Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Podsumowanie

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Streszczenie

Powszechny, obligatoryjny wewnątrzkomórkowy pierwotniak pasożytniczy Toxoplasma gondii wywołuje choroby oportunistyczne u pacjentów z niedoborami odporności oraz wady wrodzone w przypadku zakażenia prenatalnego. Lityczny cykl replikacyjny charakteryzuje się trzema etapami: 1. aktywną inwazją do jądrowej komórki gospodarza; 2. replikacją wewnątrz komórki gospodarza; 3. aktywnym opuszczeniem (egresem) komórki gospodarza. Mechanizm egresu jest coraz częściej postrzegany jako unikalny, ściśle regulowany proces, który wciąż pozostaje słabo poznany na poziomie molekularnym. Szlaki sygnalizacyjne leżące u podstaw egresu zostały scharakteryzowane przy użyciu czynników farmakologicznych oddziałujących na różne aspekty tych szlaków^1-5. W ten sposób zidentyfikowano kilka niezależnych wyzwalaczy egresu, które wszystkie zbiegają się w uwalnianiu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺, sygnału, który jest również krytyczny dla inwazji do komórki gospodarza^6-8. Ta wiedza posłużyła do zastosowania podejścia opartego na genach kandydackich, co doprowadziło do identyfikacji przypominającej roślinne kinazy białkowe zależne od wapnia (CDPK) biorących udział w egresie⁹. Ponadto, dzięki zastosowaniu podejść genetycznych (chemicznych), dokonano w ostatnim czasie kilku przełomów w rozumieniu procesu egresu^10-12. Aby połączyć bogactwo informacji farmakologicznych ze zwiększoną dostępnością genetyczną Toxoplasma, opracowaliśmy niedawno screening umożliwiający wzbogacenie populacji mutantów pasożyta z defektem egresu z komórki gospodarza¹³. Chociaż mutageneza chemiczna z użyciem N-etyl-N-nitrozomocznika (ENU) lub etylo-metanosulfonianu (EMS) była stosowana od dziesięcioleci w badaniach nad biologią Toxoplasma^11,14,15, dopiero niedawno mapowanie genetyczne mutacji leżących u podstaw fenotypów stało się rutynowe^16-18. Co więcej, poprzez generowanie mutantów temperaturozależnych, możliwe jest przeanalizowanie procesów niezbędnych i bezpośrednia identyfikacja leżących u ich podstaw genów. Mutanty te zachowują się jak typ dziki w temperaturze dopuszczalnej (35 °C), ale nie namnażają się w temperaturze restrykcyjnej (40 °C) w wyniku rozważanej mutacji. Tutaj prezentujemy nową metodę screeningu fenotypowego służącą do izolacji mutantów z temperaturozależnym fenotypem egresu¹³. Wyzwaniem w screeningach egresu jest oddzielenie pasożytów, które opuściły komórkę, od tych, które pozostały wewnątrz, co jest utrudnione przez szybką reinwazję oraz ogólną lepkość pasożytów w kontakcie z komórkami gospodarza. Wcześniej opracowany screening egresu opierał się na uciążliwej serii etapów biotynylacji w celu oddzielenia pasożytów wewnątrzkomórkowych od zewnątrzkomórkowych¹¹. Metoda ta nie generowała również mutantów warunkowych, co skutkowało słabymi fenotypami. Metoda opisana w niniejszej pracy pokonuje problem silnego przywierania pasożytów podczas egresu poprzez zastosowanie konkurenta glikanowego, siarczanu dekstranu (DS), który zapobiega przywieraniu pasożytów do komórki gospodarza¹⁹. Ponadto, pasożyty zewnątrzkomórkowe są specyficznie eliminowane przez ditiokarbaminian pirrolidyny (PDTC), który nie uszkadza pasożytów wewnątrzkomórkowych²⁰. Zatem, dzięki nowemu screeningowi fenotypowemu do specyficznej izolacji mutantów pasożyta z defektami indukowanego egresu, potencjał genetyki może zostać teraz w pełni wykorzystany do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw opuszczania komórki gospodarza.

