Opisano szybką metodę analizy związków lotnych w owocach. Związki lotne obecne w przestrzeni nad próbką homogenatu są szybko rozdzielane i wykrywane za pomocą ultraszybkiej chromatografii gazowej (GC) sprzężonej z czujnikiem fali akustycznej powierzchniowej (SAW). Omówiono również procedurę przetwarzania i analizy danych.
Artykuł metodologiczny
Analiza lotnych związków owoców z wykorzystaniem elektronicznego nosa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podczas dojrzewania owoców zachodzi szereg różnorodnych zmian fizjologicznych, w tym rozwój specyficznej mieszaniny związków lotnych, która nadaje owocom charakterystyczny aromat. Stopień dojrzałości w momencie zbioru jest jednym z kluczowych czynników wpływających na jakość smakową owoców i warzyw1. Walidacja niezawodnych metod szybkiej oceny dojrzałości owoców i jakości ich aromatu pozwoliłaby na usprawnienie zarządzania zaawansowanymi programami hodowlanymi, praktykami produkcyjnymi oraz procesami powysiewnymi i pozbiórczymi.
W ciągu ostatnich trzech dekad przeprowadzono wiele badań nad opracowaniem tzw. nosów elektronicznych, czyli urządzeń zdolnych do szybkiego wykrywania zapachów i aromatów2-4. Obecnie na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych nosów elektronicznych umożliwiających analizę substancji lotnych, opartych na różnych technologiach. Nos elektroniczny wykorzystany w naszej pracy (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA) składa się z ultraszybkiej chromatografii gazowej sprzężonej z czujnikiem fali akustycznej powierzchniowej (UFGC-SAW). Technologia ta została już przetestowana pod kątem możliwości monitorowania jakości różnych towarów, w tym w wykrywaniu psucia się jabłek5, ocenie dojrzałości i gnicia mango6, profilowaniu aromatu gatunków thymus7, analizie lotnych związków C6 w jagodach winogron8, charakterystyce olejów roślinnych9 oraz wykrywaniu zanieczyszczeń w nierafinowanym oleju kokosowym10.
System ten może przeprowadzać trzy główne etapy analizy aromatu: pobieranie próbki z przestrzeni nad próbką (headspace), rozdział związków lotnych oraz detekcję. W ciągu około jednej minuty generowany jest wynik w postaci chromatogramu, a po cyklu płukania instrument jest gotowy do dalszych analiz. Wyniki uzyskane za pomocą zNose można porównać z wynikami innych systemów chromatografii gazowej poprzez obliczenie indeksów Kovatsa (KI). Po skalibrowaniu instrumentu za pomocą wzorca alkanów, czasy retencji są automatycznie przeliczane na KI. Należy jednak spodziewać się niewielkich zmian temperatury i szybkości przepływu w czasie, co powoduje dryft czasów retencji. Ponadto, w zależności od polarności fazy stacjonarnej kolumny, powtarzalność obliczeń KI może różnić się o kilka jednostek indeksu11. Opracowano zatem szereg programów i interfejsów graficznych w celu półautomatycznego porównywania obliczonych KI pomiędzy próbkami. Programy te skracają czas wymagany do analizy chromatogramów w dużych zbiorach danych i minimalizują ryzyko błędnej interpretacji danych w sytuacjach, gdy chromatogramy nie są idealnie wyrównane.
Przedstawiamy metodę szybkiej analizy związków lotnych w owocach. Omówiono również procedury przygotowania próbek, pozyskiwania i przetwarzania danych.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- Zbiór owoców w pożądanym stadium dojrzałości. Płukanie wodą z kranu w celu usunięcia zanieczyszczeń i kurzu.
- Wybór owoców do analizy na podstawie braku wad zewnętrznych i wewnętrznych oraz jednorodności rozmiaru.
- Przecięcie owoców wzdłuż na ćwiartki do wykorzystania w pobieraniu związków lotnych. W razie potrzeby usunięcie skórki, nasion, tkanki wnętrza nasion lub pestki. Dobór tkanki owocowej musi być spójny w całym eksperymencie i uwzględniać zmienność wewnątrz jednego owocu (tzn. pobranie próbek w równych częściach z okolic równika, kwiatu i szypułki).
- Połączenie wybranej tkanki owocowej, wymieszanie jej w celu randomizacji, a następnie odważenie 200 g do blendera.
