Pomiar aktywności czynnika V w osoczu ludzkim za pomocą testu krzepnięcia mikropłytek

Summary

To badanie opisuje nowy test mikropłytkowy, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepów fibryny w ludzkim osoczu, co nie zostało wcześniej zgłoszone. Metoda wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405 nm podczas tworzenia skrzepów fibryny w ludzkim osoczu.

Abstract

W odpowiedzi na uraz, aktywowana jest krzepliwość krwi, która powoduje wytwarzanie proteazy krzepnięcia, trombiny. Trombina rozszczepia fibrynogen na fibrynę, która tworzy nierozpuszczalny skrzep, który zatrzymuje krwotok. Czynnik V (FV) w swojej aktywowanej formie, FVa, jest krytycznym kofaktorem dla proteazy FXa i akceleratorem wytwarzania trombiny podczas tworzenia skrzepów fibryny w ramach protrombinazy ^{1, 2}. Ręczne testy FV zostały opisane ^{3, 4}, ale są one czasochłonne i subiektywne. Zautomatyzowane testy FV zostały zgłoszone ^5-7, ale analizator i odczynniki są drogie i na ogół zapewniają tylko czas krzepnięcia, a nie szybkość i zakres tworzenia fibryny. Platforma mikropłytkowa jest preferowana do pomiaru zdarzeń katalizowanych enzymami ze względu na wygodę, czas, koszty, małą objętość, ciągłe monitorowanie i wysoką przepustowość ^{8, 9}. Testy mikropłytek zgłaszano dla lizy skrzepów ¹⁰, agregacji płytek krwi ¹¹ i czynników krzepnięcia ¹², ale nie dla aktywności FV w ludzkim osoczu. Celem metody było opracowanie testu mikropłytki, który mierzy aktywność FV podczas tworzenia fibryny w ludzkim osoczu.

Ta nowatorska metoda mikropłytek przedstawia prosty, tani i szybki test aktywności FV w ludzkim osoczu. Test wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do monitorowania zmiany absorbancji przy 405 nm podczas tworzenia fibryny w ludzkim osoczu (ryc. 1) ¹³. Test dokładnie mierzy czas, szybkość początkową i zakres tworzenia się skrzepów fibryny. Wymaga tylko μl ilości osocza, jest kompletny w ciągu 6 minut, ma wysoką przepustowość, jest wrażliwy na 24-80pM FV i mierzy ilość niezamierzenie aktywowanej (aktywność 1-etapowa) i aktywowanej trombiną FV (aktywność 2-etapowa), aby uzyskać pełną ocenę jego całkowitej aktywności funkcjonalnej (aktywność 2-etapowa - aktywność 1-etapowa).

Rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe (DIC) to nabyta koagulopatia, która najczęściej rozwija się z wcześniej istniejących infekcji ¹⁴. DIC wiąże się ze złym rokowaniem i zwiększa śmiertelność powyżej istniejącej wcześniej patologii ¹⁵. Test został wykorzystany do wykazania, że u 9 pacjentów z DIC 1-etapowa, 2-etapowa i całkowita aktywność FV były zmniejszone średnio odpowiednio o 54%, 44% i 42% w porównaniu z normalnym puli ludzkiego osocza referencyjnego (NHP).

Test mikropłytek FV można łatwo dostosować do pomiaru aktywności dowolnego czynnika krzepnięcia. Test ten poszerzy naszą wiedzę na temat biochemii FV poprzez dokładniejszy i pełniejszy pomiar jej aktywności w warunkach badawczych i klinicznych. Informacje te będą miały pozytywny wpływ na środowisko opieki zdrowotnej dzięki wcześniejszej diagnozie i opracowaniu skuteczniejszych metod leczenia zaburzeń krzepnięcia, takich jak DIC.