Protokół

Przegląd

Przedstawione protokoły służą najpierw do określenia dawki mutagenu prowadzącej do 70% śmiertelności pasożytów (protokół 1). Kolejna procedura ma na celu wzbogacenie puli pasożytów poddanych mutagenezie o indukowane mutanty z zaburzeniem procesu egressu (protokół 2, Rycina 2). Następnie opisano protokół służący do sprawdzenia częstości występowania mutantów egressu w wzbogaconej puli lub do walidacji fenotypu egressu u poszczególnych mutantów (protokół 3). Na koniec przedstawiono protokół generowania pojedynczych klonów pasożytów z wzbogaconych populacji za pomocą rozcieńczeń ograniczających (protokół 4).

1. Miareczkowanie mutagenu

Należy zachować szczególną ostrożność, na przykład stosując podwójne rękawiczki, podczas pracy z silnie mutagennymi związkami i cieczami. Odpady płynne należy zbierać oddzielnie w celu ich prawidłowej utylizacji.

1. Zaszczep kolby do hodowli tkankowej T25 z konfluencją fibroblastów napletka ludzkiego (HFF) 1 ml świeżo lizowanych tachyzoitów i inkubuj przez 18-25 hr w 37 °C przy 5% CO₂ w pożywce Ed1 (D-MEM uzupełnionej o 1% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 0,2 mM L-glutaminy, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml Amphotericin B). Ogólne warunki wzrostu i skład pożywek dla komórek HFF oraz pasożytów opisano u Roos et al.²¹
2. Wymień pożywkę na 10 ml pożywki z 0,1% płodową surowicą bydlęcą (rozcieńcz Ed1 1:10 w D-MEM) i pozostaw w humidyfikowanym inkubatorze w 37 °C przy 5% CO₂ (zwanym dalej „inkubatorem 37 °C”) na 10 min.
3. Dodaj 0, 12,5, 25, 50 lub 100 μl ENU (stok 1 M w DMSO) lub EMS (stok 1 M w DMSO) na każdą kolbę (robocze rozcieńczenia mutagenu wyniosą odpowiednio 1,25, 2,5, 5 i 10 mM). Uzupełnij DMSO do objętości 100 μl w każdej kolbie. Inkubuj przez 4 hrs w inkubatorze 37 °C.
4. Przemyj trzy razy przez 10 sekund w temperaturze pokojowej, płucząc monowarstwę 10 ml zimnego PBS (schłodzonego wcześniej do 4 °C).
5. Dodaj 5 ml PBS, oddziel monowarstwę za pomocą gumowego scrapera (zeskrobacza do komórek), przepuść zeskrobione komórki przez igłę 26,5 G, aby fizycznie usunąć pasożyty z fibroblastów (odetnij trzon poza igłą za pomocą mocnych nożyczek, aby nie odsłonić igły) i przefiltruj przez filtr poliwęglanowy 3,0 μm. Wielokrotne przepuszczanie przez igłę zwiększy wydajność uwalniania pasożytów z komórki gospodarza.
6. Oznacz stężenie pasożytów za pomocą hemocytometru. Przed odczytem pozwól pasożytom osiąść w hemocytometrze przez 5 min.
7. Rozcieńcz pasożyty do stężenia 10 000 pasożytów na 3 ml w pożywce Ed1 (dla 10 ml wymagane jest 33 333 pasożytów).
8. Zaszczep jedno dołku na płytce 6-dołkowej 3 ml rozcieńczonych pasożytów (zawierających 10 000 pasożytów). Wykonaj 10-krotne rozcieńczenia seryjne pasożytów w trzech dołkach płytki 6-dołkowej z konfluencją komórek HFF zawierających 2,7 ml Ed1, przenosząc 300 μl z pierwszego dołka. Pozostaw płytki w inkubatorze 37 °C na 7 dni.
9. Odsącz pożywkę, utrwal przez 15 min za pomocą 3 ml/dołek 100% etanolu, zabarw 3 ml/dołek roztworem fioletu krystalicznego (12,5 g fioletu krystalicznego w 125 ml etanolu zmieszanego z 500 ml 1% szczawianu amonu) przez 15 min, wypłucz 3 ml/dołek PBS (1 minuta) i wysusz na powietrzu. Wszystkie czynności wykonaj w temperaturze pokojowej.
10. Policz plaki i wybierz stężenie mutagenu niezbędne do uzyskania przeżywalności 30% eksponowanych pasożytów (dawka powodująca 70% śmiertelności: patrz Rysunek 1). Dawka powodująca 70% śmiertelności była stosowana historycznie¹⁴ i indukowała mniej niż 100 mutacji punktowych na genom (Farrell, Marth, Gubbels et al., manuskrypt przesłany do publikacji).