- Dodanie 200 mL nasyconego roztworu CaCl2 (372,5 g w 20 °C w 500 mL wody dejonizowanej) oraz 50 μL 100 mM roztworu izowaleronianu 2-metylobutylu w metanolu. CaCl2 ma służyć jako inhibitor aktywności enzymatycznej, która może wystąpić po pocięciu i homogenizacji miąższu owoców. Izowaleronian 2-metylobutylu jest dodawany jako standard wewnętrzny w celu monitorowania ewentualnych strat związków lotnych podczas procesu homogenizacji.
- Homogenizacja mieszaniny w blenderze laboratoryjnym (Waring, USA) przez 30 sekund przy 18 000 rpm, a następnie natychmiastowe przelanie do szklanej butelki i zamknięcie pokrywką z Teflonu. Przechowywanie homogenatu w butelce w temperaturze pokojowej do czasu przygotowania wszystkich próbek.
- Po przelaniu homogenatu do butelki należy odczekać 10 minut, aby piana oddzieliła się od cieczy, a następnie pipetować aliquoty 5 mL cieczy, bez piany, do 20 mL szklanych fiolek bursztynowych i zamknąć fiolki stalowymi zakrętkami z septami teflonowo-silikonowymi. Procedura ta jest odpowiednia dla przygotowania homogenatu z melona i gruszki. W przypadku użycia innych owoców do analizy może być wymagany etap wirowania. W takim przypadku należy usunąć pianę, a następnie odwirować ciecz, aby osadzić cząstki, które mogłyby zablokować pipetę. Należy przygotować co najmniej trzy fiolki na próbkę, które posłużą jako powtórzenia techniczne.
- Na tym etapie próbki można analizować natychmiast lub zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze ultra-niskiej (-80 °C) do późniejszej analizy.
- W przypadku próbek mrożonych, w dniu analizy należy wyjąć próbki z zamrażarki i pozostawić je do rozmrożenia przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu i przed analizą należy wymienić zakrętkę fiolki na nową z czystym i suchym septem. Jeśli septum nie zostanie wymienione, woda skroplona na septum podczas rozmrażania może zostać zassana do instrumentu i go uszkodzić.
2. Konfiguracja układu chromatografii gazowej z detekcją fal powierzchniowych (GC-SAW) i pozyskiwanie danych
- Wczytaj odpowiednią metodę analizy do urządzenia zNose.
Do analizy profilu lotnych związków bogatych w estry w melonach, parametry w oprogramowaniu MicroSense wersja 5.44.22 (Newbury Park, CA, USA) są następujące: zasysanie przestrzeni nadpróbkowej do wlotu przez 20 sekund z przepływem 30 mL min-1 za pomocą pompy; temperatura wlotu 200 °C; temperatura pułapki Tenax 225 °C; szybkość przepływu gazu nośnego (hel czystości 99,999%) 2,9 mL min-1; program temperatury kolumny (kolumna DB-5, 1 m × 0,25mm I.D.× 0,25 μm grubości warstwy) od 45 °C do 180 °C z szybkością 10 °C sec-1; temperatura sensora 40 °C; zawór 165 °C. Całkowity czas analizy wynosi 1 minutę na próbkę. - Podłącz igłę ze stali nierdzewnej z końcówką niepowcinową do wlotu zNose i kilkukrotnie przedmuchaj system powietrzem otoczenia, aż linia bazowa stanie się stabilna, a wykryte piki nie będą przekraczać 200 Counts (Ct).
- Przeprowadź strojenie instrumentu za pomocą roztworu alkanów o łańcuchu prostym (C6-C14). Wynik strojenia jest wykorzystywany przez oprogramowanie instrumentu do przeliczenia czasu retencji eluowanych pików z jednostek czasu na jednostki Indeksu Kovatsa (KI). W konsekwencji, po zestrojeniu systemu, czasy retencji są raportowane w jednostkach KI.
- Przed analizą pozostaw próbkę do wyrównania ciśnienia przez 30 minut. Aby przeanalizować jedną z fiolek z próbką, wprowadź igłę przez membranę fiolki, aby zredukować ciśnienie. Następnie wprowadź igłę podłączoną do wlotu instrumentu przez membranę fiolki i rozpocznij próbkowanie przestrzeni nadpróbkowej. Przeanalizuj co najmniej trzy powtórzenia techniczne dla każdej próbki.
