie.
3. W celu pasażowania przemyj płytkę 1 ml DMEM/F12, następnie dodaj 0,5 ml kolagenazy i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
4. Przemyj komórki dwukrotnie za pomocą DMEM/F12.
5. Dodaj 2 ml świeżej pożywki dla hESC. Używając cell liftera, rozbij kolonie na małe fragmenty i odklej pozostałe komórki od płytki.
6. Przenieś resuspendowane fragmenty kolonii do jednego dołka płytki 6-dołkowej powlekanej żelatyną i MEF.

3. Analiza immunofluorescencyjna markerów pluripotencyjnych

1. Komórki przemyć trzy razy PBS i utrwalić 4% paraformaldehydem przez 20 min w temperaturze pokojowej.
2. Komórki delikatnie przemyć trzy razy PBS i poddać permeabilizacji 0,2% Tritonem X-100 w PBS przez 30 min.
3. Zablokować niespecyficzne wiązanie, inkubując komórki w 3% BSA w PBS przez dwie godziny.
4. Komórki inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Komórki przemyć trzy razy PBS i inkubować z odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
6. Komórki przemyć trzy razy PBS, dodając DAPI podczas ostatniego płukania, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
7. Barwienie wykryć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

4. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym dla markerów pluripotencji

1. Wyizolować całkowite RNA z ludzkich iPSC pochodzących z ludzkich fibroblastów, używając zestawu RNeasy firmy Qiagen.
2. Zsyntetyzować pierwszą nić cDNA, wykorzystując odwrotną transkryptazę SuperScript II.
3. Przeprowadzić qPCR w celu wykrycia genów pluripotencji, używając wcześniej opisanych starterów.⁶

5. Reprezentatywne wyniki

1. Zmiany morfologiczne podczas przeprogramowania
   Zainfekowaliśmy ludzkie fibroblasty BJ1 oraz Detroit 551 koktajlem retrowirusów niosących OCT4, SOX2, KLF4 i MYC, co pozwoliło nam wykryć zmiany morfologiczne podczas przeprogramowania (Rycina 1). Dwadzieścia jeden dni po infekcji zidentyfikowaliśmy małe kolonie iPSC po ich morfologii przypominającej hESC. Ponadto iPSC rozpoznano dzięki fluorescencji GFP. Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak ESC i iPSC, wykazują aktywność mechanizmów molekularnych tłumiących ekspresję genów prowirusowych^7-9. Nasz unikalny wektor retrowirusowy wykazuje ekspresję GFP wraz z genami przeprogramowania za pomocą LTR retrowirusowego. W związku z tym komórki stale wykazujące fluorescencję GFP są uznawane za komórki wykazujące ekspresję transgenów bez wyciszenia genów prowirusowych. Prawidłowo przeprogramowane kolonie iPSC, które nabyły molekularną sieć pluripotencji, wykazują brak ekspresji GFP (Rycina 2)¹⁰.
   
2. Charakterystyka pluripotencji ludzkich iPSC
   Przeanalizowaliśmy kolonie pochodzące z fibroblastów Detroit-551 za pomocą immunohistochemii z przeciwciałami przeciwko Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 i NANOG (Tabela 2). Skutecznie przeprogramowane iPSC wykazują ekspresję wszystkich tych markerów (Rycina 3A). Przeanalizowaliśmy również ekspresję genów za pomocą ilościowej analizy RT-PCR. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja OCT4, SOX2, KLF4, MYC i NANOG była znacznie zwiększona w porównaniu z rodzicielskimi komórkami fibroblastów, lecz była porównywalna z ekspresją w ludzkich hESC H9 (Rycina 3B).

Rycina 1. Zmiany morfologiczne fibroblastów ludzkich zainfekowanych retrowirusem. (A-D) Postępująca zmiana morfologiczna w koloniach fibroblastów Detroit-551 zainfekowanych czynnikami reprogramującymi. Dzień 5 (A), Dzień 10 (B), Dzień 14 (C), dzień 21 (D). Po 21 dniach komórki wykazują morfologię przypominającą hESC.

Rysunek 2. Reprezentatywna ekspresja fluorescencyjna GFP w komórkach poddawanych reprogramowaniu. Fibroblasty BJ i Detroit 551 zainfekowano retrowirusem wykazującym cztery czynniki reprogramujące⁴ i inkubowano w medium hESC przez cztery tygodnie. Fibroblasty BJ (A, B) i Detroit 551 (C, D) wykazują podobną morfologię. Od 21. dnia zaczynają tworzyć się kolonie ujemne dla GFP, które reprezentują autentyczne iPSCs¹⁰. (E, F) przedstawiają przekształcone komórki Detroit 551, które nie przeszły prawidłowego reprogramowania. (A, C, E) kolonie w obrazie kontrastowym. (B, D) prawidłowo reprogramowane komórki wykazujące wyciszenie GFP. (F) silna ekspresja GFP w przekształconej kolonii.

Rycina 3. Charakterystyka ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. (A) Kolonie ludzkich komórek 551-iPS-K1 wykazują ekspresję markerów typowych dla komórek pluripotencjalnych. Barwienie DAPI wskazuje całkowitą liczbę komórek w polu. (B) Ilościwa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) dla ekspresji OCT4, SOX2, KLF4, MYC w fibroblastach rodzicielskich, iPSC 551-iPS-K1 oraz ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) H9. Dane znormalizowano względem genu referencyjnego β-actin i przedstawiono w stosunku do poziomu ekspresji w fibroblastach rodzicielskich⁴.

Dyskusja

Ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych przeprogramowuje ludzkie fibroblasty do iPSCs. Podjęto wiele prób generowania ludzkich iPSCs z wykorzystaniem podejść nieintegrujących lub niegenetycznych w celu uzyskania klinicznie bezpiecznych iPSCs. Do tej pory metody te wykazują niezwykle niską wydajność i wymagają dalszej optymalizacji w celu poprawy powtarzalności^11-14. Metody retrowirusowe lub lentiwirusowe są powszechnie stosowane do uzyskiwania i wykorzystywania iPSCs w ludzkich modelach chorób in vit...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Zamiennik surowicy Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-glutamina (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Niezbędne aminokwasy (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-merkapto–etanol (14,3 M) lub MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicylina/streptomycyna	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicylina/streptomycyna	EMD Millipore	15140-122	1%
Tabela 1. Pożywka hodowlana
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Fluor 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Kolagenaza typu IV	Invitrogen	17104019	1 mg/ml
Żelatyna wieprzowa	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
Komórki zasilające MEF	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Mikroskopia fluorescencyjna: mikroskop odwrócony z filtrem GFP
Tabela 2. Odczynniki i sprzęt