Test odpływu cholesterolu

Podsumowanie

Test oznaczania cholesterolu został opracowany w celu ilościowego określenia szybkości odpływu cholesterolu z hodowli komórkowych oraz zdolności akceptorów plazmy do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Procedura obejmuje znakowanie komórek cholesterolem, wyrównanie poziomu cholesterolu w pulach wewnątrzkomórkowych oraz uwalnianie cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Streszczenie

Zawartość cholesterolu w komórkach musi być utrzymywana w bardzo wąskich granicach; zbyt wysoka lub zbyt niska ilość cholesterolu w komórce prowadzi do zaburzeń błon komórkowych, apoptozy i nekrozy ¹. Komórki mogą pozyskiwać cholesterol z syntezy wewnątrzkomórkowej oraz z lipoprotein osocza, przy czym oba źródła są wystarczające do pełnego zaspokojenia zapotrzebowania komórek na cholesterol. Procesy syntezy i poboru cholesterolu są ściśle regulowane, a niedobory cholesterolu występują rzadko ². Nadmiar cholesterolu jest częstszym problemem ³. Z wyjątkiem hepatocytów i w pewnym stopniu komórek kory nadnerczy, komórki nie są w stanie degradować cholesterolu. Komórki mają dwie możliwości zmniejszenia zawartości cholesterolu: przekształcenie cholesterolu w estry cholesterolu, co jest opcją o ograniczonej wydajności, ponieważ nadmiar estrów cholesterolu w komórkach jest również toksyczny, oraz odpływ cholesterolu, który jest opcją o potencjalnie nieograniczonej wydajności. Odpływ cholesterolu jest specyficznym procesem regulowanym przez szereg transporterów wewnątrzkomórkowych, takich jak białka transporterowe ABCA1 (ATP binding cassette transporter protein A1) i ABCG1 (ABCG1) oraz receptor scavenger typu B1. Naturalnymi akceptorami cholesterolu w osoczu są lipoprotein wysokiej gęstości (HDL) oraz apolipoproteina A-I.

Test odpływu cholesterolu został zaprojektowany w celu ilościowego oznaczenia szybkości odpływu cholesterolu z hodowli komórkowych. Mierzy on zdolność komórek do utrzymania odpływu cholesterolu i/lub zdolność akceptorów osoczowych do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Analiza składa się z następujących etapów. Krok 1: znakowanie cholesterolu komórkowego poprzez dodanie znakowanego cholesterolu do medium zawierającego surowicę i inkubację z komórkami przez 24-48 h. Krok ten można połączyć z ładowaniem komórek cholesterolem. Krok 2: inkubacja komórek w medium bezsurowiczym w celu wyrównania poziomu znakowanego cholesterolu we wszystkich wewnątrzkomórkowych pulach cholesterolu. Etap ten można połączyć z aktywacją komórkowych transporterów cholesterolu. Krok 3: inkubacja komórek z akceptorem zewnątrzkomórkowym i ilościowe oznaczenie przemieszczania się znakowanego cholesterolu z komórek do akceptora. Jeśli do znakowania nowo syntetyzowanego cholesterolu użyto prekursorów cholesterolu, może być wymagany czwarty krok – oczyszczanie cholesterolu.

Test dostarcza następujących informacji: (i) w jaki sposób konkretna interwencja (mutacja, wyciszenie genu, nadekspresja lub zastosowanie leku) wpływa na zdolność komórek do usuwania cholesterolu na zewnątrz oraz (ii) w jaki sposób zdolność akceptorów osocza do przyjmowania cholesterolu jest modyfikowana przez chorobę lub leczenie. Metoda ta jest często stosowana w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym, zaburzeniami metabolicznymi i neurodegeneracyjnymi, a także chorobami zakaźnymi i reprodukcyjnymi.

Protokół

1. Przygotowanie [³H]-cholesterolu

1. W dygestorium odmierzyć wymaganą ilość [³H]cholesterolu do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml (do typowego testu wymagane jest 0,5 μCi (19 kBq) na dołek).
2. Jeśli [³H]-cholesterol jest zawieszony w toluenie, odparować go całkowicie strumieniem gazu N2, a następnie zawiesić ponownie w 100% etanolu do końcowego stężenia 1 μCi (37 kBq/μl). Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.