- Uruchom instrument ręcznie, klikając przycisk „Play”; pompa aktywuje się i odsysa opary znajdujące się nad próbką. Na koniec analizy na ekranie pojawia się chromatogram, a sensor jest automatycznie podgrzewany do 150 °C przez 10 sekund w celu jego oczyszczenia. Gdy przycisk w polu stanu systemu ponownie zmieni kolor na zielony, instrument jest gotowy do analizy kolejnej próbki.
- Aby zapewnić stabilną linię bazową i prawidłowe oczyszczenie systemu, przeprowadź co najmniej jedną próbę ślepą z powietrzem pomiędzy każdą próbką. W celu monitorowania możliwego zanieczyszczenia lotnymi związkami z fiolki i zakrętki, przeanalizuj dwie próbki ślepe fiolki (pusta fiolka z zakrętką) na początku i na koniec dnia.
3. Eksport i analiza danych
- Po akwizycji wyeksportuj dane do pliku Microsoft Excel, korzystając z funkcji „Peak logging” w oprogramowaniu MicroSense. Po wyeksportowaniu danych dodaj kolumny zawierające etykiety zmiennych i powtórzeń.
- Zmień format danych w celu ułatwienia manipulacji, używając opracowanego przez nas skryptu w języku Python (wersja 2.6; dostępny bezpłatnie online) o nazwie „reform_data.py” (przykład formatu danych przed i po użyciu skryptu „reform_data.py” przedstawiono na Rysunku 1). Nazwę pliku źródłowego (format xls) i nazwę arkusza dla danych wejściowych, a także pożądaną nazwę pliku wyjściowego (format xls), edytuje się bezpośrednio w skrypcie.
- Uruchom program „kim_interface.py” (również napisany w Python 2.6; patrz Rysunek 2) i zaimportuj dane z pliku wygenerowanego w poprzednim kroku. W szczególności analiza opiera się na przeglądaniu i analizowaniu liczby detekcji każdej wartości KI („KI hits”). W związku z tym program wyświetla wykres słupkowy wystąpień KI dla każdej wartości KI.
- Oceń wystąpienia KI dla określonych podzbiorów próbek, analizując każdą grupę powtórzeń technicznych razem. Aby to zrobić, analizuj każdą próbę lub zmienną oddzielnie, zaznaczając lub odznaczając odpowiednie pola wyboru. Szczegółowy opis funkcji graficznego interfejsu użytkownika (GUI) znajduje się w podpisie do Rysunku 2.
- Po określeniu szerokości każdego okna KI za pomocą GUI, wybierz losowo niektóre z odpowiadających im chromatogramów w oprogramowaniu Microsense i oceń nakładanie się pików w powtórzeniach technicznych. Przykład nałożonych na siebie chromatogramów dwóch powtórzeń technicznych przedstawiono na Rysunku 3.
- Po wyznaczeniu okna KI użyj funkcji „Merge” dostępnej w GUI, aby połączyć wartości KI mieszczące się w oknie z najbardziej liczną wartością KI. Dzięki tej funkcji piki oznaczone zakresem wartości KI są konsolidowane pod jedną etykietą KI, co pozwala traktować takie piki jako jedną zmienną.
Aby to zrobić, najpierw kliknij przycisk „Merge”, aby aktywować tę funkcję, a następnie wybierz najbardziej liczne KI jako centrum okna, klikając lewym przyciskiem myszy odpowiedni słupek. Po wybraniu słupek zmienia kolor na zielony. Aby połączyć wartości KI mieszczące się w oknie z wybranym KI, kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiednie słupki; spowoduje to zmianę koloru słupków na czerwony, a nad centralnym KI zostanie dodany niebieski słupek o odpowiedniej długości (patrz Rysunek 4). Gdy wszystkie wybrane wartości KI zostaną połączone z odpowiednim centralnym KI, kliknij ponownie przycisk „Merge”, aby zatwierdzić zmiany; spowoduje to zmianę koloru przycisku „Merge” na żółty. W przypadku pomyłek dostępny jest również przycisk „Unmerge”. Aby cofnąć łączenie, kliknij przycisk „Unmerge” w GUI, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony słupek, który chcesz odłączyć. Słupek zmieni kolor z czerwonego na niebieski. Kliknij ponownie przycisk „Unmerge”, aby zatwierdzić zmiany. - W przypadku próby błędnego połączenia dwóch pików w jednej próbce w jedną wartość KI, wyświetlony zostanie komunikat o błędzie. W takiej sytuacji dokładnie sprawdź chromatogram i przedefiniuj okno KI w tym regionie.
