$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przeprogramowanie przez Retrowirus Wyrażający Czynniki Przeprogramowania
- Ludzkie fibroblasty są hodowane w pożywce fibroblastów (10% FBS w DMEM z Pen/Strep).
- Na dzień przed zakażeniem umieść 1x105 ludzkich fibroblastów w jednym dołku 6-dołkowej płytki.
- Odessać pożywkę, aby usunąć martwe komórki i dodać 2 ml świeżej pożywki z fibroblastów. Dodać siarczan protaminy w końcowym stężeniu 5 μg/ml.
- Ostrożnie dodać odpowiednią ilość każdego wirusa wykazującego ekspresję GFP, odpowiadającą wielości infekcji (MOI) 5,5.
- Dzień po zakażeniu usunąć supernatant wirusa, przemyć trzykrotnie 2 ml PBS, a następnie dodać 2 ml pożywki fibroblastowej.
- Trzy dni po zakażeniu sprawdź fluorescencję GFP i uzupełnij studzienkę 2 ml pożywki fibroblastowej.
- Cztery dni po zakażeniu połóż na płytce 1x104 /cm2 napromieniowanych komórek fibroblastów embrionalnych myszy (MEF) w pożywce fibroblastów na 10-centymetrowej szalce Petriego pokrytej 0,1% żelatyną. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
- Pięć dni po zakażeniu odłączyć zakażone ludzkie fibroblasty za pomocą 1 ml 0,05% typsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C i wirować przez 5 minut w temperaturze 200 g. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki 10 ml pożywki fibroblastowej. Przenieś komórki na wstępnie pokrytą 10-centymetrową płytkę.
- Po 24 godzinach zastąp pożywkę pożywką hodowlaną hESC (20% wymiana surowicy Knock-Out, DMEM/F12, 0,1 ml aminokwasów endogennych, 4 ng/ml bFGF, Pen/Strep/Glutaminian, beta-merceptoetanol). Zmieniaj medium codziennie. Kolonie podobne do ESC zaczną pojawiać się w 20-27 dniu po zakażeniu.
2. Izolacja i ekspansja iPSC
- Pod mikroskopem fluorescencyjnym sprawdź, czy nie ma fluorescencji GFP w kolonii, która wykazuje podobną morfologię do hESC.
- Za pomocą pipety o pojemności 10 μl pobrać pojedyncze kolonie iPSC i umieścić je w jednym dołku 12-dołkowej płytki pokrytej żelatyną i MEF, a następnie uzupełnionej pożywką z hESC. Zmieniaj medium codziennie.
- W celu pasażowania przemyć płytkę 1 ml DMEM/F12, następnie dodać 0,5 ml kolagenazy i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Umyj komórki dwukrotnie za pomocą DMEM/F12.
- Dodać 2 ml świeżej pożywki z ludzkimi aktywami biosyjnymi. Za pomocą podnośnika komórkowego rozbij kolonie na małe kawałki i oderwij pozostałe komórki od płytki.
- Przenieść zawieszone kawałki kolonii do jednego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej żelatyną i MEF.
3. Analiza immunofluorescencyjna markerów pluripotencjalnych
- Umyj komórki trzykrotnie PBS i utrwal 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie PBS i przepuszczać 0,2% Triton X-100 w PBS przez 30 minut.
- Zablokuj niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację komórek z 3% BSA w PBS przez dwie godziny.
- Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj komórki trzykrotnie PBS i inkubuj komórki ze specyficznym przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w temperaturze pokojowej, osłaniając je przed światłem.
- Umyj komórki trzykrotnie PBS i dodaj DAPI podczas ostatniego płukania, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Wykryj zabarwienie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
4. Ilościowy test PCR w czasie rzeczywistym dla markerów pluripotencjalnych
- Wyizoluj całkowite RNA z ludzkich iPSC pochodzących z ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu RNeasy firmy Qiagen.
- Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy SuperScript II.
