Test wypływu cholesterolu

Summary

Test cholesterolu ma na celu ilościowe określenie szybkości wypływu cholesterolu z hodowanych komórek oraz zdolności akceptorów osocza do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Test polega na znakowaniu komórek cholesterolem, równoważeniu cholesterolu w pulach wewnątrzkomórkowych i uwalnianiu cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Abstract

Zawartość cholesterolu w komórkach musi być utrzymywana w bardzo wąskich granicach, zbyt dużo lub zbyt mało cholesterolu w komórce powoduje przerwanie błon komórkowych, apoptozę i martwicę ¹. Komórki mogą pozyskiwać cholesterol z syntezy wewnątrzkomórkowej i lipoprotein osocza, oba źródła są wystarczające, aby w pełni zaspokoić zapotrzebowanie komórek na cholesterol. Procesy syntezy i wychwytu cholesterolu są ściśle regulowane, a niedobory cholesterolu występują rzadko ². Nadmiar cholesterolu jest częstszym problemem ³. Z wyjątkiem hepatocytów i do pewnego stopnia komórek kory nadnerczy, komórki nie są w stanie rozkładać cholesterolu. Komórki mają dwie możliwości obniżenia zawartości cholesterolu: przekształcenie cholesterolu w estry cholesterolu, opcja o ograniczonej pojemności, ponieważ przeciążenie komórek estrami cholesterolu jest również toksyczne, oraz wypływ cholesterolu, opcja o potencjalnie nieograniczonej pojemności. Wypływ cholesterolu jest specyficznym procesem, który jest regulowany przez szereg transporterów wewnątrzkomórkowych, takich jak białka transportera kasety wiążącej ATP A1 (ABCA1) i G1 (ABCG1) oraz receptor zmiatacza typu B1. Naturalnym akceptorem cholesterolu w osoczu jest lipoproteina o wysokiej gęstości (HDL) i apolipoproteina A-I.

Test wypływu cholesterolu ma na celu ilościowe określenie szybkości wypływu cholesterolu z hodowanych komórek. Mierzy zdolność komórek do utrzymania wypływu cholesterolu i/lub zdolność akceptorów osocza do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Test składa się z następujących kroków. Krok 1: znakowanie cholesterolu komórkowego poprzez dodanie znakowanego cholesterolu do pożywki zawierającej surowicę i inkubację z komórkami przez 24-48 godzin. Ten etap może być połączony z obciążeniem komórek cholesterolem. Krok 2: inkubacja komórek w pożywce wolnej od surowicy w celu zrównoważenia znakowanego cholesterolu we wszystkich wewnątrzkomórkowych pulach cholesterolu. Etap ten może być połączony z aktywacją komórkowych transporterów cholesterolu. Krok 3: inkubacja komórek z akceptorem zewnątrzkomórkowym i określenie ilościowe ruchu znakowanego cholesterolu z komórek do akceptora. Jeśli prekursory cholesterolu zostałyby użyte do znakowania nowo zsyntetyzowanego cholesterolu, może być wymagany czwarty krok, oczyszczanie cholesterolu.

Test dostarcza następujących informacji: (i) jak konkretne leczenie (mutacja, knock-down, nadekspresja lub leczenie) wpływa na zdolność komórki do wydalania cholesterolu i (ii) jak choroba lub leczenie wpływa na zdolność akceptorów osocza do przyjmowania cholesterolu. Metoda ta jest często stosowana w kontekście badań sercowo-naczyniowych, zaburzeń metabolicznych i neurodegeneracyjnych, chorób zakaźnych i rozrodczych.

Protocol

1. Przygotowanie [³H]-cholesterolu

1. W dygestorii dozować wymaganą ilość cholesterolu [³H] do probówki do mikrofugu o pojemności 1,5 ml (do typowego testu wymagane jest 0,5 μCi (19 kBq) na studzienkę).
2. Jeśli [³H]-cholesterol jest zawieszony w toluenie, wysusz go całkowicie gazem N2 i ponownie zamieszaj ze 100% etanolem do końcowego stężenia 1 μCi (37 kBq/μl. Odwirować i dobrze wymieszać.