Protocol

1. Przygotowanie ludzkiego osocza z niedoborem FV

1. Metoda ta jest modyfikacją procedury pierwotnie opisanej przez Blooma i wsp.4.
2. Uzyskaj pełną krew ludzką od zdrowego dorosłego ochotnika (mężczyzny lub kobiety, w wieku od 18 do 50 lat), który nie przyjmuje żadnych leków. Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić rękawice lateksowe i fartuch laboratoryjny.
3. Przygotować 100 ml 3,2% (w/v) cytrynianu trisodowego w wodzie destylowanej. Załadować 6,0 ml tego roztworu do oddzielnych strzykawek o pojemności 60 ml. Usunąć powietrze, ostrożnie wciskając tłok do oznaczenia 6,0 ml na strzykawce.
4. Użyj wacika nasączonego alkoholem, aby oczyścić obszar żyły łokciowej między bicepsem a przedramieniem. Podłączyć aparat motylkowy o rozmiarze 20 do strzykawki o pojemności 3 ml. Wprowadzić igłę motylkową do żyły łokciowej i delikatnie pociągnąć tłokiem, aż krew wypełni się do oznaczenia 3 ml. Wyrzucić strzykawkę z krwią. Ten etap jest wykonywany w celu usunięcia wszelkich czynników tkankowych uwolnionych z uszkodzonego śródbłonka w miejscu zranienia igły, który może aktywować proces krzepnięcia i zakłócać przygotowanie osocza z niedoborem FV.
5. Podłączyć igłę motylkową do strzykawki o pojemności 60 ml "załadowanej" 6,0 ml cytrynianu trisodowego i delikatnie pociągać za tłok, aż krew osiągnie oznaczenie 60 ml na strzykawce. (Końcowe stężenie cytrynianu 10,9 mM).
6. Wyjąć strzykawkę z igły motylkowej i delikatnie wymieszać strzykawkę, trzymając palec lub kciuk w rękawiczce na wylocie strzykawki.
7. Kontynuować pobieranie krwi do 60 ml strzykawek, z których każda wypełniona jest 6,0 ml 3,2% cytrynianu trisodowego, jak opisano powyżej. Należy spodziewać się odzyskania około 50% objętości krwi cytrynowanej w postaci osocza po odwirowaniu i że wymagane jest 50 μl osocza z niedoborem FV na próbkę w teście mikropłytki. Nasze laboratorium rutynowo przetwarza 300-420 ml krwi cytrynianowej jednorazowo za pomocą strzykawek 5-7 x 60 ml, każda zawierająca 6,0 ml 3,2% cytrynianu trisodowego/strzykawki. Jest to osocze z niedoborem FV wystarczające do przeprowadzenia około 3000 testów na mikropłytkach (patrz poniżej).
8. Wyjąć igłę motylkową z ramienia ochotnika i przycisnąć sterylny gazik do miejsca nakłucia żyły przez 1,0 min. Zakryj miejsce wkłucia żyły sterylnym bandażem.
9. Odwirować cytrynowaną krew w stężeniu 3 300 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odzyskaj górną warstwę żółtego osocza do plastikowej zlewki z mieszadłem za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia, uważając, aby nie naruszyć dolnej warstwy czerwonych i białych krwinek.
10. Zmierzyć objętość osocza w ml i zachować 100 μl osocza przed dodaniem EDTA na lodzie do przyszłych testów czasu krzepnięcia protrombiny (PT) (patrz poniżej).
11. Powoli dodawaj stałe EDTA do cytrynowanego osocza, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej, aby osiągnąć 5 mM (stężenie końcowe). Po rozpuszczeniu EDTA dostosuj pH do 7,0 przez kroplowe dodawanie 1,0 M NaOH z delikatnym mieszaniem.
12. Przykryj zlewkę środkiem Saran Wrap i inkubuj przez 8-10 godzin bez mieszania w temperaturze 37 °C.
13. Co 2 godziny odzyskuj 100 μl osocza poddanego działaniu EDTA na lodzie i oznacz PT w czasie inkubacji z EDTA i porównaj z PT osocza przed dodaniem EDTA (patrz wyżej).
14. W celu oznaczenia PT należy umieścić wyjmowane 8-dołkowe paski immunomodułu w plastikowym uchwycie na szablon i włożyć do czytnika mikropłytek.
15. Zorientuj paski immunomodułu w czytniku mikropłytek jako: puste, puste, próbka, puste, puste, próbka, puste i puste od lewej do prawej w uchwycie szablonu, aby zminimalizować interferencję rozpraszania światła od sąsiednich pasków zawierających próbkę. Należy również używać tylko dołków 2-7 od góry do dołu w każdym 8-dołkowym pasku immunomodułu, aby zminimalizować zakłócenia rozpraszania światła od krawędzi plastikowego uchwytu szablonu.