- Wykonaj qPCR, aby wykryć geny pluripotencji przy użyciu wcześniej opisanych starterów. 6
5. Reprezentatywne wyniki
- Zmiana morfologiczna podczas przeprogramowywania
Zainfekowaliśmy ludzkie fibroblasty BJ1 i Detroit 551 koktajlem retrowirusów przenoszących OCT4, SOX2, KLF4 i MYC i byliśmy w stanie wykryć zmiany morfologiczne podczas przeprogramowania (Figura 1). Dwadzieścia jeden dni po zakażeniu rozpoznajemy małe kolonie iPSC po ich morfologii podobnej do hESC. Ponadto iPSC rozpoznajemy na podstawie fluorescencji GFP. Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak ESC i iPSC, wyrażają maszynerię molekularną do tłumienia ekspresji genów prowirusowych7-9. Nasz unikalny wektor retrowirusowy wykazuje ekspresję GFP wraz z przeprogramowaniem genów przez retrowirusowy LTR. W związku z tym uważa się, że komórki wykazujące ciągłą ekspresję GFP wykazują ekspresję transgenów bez wyciszania genów prowirusowych. Wiernie przeprogramowane kolonie iPSC, które nabywają sieć molekularną pluripotencji, wykazują brak ekspresji GFP (Figura 2)10,
- Charakterystyka pluripotencji ludzkich iPSC
Przeanalizowaliśmy kolonie pochodzące z fibroblastów Detroit-551 za pomocą immunohistochemii z przeciwciałami Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 i NANOG (Tabela 2). Pomyślnie przeprogramowane iPSC wyrażają wszystkie te markery (rysunek 3A). Przeanalizowaliśmy również ekspresję genów za pomocą ilościowej analizy RT-PCR. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja OCT4, SOX2, KLF4, MYC i NANOG była znacznie zwiększona w porównaniu z macierzystymi komórkami fibroblastów, ale proporcjonalna do ekspresji hESC H9 (Figura 3B).
Rysunek 1. Zmiany morfologiczne ludzkich fibroblastów zakażonych retrowirusem. (A-D) Postępująca zmiana morfologiczna w koloniach z fibroblastów Detroit-551 zakażonych czynnikami przeprogramowującymi. Dzień 5 (A), Dzień 10 (B), Dzień 14 (C), dzień 21 (D). Komórki wykazują morfologię podobną do hESC po 21 dniach.
Rysunek 2. Reprezentatywna ekspresja fluorescencyjna GFP w komórkach poddawanych przeprogramowaniu. Fibroblasty BJ i Detroit 551 zostały zakażone retrowirusem eksprymującym cztery czynniki przeprogramowujące4 i inkubowane w pożywce hESC przez cztery tygodnie. Fibroblasty BJ (A, B) i Detroit 551 (C, D) wykazują podobne morfologię. Od 21 dnia zaczynają tworzyć się kolonie GFP ujemne, które reprezentują iPSC w dobrej wierze10. (E, F) pokazują przekształcone ogniwa Detroit 551, które nie zostały poddane odpowiedniemu przeprogramowaniu. (A, C, E) kolonie w widoku kontrastu fazowego. (B, D) prawidłowo przeprogramowane ogniwa, które wykazują wyciszenie GFP. (F) jasna ekspresja GFP z przekształconej kolonii.
Rysunek 3. Charakterystyka ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. (A) Ludzkie kolonie komórek 551-iPS-K1 wyrażają markery wspólne dla komórek pluripotencjalnych. Barwienie DAPI wskazuje całkowitą zawartość komórek w polu. (B) Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) do ekspresji OCT4, SOX2, KLF4, MYC w macierzystych fibroblastach, 551-iPS-K1 iPSC i ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC). Dane znormalizowano w stosunku do genu porządkowego β-aktyny i wykreślono w odniesieniu do poziomu ekspresji w macierzystych komórkach fibroblastów4.