Analiza lotności owoców za pomocą elektronicznego nosa

Summary

Opisana jest szybka metoda analizy związków lotnych w owocach. Lotne związki obecne w przestrzeni nad roztworem homogenatu próbki są szybko rozdzielane i wykrywane za pomocą ultraszybkiej chromatografii gazowej (GC) sprzężonej z czujnikiem powierzchniowej fali akustycznej (SAW). Omówiono również procedurę obsługi i analizy danych.

Abstract

Podczas dojrzewania owoców zachodzą liczne i różnorodne zmiany fizjologiczne, w tym rozwój specyficznej mieszanki lotnej, która charakteryzuje aromat owoców. Dojrzałość w momencie zbioru jest jednym z kluczowych czynników wpływających na jakość smakową owoców i warzyw¹. Walidacja solidnych metod, które szybko oceniają dojrzałość owoców i jakość aromatu, pozwoliłaby na lepsze zarządzanie zaawansowanymi programami hodowlanymi, praktykami produkcyjnymi i obsługą po zbiorach.

W ciągu ostatnich trzech dekad przeprowadzono wiele badań mających na celu opracowanie tak zwanych elektronicznych nosów, które są urządzeniami zdolnymi do szybkiego wykrywania zapachów i smaków^2-4. Obecnie dostępnych na rynku jest kilka elektronicznych nosów zdolnych do przeprowadzania analizy lotności, opartych na różnych technologiach. Nos elektroniczny wykorzystywany w naszej pracy (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), składa się z ultraszybkiej chromatografii gazowej sprzężonej z powierzchniowym czujnikiem fal akustycznych (UFGC-SAW). Technologia ta została już przetestowana pod kątem zdolności do monitorowania jakości różnych towarów, w tym wykrywania pogorszenia jakości jabłka⁵; ocena dojrzałości i zgnilizny mango⁶; profilowanie aromatyczne gatunków grasicy ⁷; _C6 związki lotne w jagodach winogron⁸; Charakterystyka oleju roślinnego⁹ i wykrywanie domieszek w oleju kokosowym z pierwszego tłoczenia¹⁰.

Ten system może wykonywać trzy główne etapy analizy aromatu: pobieranie próbek z przestrzeni nad głową, separację lotnych związków i wykrywanie. W ciągu około jednej minuty wytwarzany jest wynik, chromatogram, a po cyklu przedmuchiwania przyrząd jest gotowy do dalszej analizy. Wyniki uzyskane za pomocą zNose mogą być porównane z wynikami innych systemów chromatografii gazowej poprzez obliczenie wskaźników Kovatsa (KI). Gdy instrument zostanie nastrojony za pomocą wzorcowego roztworu alkanów, czasy retencji są automatycznie przeliczane na KI. Oczekuje się jednak, że z czasem wystąpią niewielkie zmiany temperatury i natężenia przepływu, co spowoduje dryf czasu retencji. Ponadto, w zależności od biegunowości fazy stacjonarnej kolumny, odtwarzalność obliczeń KI może różnić się o kilka jednostek indeksu¹¹. W związku z tym opracowano szereg programów i interfejsów graficznych do porównywania obliczonych KI między próbkami w sposób półautomatyczny. Programy te skracają czas potrzebny na analizę chromatogramów dużych zbiorów danych i minimalizują możliwość błędnej interpretacji danych, gdy chromatogramy nie są idealnie wyrównane.

Prezentujemy metodę szybkiej analizy związków lotnych w owocach. Omówiono również procedury przygotowania próbek, pozyskiwania danych i postępowania z nimi.