2. Wzbogacanie mutantów wyjścia (Rycina 2)

1. Przeprowadzić mutagenezę zgodnie z powyższym opisem, stosując dawkę mutagenu indukującą 70% śmiertelności. Namnożyć zmutowaną populację przez jeden pasaż w nowej kolbie z komórkami gospodarza.
2. Zainfekować konfluencyjną kulturę tkankową w kolbie T25 z komórkami HFF za pomocą 120 000 świeżo lizowanych pasożytów z zmutowanej populacji w 10 ml Ed1. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze 35 °C w atmosferze 5% CO₂ i wysokiej wilgotności (dalej nazywanym „inkubator 35 °C”).
3. Odssać medium i płukać przez 10 sekund 10 ml zimnego PBS, a następnie dodać 10 ml medium Ed1 uzupełnionego o 25 mg/ml siarczanu dekstranu (DS)¹³. Inkubować przez 26 godzin w inkubatorze 40 °C w atmosferze 5% CO₂ i wysokiej wilgotności (dalej nazywanym „inkubator 40 °C”).
4. Przygotować roztwór roboczy wzmacniaczy egressu. Rozcieńczyć wybrany induktor egressu do stężenia roboczego w probówce Falcon 15 ml zawierającej 10 ml HBSSc uzupełnionego o 25 mg/ml DS. Podgrzać rozcieńczenia przez 30 min w kąpieli wodnej 37 °C. Stężenia robocze znajdują się w Tabeli 1.
5. Odssać medium z kolb zainfekowanych pasożytami i dodać podgrzany roztwór induktora egressu. Inkubować w inkubatorze 37 °C przez czasy wskazane w Tabeli 1.
6. Odssać medium i płukać przez 10 sekund 10 ml zimnego PBS, a następnie dodać 10 ml Ed1 uzupełnionego o 25 mg/ml DS i 50 μM ditiokarbaminianu pirrolidyny (PDTC: dodać 5 μl stoku PDTC 100 mM w PBS)¹³. Inkubować przez 5 godzin w inkubatorze 35 °C.
7. Odssać medium i wypłukać raz przez 10 sekund 10 ml PBS (temperatura pokojowa), a następnie dodać 10 ml medium Ed1. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze 35 °C aż do momentu zniszczenia monowarstwy przez pasożyty: wstrząsać kolbami codziennie. Rekuperacja ta trwa około 7 dni.

3. Walidacja fenotypów mutantów za pomocą testów egressu

Po przeprowadzeniu przesiewu wzbogacającego i namnożeniu wzbogaconej populacji przez jeden pasaż w komórkach HFF, fenotypy muszą zostać potwierdzone za pomocą testu wyjścia (egress assay) ^11,13. Test ten powinien zostać również wykorzystany do walidacji pojedynczych klonów po wykonaniu protokołu 4.