- Po przeprowadzeniu wszystkich operacji łączenia zapisz plik.
- Przed przystąpieniem do analizy statystycznej przeanalizuj chromatogramy prób ślepych powietrza i fiolek, aby monitorować możliwe zanieczyszczenia. Po zidentyfikowaniu wartości KI pików w próbkach ślepych, odejmij pole powierzchni piku wykrytego w ślepej próbie powietrza i/lub fiolki od pola powierzchni piku obecnego w próbce.
Następnie przystąp do analizy statystycznej.
4. Reprezentatywne wyniki
Elektroniczny nos był w stanie wykryć różnice w profilach lotnych związków w owocach melona zbieranych w różnych stadiach dojrzałości (Rysunek 5). W obrębie wszystkich próbek zidentyfikowano dwadzieścia okien KI. Analiza wariancji wykazała, że 14 pików wykrytych przez elektroniczny nos różniło się istotnie w zależności od stadium dojrzałości. Na Rysunku 6 przedstawiono logarytm średnich pól pików tych 14 komponentów, aby ukazać różnice w ich liczności pomiędzy dwoma stadiami dojrzałości: owocami wczesnodojrzałymi oraz w pełni dojrzałymi.
Rysunek 1. Przykłady formatu danych eksportowanych z oprogramowania instrumentu (A) oraz po transformacji wykonanej za pomocą skryptu „reform_data.py” (B). Aby ułatwić manipulację i analizę danych, wszystkie unikalne KI są identyfikowane we wszystkich próbkach, a następnie dane są reorganizowane tak, aby informacje o próbkach znajdowały się w wierszach, a powierzchnie pików w kolumnach, odpowiadających unikalnym KI. Jeśli dla danej wartości KI w próbce nie wykryto piku, odpowiadająca mu komórka pozostaje pusta.
Rycina 2. Zrzut ekranu z pliku skryptu „kim_interface.py”. Wykres w centrum przedstawia liczbę trafień na KI w funkcji KI. „Trafienia na KI” to liczba próbek, w których wykryto pik o konkretnej wartości KI. Po lewej stronie znajdują się trzy żółte pola służące do sterowania wybranymi danymi. Wyświetlają one parametry służące do podziału zbioru danych (zabiegi, powtórzenia, zmienne jakościowe itp.). Na tej rycinie są to (od góry do dołu): odmiana, data sadzenia oraz stadium dojrzałości podczas zbiorów. Na dole: poprzez kliknięcie w trzy paski i przesuwanie niebieskiego suwaka w lewo lub w prawo można wybrać wartość minimalną i maksymalną zakresu KI oraz minimalną powierzchnię piku („Threshold”). Po prawej stronie: przycisk „Merge” umożliwia łączenie wybranych wartości KI poprzez ręczne klikanie w paski na wykresie. Przycisk „Unmerge” pozwala cofnąć ten proces dla wybranych przypadków.
Rysunek 3. Nałożone na siebie chromatogramy (czarny i czerwony) dwóch powtórzeń technicznych z przestrzeni nad próbką lotnych związków melona, ilustrujące przesunięcie czasu retencji.
Rycina 4. Przykład procedury scalania KI. Na środkowym wykresie zielony słupek (Central KI) reprezentuje najliczniejsze KI, które zostało wybrane jako centrum okna KI. KI X oraz KI Y to KI mieszczące się w interesującym nas oknie, które muszą zostać scalone z centralnym KI. Po kliknięciu prawym przyciskiem myszy na słupku KI X zmienia on kolor na czerwony, a jednocześnie nad zielonym słupkiem pojawia się niebieski słupek o tej samej długości co słupek KI X. Powtórzenie tej samej procedury dla KI Y spowoduje zwiększenie długości niebieskiego słupka (Merged KIs) o odpowiadającą mu wartość. Po dodaniu wszystkich KI, kliknięcie zielonego przycisku „Merge” kończy proces scalania, zmiany zostają zapisane, a kolor przycisku zmienia się na żółty.
Rycina 5. Dwa chromatogramy próbek melona zebranych w różnych stadiach dojrzałości, wczesnej (góra) i pełnej (dół), ilustrujące zdolność elektronicznego nosa do wykrywania różnic w zawartości związków lotnych.