Protocol

1. Przygotowanie próbki

1. Zbieraj owoce w pożądanej fazie dojrzałości. Spłucz wodą z kranu w celu usunięcia brudu i kurzu.
2. Wybierz owoce do analizy w oparciu o brak wad zewnętrznych i wewnętrznych oraz jednorodność wielkości.
3. Pokrój owoce wzdłużnie w ćwiartki, które zostaną wykorzystane do pobierania próbek lotnych. W razie potrzeby usuń skórkę, nasiona, tkankę jamy nasiennej lub pestkę. Selekcja tkanek owocowych musi być spójna przez cały czas trwania doświadczenia i uwzględniać zmienność w obrębie pojedynczego owocu (tj. pobrać próbkę równomiernie z części równikowej, kwiatowej i końcowej łodygi).
4. Połącz wybraną tkankę owocową, wymieszaj ją w celu losowania, a następnie odważ 200 g do blendera.
5. Dodać 200 ml nasyconego roztworu CaCl₂ (372,5 g w temperaturze 20 °C w 500 ml wody dejonizowanej) i 50 ml 100 mM roztworu izowalerianianu 2-metylobutylu w metanolu. CaCl₂ ma za zadanie działać jako inhibitor aktywności enzymatycznej, która może wystąpić po rozkrojeniu i homogenizacji miąższu owocu. Izowalerianian 2-metylobutylu jest dodawany jako wzorzec wewnętrzny w celu monitorowania wszelkich możliwych strat lotnych związków podczas procesu homogenizacji.
6. Homogenizować mieszaninę w blenderze laboratoryjnym (Waring, USA) przez 30 sekund przy 18 000 obr./min, a następnie natychmiast przelać do szklanej butelki i zamknąć teflonową pokrywką. Przechowywać homogenat w butelce w temperaturze pokojowej do czasu, aż wszystkie próbki zostaną przygotowane.
7. Po przelaniu homogenatu do butelki odczekać 10 minut, aby umożliwić oddzielenie się piany od cieczy, następnie odpipetować 5 ml porcji płynu, bez piany, do szklanych bursztynowych fiolek o pojemności 20 ml i zamknąć fiolki stalowymi nakrętkami wyposażonymi w przegrodę teflonowo-silikonową. Ta procedura jest odpowiednia do przygotowania homogenatu melona i gruszki. Jeżeli do analizy wykorzystywane są inne owoce, może być wymagany etap wirowania. Dlatego usuń pianę, a następnie odwiruj ciecz do cząstek granulek, które mogą zatkać pipetę. Przygotować co najmniej trzy fiolki na próbkę, które posłużą jako kontrpróby techniczne.
8. Na tym etapie próbki mogą być natychmiast analizowane lub błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w bardzo niskiej temperaturze (-80 °C) do późniejszej analizy.
9. W przypadku próbek zamrożonych, w dniu analizy wyjmuje się je z zamrażarki i pozostawia do rozmrożenia przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu, a przed analizą, należy wymienić nakrętkę fiolki na nową, która ma czystą, suchą przegrodę. Jeśli przegroda nie zostanie wymieniona, woda skondensowana na przegrodzie podczas rozmrażania może zostać wciągnięta do instrumentu i go uszkodzić.

2. Chromatografia gazowa z powierzchniową falą akustyczną (GC-SAW) Konfiguracja i akwizycja danych

1. Załaduj odpowiednią metodę analizy do zNose.
   Do analizy bogatego w estry profilu lotnego melonu nasze parametry w oprogramowaniu MicroSense w wersji 5.44.22 (Newbury Park, CA, USA) są następujące: zasysanie przestrzeni nad głową do wlotu przez 20 sekund przy 30 ml ^min-1 za pomocą pompy; temperatura na wlocie przy 200 °C; Temperatura pułapki Tenax w temperaturze 225 °C; gaz nośny (czystość helu 99,999%) natężenie przepływu 2,9 ml min-1; kolumna (kolumna DB-5, 1 m × 0,25 mm średnicy wewnętrznej×, grubość warstwy 0,25 μm) program temperatury od 45 °C do 180 °C z szybkością 10 °C ^sec-1; temperatura czujnika przy 40 °C; zawór w temperaturze 165 °C. Całkowity czas analizy wynosi 1 minutę na próbkę.
2. Podłącz igłę ze stali nierdzewnej z końcówką bez rdzenia do wlotu zNose i kilkakrotnie przedmuchnij system powietrzem z otoczenia, aż linia podstawowa będzie stabilna i nie zostaną wykryte piki większe niż 200 zliczeń (Ct).
3. Nastroić instrument za pomocą roztworu alkanów o prostym łańcuchu (C6-C14). Wynik strojenia jest używany przez oprogramowanie instrumentu do przeliczenia czasu retencji eluowanych pików z jednostek czasu na jednostki indeksu Kovatsa (KI). W związku z tym, po dostrojeniu systemu, czasy przechowywania są podawane w jednostkach KI.
4. Przed analizą należy odczekać, aby próbka uległa równowadze przez 30 minut. Aby przeanalizować jedną z fiolek z próbkami, należy wprowadzić igłę do przegrody fiolki w celu zmniejszenia ciśnienia. Następnie wprowadzić igłę podłączoną do wlotu instrumentu do przegrody fiolki i rozpocząć pobieranie próbek w przestrzeni nad głową. Przeprowadzić analizę co najmniej trzech kontrprób technicznych na próbkę.
5. Ręcznie uruchom instrument, klikając przycisk "Graj"; pompa aktywuje i pobiera opary znajdujące się nad próbką. Pod koniec analizy na ekranie pojawia się chromatogram, a czujnik jest automatycznie podgrzewany do 150 °C przez 10 sekund w celu jego oczyszczenia. Gdy przycisk w polu stanu systemu ponownie zmieni kolor na zielony, urządzenie jest gotowe do analizy kolejnej próbki.
6. Aby zapewnić stabilną linię bazową i prawidłowe czyszczenie systemu, należy uruchomić co najmniej jedną ślepą próbę powietrzną między każdą próbką. W celu monitorowania możliwego zanieczyszczenia lotnego z fiolki i nakrętki, należy przeanalizować dwie ślepe próby fiolek (pusta fiolka z nakrętką) na początku i na końcu dnia.