1. Zaszczepić 20 000 pasożytów na dołek w płytce 24-dołkowej zawierającej konfluentne komórki HFF hodowane na szkiełkach podstawowych (1 ml medium Ed1 na dołek). Inkubować przez 8 h w inkubatorze w temperaturze 35 °C, a następnie przenieść do inkubatora w temperaturze 40 °C na 24 h.
2. Przemyć 1 ml/dołek PBS (10 sekund w temperaturze pokojowej). Dodać 1 ml induktorów wyjścia (w tym ujemną kontrolę z samym DMSO), uprzednio ogrzanych i rozcieńczonych w HBSSc, a następnie inkubować przez czasy opisane w Tabeli 1.
3. Odssać medium i utrwalić 1 ml/dołek 100% metanolu przez 15 min w temperaturze pokojowej.
4. Jeśli do mutogenezy użyto pasożytów rodzicielskich wykazujących autofluorescencję białka, przejść do kroku nr 3.5¹³. Jeśli jako linia rodzicielska użyta została linia pasożytów niewykazująca fluorescencji białka, utrwalone szkiełka podstawowe zabarwić barwnikiem Diff-Quick przez 1 min w temperaturze pokojowej¹¹.
5. Przemyć przez 5 min 1 ml/dołek PBS w płytce 24-dołkowej w temperaturze pokojowej.
6. W przypadku pasożytów wykazujących fluorescencję białka: szybko opłukać szkiełko podstawowe w ddH₂O (poprzez zanurzenie) i zamontować na szkiełkach w medium gelmount, aby chronić sygnał fluorescencji. W przypadku pasożytów zabarwionych Diff-Quick, przemyć przez 10 sekund w 100% etanolu i pozostawić do wyschnięcia przed zamontowaniem na szkiełku.
7. Używając mikroskopu (fluorescencyjnego) z obiektywem 40-60x, obliczyć procent wakuol, z których nastąpiło wyjście, w stosunku do wakuol, które pozostały wewnątrzkomórkowo (patrz Rycina 4).

4. Klonowanie mutantów wyjścia metodą rozcieńczeń ograniczających

Po walidacji fenotypu wzbogaconej populacji mutantów wyjścia (egress) zgodnie z protokołem 3, populację poliklonalną należy poddać klonowaniu w celu uzyskania pojedynczych klonów pasożytów.

1. Policzyć populację pasożytów w komorze licznikowej i rozcieńczyć do stężenia 500 pasożytów na ml w medium Ed1.
2. W płytce 384-dołkowej zawierającej konfluencyjną monowarstwę komórek HFF, wymienić medium na 40 μl/dołek medium Ed1 przy użyciu pipety wielokanałowej. Jak pokazano na Rysunku 5, na jednej płytce można sklonować cztery populacje poliklonalne w następujący sposób: nanieść 40 μl/dołek rozcieńczonego mutanta 1 do dołków C3-C12, mutanta 2 do dołków C13-C22, mutanta 3 do dołków H3-H12 oraz mutanta 4 do dołków H13-H22 (objętość końcowa w dołkach wynosi teraz 80 μl). Używając pipety wielokanałowej, pipetować roztwór w górę i w dół 5 razy, a następnie przenieść 40 μl do rzędu poniżej rzędu początkowego (z rzędu C do D lub z rzędu H do I). Kontynuować te dwukrotne rozcieńczenia seryjne aż do rzędu G (mutanty 1 i 2) lub rzędu N (mutanty 3 i 4). Odrzucić nadmiarowe 40 μl z ostatniego rzędu. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 35 °C przez 7-10 dni, nie poruszając płytką.
3. Sprawdzić dołki pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 10-20x pod kątem obecności pojedynczych placków, widocznych jako „dziury” w monowarstwie.
4. Wybrać 4 dołki na każdego mutanta z pojedynczym plackiem i przenieść pasożyty do kolby do hodowli tkankowej z konfluencyjnymi komórkami HFF i wypełnionej medium Ed1. Hodować pasożyty w inkubatorze w temperaturze 35 °C; codziennie wstrząsać kolbami, aby rozproszyć pasożyty zewnątrzkomórkowe. Zazwyczaj trwa to 7 dni.