Rycina 6. Wykres radarowy przedstawiający powierzchnie pików 14 składników obecnych w dwóch próbkach melona na dwóch różnych etapach dojrzałości: wczesnej dojrzałości i pełnej dojrzałości. Powierzchnie pików przedstawiono w skali logarytmicznej, aby ułatwić wizualizację porównania. Liczby na końcach każdego promienia reprezentują odpowiadające im indeksy Kovatsa.
Dyskusja
Elektroniczne nosy stanowią obiecującą metodę szybkiej, obiektywnej oceny profilów aromatycznych owoców lub próbek bogatych w substancje lotne. Jednak przesunięcia czasu retencji stanowią wyzwanie dla identyfikacji piku i mogą prowadzić do błędnej interpretacji danych, gdy dwa chromatogramy nie są idealnie dopasowane. Inspekcja wizualna chromatogramów wykazała, że zmienność czasów retencji między próbkami często powodowała, iż ten sam pik był oznaczany nieco różnymi wartościami KI (około ±10). Przekładało się to na zawyżoną liczbę wykrytych unikalnych KI. Aby wykorzystać fakt, że (a) na różnych etapach dojrzałości występują różne związki oraz (b) powtórzenia techniczne są niemal identyczne, opracowano dwa skrypty komputerowe („kim_merge.py”, zawierający procedury obsługi zestawu danych, oraz „kim_interface.py”, zapewniający graficzny interfejs użytkownika (GUI)), aby systematycznie porównywać próbki w sposób półautomatyczny, co znacznie skróciło czas potrzebny na analizę chromatogramów w dużych zestawach danych. Programy te umożliwiają, w stosownych przypadkach, konsolidację pików oznaczonych zakresem wartości KI pod jedną etykietą KI. Służy to dwóm ważnym celom: (a) umożliwia analizie statystycznej traktowanie takich pików jako jednej zmiennej oraz (b) ułatwia identyfikację pików i ich porównanie z innymi systemami oraz opublikowanymi wartościami. Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że próbki melona można rozróżnić na podstawie dojrzałości i profilowania aromatu przy użyciu systemu zNose w połączeniu z odpowiednią identyfikacją KI. Stanowi to obiecującą nową technologię analizy substancji lotnych, która może być wykorzystana w programach kontroli jakości.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Billowi Copesowi (Harris Moran Seed Company, Davis) za dostarczenie owoców melona do niniejszej analizy. Projekt ten jest finansowany z programu grantowego Specialty Crops Research Initiative Competitive Grants Program, grant nr 2009-51181-05783 z USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek wapnia | MP Biomedicals | 195088 | |
| izowaleronian 2-metylobutylu | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%, naturalny, FCC |
| Metanol | Fisher Scientific | A411-4 | |
| Fiolka | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| Nakrętka | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| Blender laboratoryjny | Laboratorium Waringa | 7009G | blender dwubiegowy; szklany pojemnik o pojemności 1 litra |
| Butelka | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex, 500 ml; z polipropylenową zatyczką uszczelniającą |
| Igła | Technologia czujników elektronicznych | TLC101046 | boczny otwór luer |
| roztwór alkanów | Technologia czujników elektronicznych | roztwór alkanów C6-C14 w metanolu | |
| zNose | Technologia czujników elektronicznych | Model 4500 | |
| kolumna GC DB-5 | Technologia czujników elektronicznych | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Technologia czujników elektronicznych | Wersja 5.44.22 | |
| Python 2.6 | Wolno dostępne online | ||
| "reform_data.py" i "kim_interface.py" skrypty | Skrypty dostępne jako materiały uzupełniające w JoVE |
Bibliografia
- Kader, A. A. Flavor quality of fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).
- Persaud, K., Dodd, G. Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose. Nature. 299, 352-355 (1982).
- Gardner, J. W., Bartlett, P. N. A brief-history of electronic noses. Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).
- Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. Electronic nose: Current status and future trends. Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).
- Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose. Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).
- Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection. J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).
- Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species. J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).
- Watkins, P., Wijesundera, C. Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds. Talanta. 70, 595-601 (2006).
- Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose. Food Chem. 89, 507-518 (2005).
- Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein. Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).
- Evans, M. B., Haken, J. K. Recent developments in the gas-chromatographic index scheme. Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).
Przedruki i uprawnienia