2. Wysiewanie komórek i znakowanie cholesterolu komórkowego

Niniejszy protokół został przetestowany z użyciem następujących typów komórek: ludzkich monocytów ^4,5, ludzkich monocytów-makrofagów THP-1 ^6,7,8, mysich makrofagów RAW 264.7 ^5,9,10,11, komórek HeLa ¹², ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC), komórek BHK-21 ⁹, ludzkich i mysich fibroblastów ^13,14, ludzkich komórek raka wątrobowego HepG2 ¹⁵ oraz w formie zmodyfikowanej, z płytek krwi ¹⁶.

1. Resuspenderaj komórki i przeprowadź ich zliczanie. Wysiej komórki na płytki 12-dołkowe w końcowej gęstości 0,2x10⁶ komórek na dołek w 0,9 ml pożywki kompletnej. Komórki będą nadal rosnąć i osiągną gęstość 0,8x10⁶ komórek na dołek do czasu przeprowadzenia eksperymentu z odpływem. W przypadku komórek, które się nie dzielą, takich jak zróżnicowane komórki THP-1, gęstość siewu powinna wynosić 0,8x10⁶ komórek na dołek. W przypadku użycia płytek 6- lub 24-dołkowych, odpowiednio podwoj lub zmniejsz o połowę liczbę komórek na dołek. Liczba dołków powinna być wystarczająca do wykonania oznaczeń w czterech powtórzeniach dla każdego warunku eksperymentalnego.
2. Jeśli wymagana jest różnicowanie komórek THP-1, dodaj do pożywki PMA (końcowe stężenie 0,1 μg/ml) na 48-72 h.
3. Dodaj niewielką alikwot pożywki do probówki do mikrocentryfugi zawierającej [³H]cholesterol.
4. Przepłucz ścianki probówki pożywką przed dodaniem [³H]cholesterolu do oddzielnego alikwotu pożywki kompletnej (100 μl/dołek).
5. Dodaj pożywkę zawierającą [³H]cholesterol do dołków z komórkami (końcowa objętość na dołek wynosi 1 ml). Jeśli przed znakowaniem nie jest wymagana żadna obróbka komórek, można je wysiać bezpośrednio w pożywce zawierającej [³H]cholesterol.
6. Inkubuj komórki przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂).

3. Inkubacja równoważąca

1. Po 48-godzinnej inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem. Upewnić się, że są zdrowe i osiągnęły konfluencję na poziomie około 80%.
2. Usunąć medium zawierające [³H]cholesterol. Delikatnie przemyć komórki buforem PBS. Powtórzyć proces płukania 3 razy.
3. Przygotować medium bezsurowicze. W razie potrzeby aktywować komórki, dodając do medium bezsurowiczego agonistę LXR (np. TO-901317 w stężeniu 1-4 μMol/L) lub cAMP (0,3 mMol/L; wyłącznie dla komórek pochodzenia mysiego).
4. Do każdej studzienki dodać 500 μl medium bezsurowiczego.
5. Inkubować przez 18 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂).

4. Inkubacja w celu odpływu cholesterolu

1. Po 18-godzinnej inkubacji w medium bezzużytkowym (bez surowicy), sprawdzić komórki pod mikroskopem. Upewnić się, że są zdrowe i zrosłe (minimum 80% konfluencji).
2. Przygotować roztwór akceptorów odpływu cholesterolu w medium bez surowicy. Przykłady akceptorów obejmują:
   Apolipoproteinę A-I (apoA-I) (stężenie końcowe 10 μg/ml)
   Lipoproteinę o wysokiej gęstości (HDL) (stężenie końcowe 20 μg/ml)
   Cyklodekstrynę (stężenie końcowe 200 μg/ml)
   Osocze (stężenie końcowe 1-2%)
3. Delikatnie przemyć komórki PBS.
4. Do każdej studzienki dodać 250 μl medium bez surowicy z akceptorami.
5. Pozostawić jeden zestaw studninek w celu określenia tła odpływu (odpływ do medium bez surowicy BEZ akceptora).
6. Inkubować komórki przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂). Czas inkubacji odpływu może wynosić od 30 min do 8 h, jeśli jest to wymagane.