5. Reprezentatywne wyniki

Mutageny ENU i EMS nie są stabilne podczas długotrwałego przechowywania. Dlatego krytyczne dla uzyskania powtarzalnych wyników jest testowanie mocy mutagennej zapasów. Typowe wyniki miareczkowania i krzywe przeżywalności dla obu mutagenów, ENU i EMS, przedstawiono na Rysunku 1. Zaleca się jednak przeprowadzanie testów plackowych dla każdego eksperymentu z mutagenezą, aby upewnić się, że zastosowano odpowiednią dawkę. Aby zachować różnorodność w populacji zmutowanych pasożytów, ważne jest jak najszybsze przystąpienie do przesiewu mutantów egress. Zazwyczaj wykonuje się jedno pasażowanie pasożytów do nowej kolby, aby pozwolić ocalałym osobnikom na regenerację przed rozpoczęciem przesiewu. Należy pamiętać, że spowoduje to podział mutantów. W związku z tym nie można wykluczyć, że wiele mutantów klonalnych wyizolowanych po zakończeniu całej procedury posiada dokładnie ten sam genotyp. Aby uniknąć wielokrotnej izolacji tego samego mutanta, zaleca się izolowanie tylko jednego mutanta egress na każdą mutagenezę, chyba że ich fenotypy (np. różnice w wrażliwości na induktory egress) znacznie się od siebie różnią. Z drugiej strony nie każdy przesiew kończy się izolacją mutantów o pożądanym fenotypie. W szczególności fenotyp oporny na jonofor Ca²⁺ A23187 jest rzadki i wymaga przeprowadzenia wielu eksperymentów mutagennych i przesiewowych w celu wyizolowania pojedynczego mutanta egress. Zaleca się zatem prowadzenie od 5 do 10 eksperymentów z mutagenezą i przesiewem równolegle.

Zdolność wzbogacania przesiewu przetestowano poprzez mieszanie znanego mutanta z defektem wyjścia (egress) z pasożytami typu dzikiego w różnych proporcjach. Mieszaniny te poddano przesiewowi, a następnie oceniono częstość występowania fenotypu mutantów w populacji wzbogaconej. Dzięki zastosowaniu pasożytów typu dzikiego wykazujących ekspresję cytoplazmatycznego RFP oraz linii mutantów wykazujących ekspresję cytoplazmatycznego YFP, częstotliwość występowania można było szybko ustalić za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3)¹³. Wyniki pokazują, że fenotypy mutantów można rutynowo wzbogacać do 80% czystości, zaczynając od 1 pasożyta z mutantem wyjścia na 10 000 pasożytów typu dzikiego¹³. Jednakże, gdy początkowy stosunek mutantów wyjścia do pasożytów typu dzikiego wynosi 1:100 000, wyizolowana populacja zawiera jedynie 1-2% (1:100) mutantów wyjścia. Zatem zdolność wzbogacania przesiewu wynosi 1 000 razy. Ponieważ przesiew rozpoczyna się od inokulacji 120 000 pasożytów, z których zazwyczaj 70% jest żywotnych, zazwyczaj przeprowadza się dwie rundy wzbogacania. Wyizolowane pasożyty są namnażane pomiędzy rundami wzbogacania. Procedura ta prowadzi do uzyskania 100% populacji mutantów nawet przy początkowym stosunku mutantów wyjścia do pasożytów typu dzikiego wynoszącym 1:1 000 000.