2. Posiewanie komórek i oznaczanie cholesterolu komórkowego

Ten protokół został przetestowany przy użyciu następujących typów komórek: ludzkie monocyty ^4,5,THP-1 ludzkie monocyty-makrofagi ^6,7,8, RAW 264.7 mysie makrofagi ^5,9,10,11, komórki HeLa ¹², ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), komórki BHK-21 ⁹, ludzkie fibroblasty i myszy ^13,14, ludzkie komórki hepatotoraka HepG2 ¹⁵ oraz, w zmodyfikowanej formie, z płytek krwi ¹⁶ .

1. Zawieś ponownie komórki i policz je. Płytki na płytki 12-dołkowe o końcowej gęstości 0,2x10^{6 komórek na} studzienkę w 0,9 ml kompletnego podłoża. Komórki będą nadal rosły i osiągną 0,8x10⁶ komórek na studzienkę do czasu eksperymentu z wypływem. W przypadku komórek, które się nie dzielą, takich jak zróżnicowane komórki THP-1, gęstość wysiewu powinna wynosić 0,8x10⁶ komórek na studzienkę. W przypadku stosowania płytek 6- lub 24-dołkowych należy odpowiednio podwoić lub zmniejszyć o połowę liczbę komórek w basenie. Liczba studzienek powinna być wystarczająca do poczwórnego oznaczenia dla każdego warunku doświadczalnego.
2. Jeśli wymagane jest różnicowanie komórek THP-1, należy dodać PMA (stężenie końcowe 0,1 μg/ml) do pożywki przez 48-72 godziny.
3. Dodać niewielką porcję pożywki do probówki do mikrofuge zawierającej [³H] cholesterol.
4. Umyć boki probówki pożywką przed dodaniem cholesterolu [³H] do oddzielnej porcji kompletnej pożywki (100 μl/dołek).
5. Dodaj pożywkę zawierającą [³H] cholesterol do studzienek z komórkami (końcowa objętość na studzienkę wynosi 1 ml). Jeżeli przed znakowaniem nie jest wymagane poddanie ich obróbce, komórki można posiać w pożywce zawierającej cholesterol [³H].
6. Inkubować komórki przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ).

3. Inkubacja równowagi

1. Po 48 godzinach inkubacji sprawdź komórki pod mikroskopem. Upewnij się, że są zdrowe i znajdują się w około 80% zbiegu.
2. Usunąć podłoże zawierające [³H]cholesterol. Delikatnie umyj komórki PBS. Powtórz 3 razy pranie.
3. Przygotuj podłoże bez surowicy. W razie potrzeby aktywuj komórki, dodając agonistę LXR (takiego jak TO-901317 przy 1-4 μmol/l) lub cAMP (0,3 mmol/l; tylko dla komórek pochodzenia mysiego) do pożywki wolnej od surowicy.
4. Do każdego dołka dodać 500 μl pożywki wolnej od surowicy.
5. Inkubować przez 18 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ).

4. Inkubacja wypływu cholesterolu

1. Po 18 godzinach inkubacji w podłożu bez surowicy sprawdź komórki pod mikroskopem. Upewnij się, że są zdrowe i zlewają się (minimum 80% zbieżności).
2. Przygotować roztwór akceptorów wypływu cholesterolu w podłożu bez surowicy. Przykładami akceptorów są :
   Apolipoproteina A-I (apoA-I) (stężenie końcowe 10 μg/ml)
   Lipoproteina o wysokiej gęstości (HDL) (stężenie końcowe 20 μg/ml)
   Cyklodekstryna (stężenie końcowe 200 μg/ml)
   Osocze (stężenie końcowe 1-2%)
3. Delikatnie umyj komórki PBS.
4. Do każdego dołka dodać 250 μl pożywki bez surowicy z akceptorami.
5. Pozostaw jeden zestaw studzienek, aby określić wypływ tła (wypływ do pożywki wolnej od surowicy bez akceptora)
6. Inkubować komórki przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ). Czas trwania inkubacji wypływu może wahać się od 30 min do 8 h, jeśli jest to wymagane.