3. Eksport i analiza danych

1. Po pobraniu wyeksportuj dane do pliku Microsoft Excel za pomocą funkcji "Rejestrowanie szczytów" w oprogramowaniu MicroSense. Po wyeksportowaniu danych dodaj kolumny zawierające etykiety zmiennych i replikatów.
2. Przekształć format danych w celu łatwiejszej manipulacji za pomocą opracowanego przez nas skryptu Python (wersja 2.6; dostępna bezpłatnie on-line) o nazwie "reform_data.py" (patrz rysunek 1, aby zapoznać się z przykładem formatu danych przed i po użyciu skryptu "reform_data.py"). Nazwa pliku źródłowego (format xls) i nazwa arkusza dla danych wejściowych, a także żądana nazwa pliku wyjściowego (format xls) są edytowane bezpośrednio w skrypcie.
3. Start "kim_interface.py" (napisany również w Pythonie 2.6; patrz rysunek 2) i zaimportuj dane z pliku wygenerowanego w poprzednim kroku. W szczególności analiza opiera się na przeglądaniu i analizowaniu liczby wykryć każdej wartości KI ("trafienia KI"). W ten sposób program wyświetla wykres słupkowy trafień KI dla każdej wartości KI.
4. Oceń trafienia KI określonych podzbiorów próbek, analizując razem każdą grupę powtórzeń technicznych. Aby to zrobić, przeanalizuj każdą metodę lub zmienną osobno, zaznaczając/odznaczając odpowiednie pola. Zobacz podpis Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowy opis funkcji graficznego interfejsu użytkownika (GUI).
5. Po określeniu szerokości każdego okna KI za pomocą graficznego interfejsu użytkownika, losowo wybierz niektóre z odpowiednich chromatogramów w oprogramowaniu Microsense i oceń nakładające się piki wśród kontrprób technicznych. Na rysunku 3 przedstawiono przykład nałożonych na siebie chromatogramów dwóch kontrprób technicznych.
6. Po zindywidualizowaniu okna KI, użyj funkcji "Scal" dostępnej w graficznym interfejsie użytkownika, aby scalić KI, które mieszczą się w oknie, w najbardziej zaludnione KI. Dzięki tej funkcji piki oznaczone zakresem wartości KI są konsolidowane pod jedną etykietą KI, co pozwala traktować takie piki jako pojedynczą zmienną.
   Aby to zrobić, najpierw kliknij przycisk "Scal", aby aktywować funkcję i wybierz najbardziej zaludnione KI jako środek okna, klikając lewym przyciskiem myszy odpowiedni pasek. Po wybraniu paska zmienia kolor i zmienia kolor na zielony. Aby scalić KI, które znajdują się w oknie z wybranym KI, kliknij prawym przyciskiem myszy na odpowiednie paski; powoduje to, że słupki zmieniają kolor na czerwony, podczas gdy niebieski pasek o odpowiedniej długości jest dodawany na górze środkowego KI (patrz rysunek 4). Po połączeniu wszystkich wybranych KI z odpowiednim centralnym KI, kliknij ponownie przycisk "Połącz", aby zaakceptować zmiany; powoduje to, że przycisk "Scal" zmienia kolor na żółty. W przypadku pomyłek dostępny jest również przycisk "Rozłącz". Aby rozłączyć, kliknij przycisk "Rozłącz" w graficznym interfejsie użytkownika, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony pasek, który chcesz rozłączyć. Z czerwonego pasek zmieni kolor na niebieski. Kliknij ponownie przycisk "Rozłącz", aby zaakceptować zmiany.
7. Jeśli ktoś spróbuje niepoprawnie scalić dwa piki w jednej próbce w jedną wartość KI, zostanie wydrukowany komunikat o błędzie. W takich okolicznościach należy dokładnie sprawdzić chromatogram i ponownie zdefiniować okno KI w tym obszarze.
8. Po wykonaniu wszystkich operacji scalania zapisz plik.
9. Przed przystąpieniem do analizy statystycznej chromatogramy ślepych prób powietrza i fiolek są analizowane w celu monitorowania ewentualnych zanieczyszczeń. Po zidentyfikowaniu KI pików w ślepej próbie należy odjąć obszar piku wykryty w ślepej próbie powietrza i/lub fiolki od obszaru piku obecnego w próbce.
   Następnie przystąp do analizy statystycznej.