Testy wyjścia (egress assay) służące do walidacji i charakterystyki fenotypów wymagają takiej wielokrotności infekcji komórek gospodarza, która pozwala na rozróżnienie poszczególnych wakuol. Jest to szczególnie istotne podczas analizy warunków z wysokim odsetkiem wyjścia, gdy pojedyncze pasożyty są rozproszone. Jak pokazano na Rysunku 4, jeśli populacje po wyjściu nie są dobrze odseparowane, łatwo jest niedoszacować odsetka wyjścia, licząc dwie wakuole, z których nastąpiło wyjście, jako jedną wakuolę. Ponieważ wyjście i inwazja są procesami powiązanymi, a niektóre fenotypy wrażliwe na temperaturę wykazują łagodny fenotyp w niższej temperaturze, nie wszystkie mutanty będą charakteryzować się podobną wydajnością inwazji. Takie mutanty muszą zatem być inokulowane w dawkach kilkukrotnie wyższych, aby uzyskać wystarczającą gęstość wakuol dla dokładnej oceny ich fenotypu wyjścia. Ponadto niektóre induktory wyjścia nie stymulują efektywnie wyjścia z wakuol zawierających cztery lub mniej pasożyty. W związku z tym ważne jest, aby wakuole zawierały osiem lub więcej pasożytów w momencie rozpoczynania testu wyjścia. W naszym laboratorium przesiewamy mutanty wyizolowane za pomocą konkretnego wzmacniacza wyjścia przeciwko innym wzmacniaczom wyjścia. Dzięki profilowaniu ich reaktywności krzyżowej mutanty można pogrupować w różne klasy. Wreszcie nie wszystkie mutanty wyjścia będą wrażliwe na temperaturę. W szczególności mutanty wyizolowane przy użyciu induktorów wyjścia wyzwalających etapy poprzedzające uwalnianie wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ są podatne na fenotypy niewrażliwe na temperaturę. Wynika to z istnienia równoległych ścieżek, które mogą prowadzić do wyjścia, zanim sygnał zbiegnie się w momencie uwalniania wewnątrzkomórkowego Ca²⁺.

Rysunek 1. Miareczkowanie dawki mutagenów chemicznych. A. Testy plackowe wykonane na płytce 6-dołkowej z zastosowaniem różnych stężeń EMS oraz różnych liczb pasożytów na dołek, zgodnie z oznaczeniami. Białe plamki to placki pasożytów powstałe w monowarstwie HFF. B, C. Krzywe przeżywalności pasożytów po ekspozycji na różne dawki EMS (B) i ENU (C). Przeżywalność oceniano za pomocą testów plackowych. Do eksperymentów mutagennych wybrano dawkę indukującą 70% śmiertelność. Przedstawiono średnie z trzech niezależnych eksperymentów +/- odchylenie standardowe.

Rycina 2. Schematyczne przedstawienie screeningu wzbogacania mutantów wyjścia. Temperatura jest zaznaczona na osi y, natomiast postęp czasu jest reprezentowany przez oś x. Zielone pasożyty oznaczają pasożyty mutanty wyjścia, czerwone pasożyty oznaczają pasożyty typu dzikiego. Moment zmiany warunków oraz stymulacja induktorem wyjścia są wskazane u góry i zaznaczone strzałkami na niebieskiej linii odzwierciedlającej profil temperatury. Adaptowano z Eidell et al.¹³.

Rycina 3. Typowe wzbogacenie fenotypów mutantów egress. Wyniki wzbogacenia mutantów egress zmieszanych z pasożytami typu dzikiego w różnych proporcjach (oś x). Procent fenotypów mutantów egress w populacji wyhodowanej po przesiewaniu naniesiono na oś y; ocenę przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej (pasożyty mutanty egress wykazywały ekspresję cytoplazmatycznego YFP, a pasożyty typu dzikiego ekspresję cytoplazmatycznego RFP). Wyniki trzech niezależnych eksperymentów przedstawiono za pomocą czerwonych, niebieskich i zielonych punktów danych. Adaptowano z Eidell et al.¹³.