5. Przetwarzanie próbek

1. Po 2 godzinach inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem.
2. Zebrać medium do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować z prędkością 14 000 rpm przez 1-10 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki komórkowe.
3. Przenieść 100 μl medium do 7 ml fiolki scyntylacyjnej. Dodać 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) i wymieszać na wirówce typu vortex. Pozostałe próbki przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Umieścić płytki w zamrażarce na 30 min. Do każdej studzienki dodać 500 μl dH₂O. Sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie oddzieliły się od dna studzienek. Jeśli nadal przylegają, pozostawić płytki z dH₂O w temperaturze 4 °C przez noc lub zeskrobać zawartość studzienek.
5. Po oddzieleniu wszystkich komórek pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić skupiska komórkowe. Przenieść 100 μl do 7 ml fiolek scyntylacyjnych. Dodać 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) i wymieszać na wirówce typu vortex. Pozostałe płytki przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. Umieścić fiolki scyntylacyjne w liczniku scyntylacyjnym. Skonfigurować licznik do pomiaru [³H] w jednostkach dpm.

6. Analiza wyników

1. Szybkość odpływu cholesterolu jest zazwyczaj wyrażana jako proporcja cholesterolu przeniesionego z komórek do akceptora. Stosuje się następujący wzór:

2. Specyficzny odpływ oblicza się jako różnica między odpływem w obecności a odpływem w nieobecności akceptora (próba ślepa).

7. Harmonogram

8. Reprezentatywne wyniki

Przykład wyniku eksperymentu z efLuksem cholesterolu przedstawiono na Rys. 1. W tym doświadczeniu ludzkie monocyty THP-1 zróżnicowano do makrofagów i przetestowano ef luks cholesterolu do różnych akceptorów. Ef luks cholesterolu do medium bez akceptorów („blank”) wyniósł 0,79%; wartość ta została uznana za nieswoisty ef luks i odjęta od pozostałych wyników. Ef luks cholesterolu do ludzkiej apoA-I (stężenie końcowe 30 μg/ml) wyniósł 4,75%. W eksperymencie uwzględniono referencyjną próbkę osocza w celu monitorowania zmienności międzyeksperymentalnej. Próbka referencyjna może służyć do normalizacji danych z wielu eksperymentów, jednak uznaliśmy za zasadne powtórzenie analizy w przypadku wysokiej zmienności. Przebadano osocze pacjenta (stężenie końcowe 2%) przed i po zastosowaniu leczenia farmakologicznego. Stwierdzono, że u tego pacjenta lek miał negatywny wpływ na zdolność osocza do wspomagania ef luksu cholesterolu.

Kolejny przykład wyniku eksperymentu dotyczącego odpływu przedstawiono na Rys. 2. W tym doświadczeniu makrofagi RAW 264.7 były aktywowane lub nieaktywowane poprzez inkubację przez noc z agonistą LXR TO-901317 (stężenie końcowe 1 μmol/L), a następnie badano odpływ cholesterolu do tej samej próbki ludzkiej osocza (2%). Wyciągnięto wniosek, że aktywacja ekspresji komórkowej transporterów ABC za pomocą agonisty LXR zwiększa zdolność komórek do uwalniania cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Rysunek 1. Odpływ cholesterolu z komórek THP-1 do różnych akceptorów. Przedstawiono procentowy odpływ cholesterolu (tj. proporcję znakowanego cholesterolu przeniesionego z komórek do określonego akceptora) po odjęciu wartości tła. Średnia ± SD z czterech pomiarów, *p<0.05.

Rysunek 2. Odpływ cholesterolu z komórek RAW 264.7 aktywowanych lub nieaktywowanych agonistą LXR do ludzkiej osocza. Procent odpływu cholesterolu (tj. proporcja znakowanego cholesterolu przetransportowanego z komórek do określonego akceptora) przedstawiono po odjęciu wartości tła. Średnia ± SD z czterech powtórzeń, *p<0.001.

Dyskusja

Opisana metoda pomiaru odpływu cholesterolu została opracowana w celu zmierzenia przemieszczania się cholesterolu z komórek do pozakomórkowego akceptora cholesterolu. Istnieje kilka kluczowych kwestii istotnych dla zrozumienia tej metodologii.

Etykietowanie i równoważenie

W opisanej metodologii do surowicy dodawany jest znakowany cholesterol. Choć nie zostało to szczegółowo zbadane, przyjmuje się, że cholesterol wbudowuje się w lipoproteiny surowicze, które są następni...