5. Przetwarzanie próbek

1. Po 2 godzinach inkubacji sprawdź komórki pod mikroskopem.
2. Zebrać pożywkę do probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Wiruj z prędkością 14 000 obr./min przez 1-10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
3. Przenieść 100 μl pożywki do 7 ml fiolki scyntylacyjnej. Dodaj 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) i mieszankę wirową. Pozostałe próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Umieść talerze w zamrażarce na 30 minut. Dodać 500 μl dH₂O do każdego dołka. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie komórki podniosły się z dna studzienek. Jeśli nadal przylegają, pozostawić na noc płytki z_dH2O w temperaturze 4 °C lub zeskrobać dołki.
5. Gdy wszystkie komórki oderwą się, pipetuj w górę iw dół, aby rozbić grudki komórek. Przenieść 100 μl do 7 ml fiolek scyntylacyjnych. Dodaj 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) i mieszankę wirową. Pozostałe płytki przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. Umieść fiolki scyntylacyjne na ladzie scyntylacyjnym. Skonfiguruj licznik do zliczania dla [³godzin] w jednostkach dpm.

6. Analiza wyników

1. Szybkość wypływu cholesterolu jest zwykle wyrażana jako proporcja cholesterolu przemieszczanego z komórek do akceptora. Stosuje się następujący wzór:

2. Wypływ właściwy oblicza się jako różnicę między wypływem w obecności lub braku akceptora (ślepej próby).

7. Oś czasu

8. Reprezentatywne wyniki

Przykład wyniku eksperymentu z wypływem cholesterolu pokazano na Rys. 1. W tym eksperymencie ludzkie monocyty THP-1 zróżnicowano w makrofagi i badano wypływ cholesterolu do różnych akceptorów. Wypływ cholesterolu do pożywki bez akceptorów ("ślepa") wynosił 0,79%, a wartość ta została uznana za wypływ nieswoisty i została odjęta od innych wartości. Odpływ cholesterolu do ludzkiego apoA-I (końcowe stężenie 30 μg/ml) wynosił 4,75%. Do tego eksperymentu włączono referencyjną próbkę osocza w celu monitorowania zmienności międzyeksperymentalnej. Próbka referencyjna może być wykorzystana do normalizacji danych z dużej liczby eksperymentów, ale uznaliśmy, że rozsądne jest powtórzenie testu, jeśli zmienność jest wysoka. Osocze pacjenta (stężenie końcowe 2%) badano przed i po leczeniu pacjenta lekami. Stwierdzono, że u tego pacjenta leki miały negatywny wpływ na zdolność osocza do wspomagania wypływu cholesterolu.

Inny przykład wyniku eksperymentu z wypływem jest pokazany na rys. 2. W tym eksperymencie makrofagi RAW 264.7 były aktywowane lub nie aktywowane przez nocną inkubację z agonistą LXR TO-901317 (końcowe stężenie 1 μmol/L) i badano wypływ cholesterolu do tej samej próbki ludzkiego osocza (2%). Stwierdzono, że aktywacja ekspresji komórkowej transporterów ABC z agonistą LXR zwiększa zdolność komórek do uwalniania cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Rysunek 1. Cholesterol wypływa z komórek THP-1 do różnych akceptorów. Procent wypływu cholesterolu (tj. odsetek znakowanego cholesterolu przeniesionego z komórek do określonego akceptora) jest pokazany po odjęciu wartości ślepej próby. Średnia ± SD czterokrotnych oznaczeń, *p<0,05.

Rysunek 2. Wypływ cholesterolu z RAW 264.7 aktywowany lub nieaktywowany agonistą LXR do ludzkiego osocza. Procent wypływu cholesterolu (tj. odsetek znakowanego cholesterolu przeniesionego z komórek do określonego akceptora) jest pokazany po odjęciu wartości ślepej próby. Średnia ± SD czterokrotnych oznaczeń, *p<0,001.

Discussion

Opisana metoda pomiaru wypływu cholesterolu jest przeznaczona do pomiaru ruchu cholesterolu z komórek do zewnątrzkomórkowego akceptora cholesterolu. Istnieje kilka kluczowych kwestii związanych ze zrozumieniem tej metodologii.

Etykietowanie i równoważenie

W opisanej metodologii znakowany cholesterol dodaje się do surowicy zawierającej surowicę. Chociaż nigdy nie zostało to szczegółowo zbadane, zakłada się, że cholesterol jest wbudowywany w lipoproteiny surowicy i są on...