4. Reprezentatywne wyniki

Elektroniczny nos był w stanie wykryć różnice w profilach lotnych wśród owoców melona zebranych w różnych stadiach dojrzałości (Rysunek 5). We wszystkich próbkach zidentyfikowano dwadzieścia okien KI. Analiza wariancji wykazała, że 14 pików wykrytych przez elektroniczny nos różniło się istotnie między etapami dojrzałości. Na rysunku 6 logarytm średnich powierzchni pików tych 14 składników przedstawiono w celu pokazania różnic w szczytowej obfitości między dwoma etapami dojrzałości, wczesnymi dojrzałymi i w pełni dojrzałymi owocami.

Rysunek 1. Przykłady formatów danych eksportowanych z oprogramowania przyrządu (A) i po transformacji, wykonywanych za pomocą skryptu "reform_data.py" (B). Aby ułatwić manipulację danymi i analizę, wszystkie unikalne KI są identyfikowane we wszystkich próbkach, a następnie dane są ponownie porządkowane z informacjami o próbce w wierszach i obszarem piku w kolumnach, odpowiadającymi unikalnym KI. Jeśli pik nie zostanie wykryty dla wartości KI w próbce, odpowiednia komórka pozostaje pusta.

Rysunek 2. Zrzut ekranu z pliku skryptu "kim_interface.py". Wykres w środku przedstawia liczbę trafień na KI w funkcji KI. "Trafienie na KI" oznacza liczbę próbek, w których wykryto pik dla tego konkretnego KI. Po lewej stronie znajdują się trzy żółte pola kontrolujące wybrane dane. Wyświetlają parametry dzielące zbiór danych (zabiegi, powtórzenia, zmienne jakościowe itp.). Na tym rysunku są to (od góry do dołu): odmiana, data sadzenia i etap dojrzałości w momencie zbioru. Na dole: klikając na 3 paski i przesuwając niebieski pasek w lewo lub w prawo, można wybrać minimalną i maksymalną wartość zakresu KI oraz minimalną powierzchnię piku ("Próg"). Po prawej: przycisk 'Scal' umożliwia scalenie wybranych KI poprzez ręczne kliknięcie na słupki na wykresie. Przycisk "Rozłącz" pozwala na odwrócenie procesu dla wybranych przypadków.

Rysunek 3. Nałożone na siebie chromatogramy (w kolorze czarnym i czerwonym) dwóch kontrprób technicznych z lotnej przestrzeni nad melonem w celu zilustrowania przesunięcia czasu retencji.