Rycina 4. Typowe wyniki testu wyjścia (egress assay). A. Strzałki wskazują cztery różne nienaruszone wakuole zawierające od 4 do 8 pasożytów. B. Strzałki wskazują cztery grupy rozproszonych pasożytów, co odzwierciedla cztery niezależne wakuole, z których doszło do wyjścia. Wyjście zostało indukowane za pomocą A23187 (B) lub DMSO jako kontroli negatywnej (A). Pasożyty wykazują ekspresję cytoplazmatycznego YFP²².

Rycina 5. Rozcieńczenia seryjne dla klonalnych linii pasożytów. Cztery populacje poliklonalne (czerwona, niebieska, żółta, zielona) są rozcieńczane seryjnie w jednej płytce 384-dołkowej z konfluencyjną warstwą komórek HFF. Rzędy C i I otrzymują 10 pasożytów na dołek i są rozcieńczane 2-krotnie (40 μl + 40 μl) aż do rzędów H i N odpowiednio. Odcień szarości wskazuje na malejącą liczbę pasożytów w dołku. Zazwyczaj pojedyncze klony znajdują się w rzędach D-F oraz J-L.

Związek	Roztwór stokowy	Stężenie robocze	μl wymagane dla T25 (10 ml)	Czas inkubacji (min)
DTT	1 M w DMSO	5 mM	50	15
etanol	190 Proof	5%	500	30
A23187	2 mM w DMSO	1 μM	5	5
nigerycyna*	2 mM w DMSO	10 μM	50	30

*nigericyny nie można stosować w badaniu przesiewowym procesu wzbogacania, ponieważ pasożyty nie przeżywają stymulacji nigericyną; należy stosować nigericynę wyłącznie podczas walidacji mutantów procesu egressu.

Tabela 1. Induktory wyjścia (egresu) wykorzystane w procedurach. Rozcieńczać w 10 ml HBBSc zawierającego 25 mg/ml DS dla przesiewu lub bez DS dla walidacji mutantów (test egresu). Wszystkie związki pochodzą z Sigma-Aldrich.

Dyskusja

Opisany protokół zapewnia wydajną metodę izolacji mutantów Toxoplasma z defektem egressu. Z sukcesem wyizolowano mutanty na różnych etapach ścieżki egressu, z których niektóre wykazują podwójny fenotyp inwazji¹³. Potencjalne efekty wpływu na inwazję można określić za pomocą tzw. testu czerwono-zielonego (red-green assay), który rozróżnia pasożyty, które dokonały inwazji, od tych, które jej nie dokonały, poprzez różnicowe barwienie przeciwciałami^23,24. W przypadku testów inwazji i egressu wy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	roztwór stokowy 1 M w DMSO, przechowywać w -20 °C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	roztwór stokowy 1 M w DMSO, przechowywać w -20 °C
Siarczan dekstranu	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	roztwór stokowy 100 mM w PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Uchwyt do filtrów	Cole-Parmer	540100
filtr poliwęglanowy 3 μm	Whatman Schleicher Schuell	110612
Hemocytometr	Hausser Scientific	1475
Inkubatory CO2	Różni producenci		Kuweta nawilżona, 5% CO2, w temp. 35, 37 i 40 °C
Mikroskop fluorescencyjny	Różni producenci		Preferowany odwrócony, szerokopolowy z obiektywem olejowym 63x lub 100x
HBSSc (zgodnie z Black et al.11):
98,0 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (Hyclone, numer katalogowy SH30588) 100 μl 1M MgCl2 (stężenie końcowe 100 mM) 100 μl 1M CaCl2 (stężenie końcowe 100 mM) 2,0 ml 1M Hepes pH 7,3 (stężenie końcowe 20 mM) 84 mg NaHCO3 (stężenie końcowe 10 mM)