Rysunek 4. Przykład procedury łączenia KI. Na wykresie centralnym zielony pasek (Central KI) reprezentuje najbardziej zaludnioną KI, która została wybrana jako środek okna KI. KI X i KI Y są KI, które mieszczą się w oknie zainteresowania i muszą zostać scalone z centralnym KI. Klikając prawym przyciskiem myszy na pasek KI X, zmienia on kolor na czerwony, a jednocześnie niebieski pasek o tej samej długości co pasek KI X pojawia się na zielonym. Powtarzając tę samą procedurę dla KI Y, długość niebieskiego paska (scalone KI) zwiększy się o odpowiednią długość. Po dodaniu wszystkich KI, po kliknięciu zielonego przycisku "Połącz", proces scalania kończy się, zmiany są zapisywane, a kolor przycisku zmienia kolor na żółty.

Rysunek 5. Dwa chromatogramy próbek melonów zebranych w różnych stadiach dojrzałości, wczesnej dojrzałości (na górze) i w pełni dojrzałej (na dole), w celu zilustrowania zdolności elektronicznego nosa do wykrywania różnic w obfitości substancji lotnych.

Rysunek 6. Wykres radarowy przedstawiający powierzchnię pików 14 składników obecnych w dwóch próbkach melonów w dwóch różnych stadiach dojrzałości, wcześnie dojrzałych i w pełni dojrzałych. Obszary pików są raportowane w skali logarytmicznej, aby ułatwić wizualizację porównania. Liczby na końcu każdego promienia reprezentują odpowiadające im indeksy Kovatsa.

Discussion

Elektroniczne nosy stanowią obiecującą metodę szybkiej, obiektywnej oceny profili aromatycznych owoców lub próbek bogatych w substancje lotne. Jednak przesunięcia w czasie retencji stanowią wyzwanie dla identyfikacji pików i mogą prowadzić do błędnej interpretacji danych, gdy dwa chromatogramy nie są idealnie wyrównane. Oględziny chromatogramów wykazały, że zmienność czasów retencji między próbkami często powodowała, że ten sam pik był oznaczany nieco innymi wartościami KI (około ±10). Przełożyło się to na przesadzoną liczbę wykrytych unikalnych KI. W celu wykorzystania faktu, że a) różne związki chemiczne są obecne na różnych etapach dojrzałości oraz b) kontrpróby techniczne są w przybliżeniu identyczne, opracowano dwa skrypty komputerowe ("kim_merge.py", który zawiera procedury postępowania ze zbiorem danych, oraz "kim_interface.py", który zapewnia graficzny interfejs użytkownika (GUI)) w celu systematycznego porównywania próbek w sposób półautomatyczny, znacznie skraca czas potrzebny na analizę chromatogramową dużych zbiorów danych. Programy te umożliwiają konsolidację, w stosownych przypadkach, pików oznaczonych zakresem wartości KI pod jedną etykietą KI. Służy to dwóm ważnym celom: (a) umożliwia analizę statystyczną traktującą takie piki jako pojedynczą zmienną oraz (b) ułatwia identyfikację pików i porównanie ich z innymi systemami i publikowanymi wartościami. Przedstawione wyniki wskazują, że próbki melonów mogą być rozróżniane na podstawie dojrzałości i profilu aromatycznego przy użyciu systemu zNose w połączeniu z odpowiednią identyfikacją KI. Jest to obiecująca nowa technologia analizy substancji lotnych, która może być wykorzystana w programach kontroli jakości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek wapnia	MP Biomedicals	195088
Izowalerianian 2-metylobutylu	SAFC Global	W350613	≥ 98%, naturalny, FCC
Metanol	Fisher Scientific	A411-4
Vial	Sigma-Aldrich	SU860098
Cap	Sigma-Aldrich	SU860101
Blender laboratoryjny	Waring Laboratory	7009G	2-biegowy; Szklany pojemnik o pojemności 1 litra
Butelka	Fisher Scientific	06-414-1C	Pyrex, 500 mL; polipropylenowa uszczelka z zatyczką
Igła	Technologia czujników elektronicznych	TLC101046	Otwór boczny Luer
Roztwór alkanów	Technologia czujników		C6-C14 roztwór alkanów w metanolu
Technologia czujników elektronicznych	zNose	Model 4500
Kolumna DB-5 GC	Technologia czujników elektronicznych	SYS4500C5
Technologia czujników elektronicznych	MicroSense	Wersja 5.44.22
Python 2.6			Swobodnie dostępne
skrypty			Skrypty dostępne jako materiał uzupełniający na JoVE