16. Test mikropłytek FV jest w stanie zmierzyć tworzenie się skrzepów fibryny w co najmniej 12 różnych próbkach jednocześnie (6 próbek na pasek immunomodułu na 2 paski immunomodułowe).
17. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) do każdej studzienki mikropłytki dla każdej próbki, która ma być oznaczona. Za pomocą jednej pipety dodać 50 μl normalnego ludzkiego zbiorczego osocza referencyjnego (NHP) lub osocza przed dodaniem EDTA lub w różnym czasie inkubacji po dodaniu EDTA do oddzielnych studzienek na mikropłytkę.
18. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl tromboplastyny (patrz poniżej metoda przygotowania) do wszystkich studzienek mikropłytek z osoczem, które mają być oznaczone. Inkubować w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 °C przez 1 minutę i zaprogramować czytnik mikropłytek tak, aby wstrząsał płytką w ciągu 15-25 sekund inkubacji trwającej 1 minutę.
19. Korzystając z komputera połączonego z czytnikiem mikropłytek, uzyskaj dostęp do aplikacji do mikropłytek w oprogramowaniu SoftMax Pro. Ustaw czytnik na Absorbancja, długość fali na 405 nm, tryb na Kinetyczny, temperaturę na 25 °C i zaprogramuj czytnik mikropłytek tak, aby wstrząsał przez 5 sekund i odczytywał absorbancję przy 405 nm co 5 sekund przez 6 minut.
20. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj chlorek wapnia (50 μl z 25 mM w wodzie destylowanej; stężenie końcowe 2,1 mM) do wszystkich studzienek mikropłytki, odczekaj 15 sekund i naciśnij ikonę "Start" w menu mikropłytki SoftMax Pro, aby rozpocząć test.
21. Określ PT na podstawie profili absorbancji w funkcji czasu w SoftMax Pro jako czas osiągnięcia połowy maksymalnego wzrostu absorbancji przy 405 nm (punkt środkowy krzywej absorbancji esicy w funkcji czasu wytworzonej po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia. Patrz poniżej, rysunek 1).
22. Oblicz aktywność FV 1-etapową na podstawie logarytmicznego czasu krzepnięcia (s) w funkcji logarytmu aktywności FV (jednostki/ml), jak pokazano poniżej na rysunku 2A. Do celów ilościowych 1 Jednostka aktywności FV jest definiowana jako aktywność obecna w 1,0 ml NHP przed celową aktywacją z dodatkiem trombiny (patrz poniżej, Oznaczanie próbek osocza ludzkiego za pomocą 1-etapowego i 2-etapowego testu krzepnięcia mikropłytek FV).
23. Przygotuj 4,0 l 20 mM HEPES zawierających 0,15 M NaCl w wodzie destylowanej, delikatnie mieszając. Dostosuj pH do 7,4 z powolnym dodawaniem kroplami 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
24. Zaopatrzyć się w odpowiednią długość rurki do dializy i dokładnie spłukać wodą destylowaną. Zawiąż węzeł na jednym końcu rurki. Przenieś osocze poddane działaniu EDTA do rurki dializacyjnej za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia, usuń powietrze i zawiąż węzeł na drugim końcu rurki.
25. Ostrożnie zawieś osocze poddane działaniu EDTA w rurkach do HBS, delikatnie mieszając. Przykryj Saran Wrap i dializuj przez 14-16 godzin, delikatnie mieszając w temperaturze 4 °C.
26. Ostrożnie usunąć osocze poddane działaniu EDTA/dializowane w probówkach z zakrętką o objętości od 3,0 ml do 15,0 ml i zachować 100 μl do oznaczenia PT "ostatecznego" osocza z niedoborem FV na lodzie. Osocze z niedoborem FV należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. W warunkach opisanych powyżej, PT wzrastają od 10-15 sekund przed addycją EDTA do 90-100 sekund 8-10 godzin po dodaniu EDTA. Osocze z niedoborem FV przygotowane tą metodą rutynowo zawiera mniej niż 0,1% aktywnego FV obecnego w początkowym świeżym osoczu ludzkim.

2. Przygotowanie tromboplastyny

1. Dializa jest wymagana w celu usunięcia wapnia z tego odczynnika, aby umożliwić precyzyjne określenie czasu tworzenia się skrzepów fibrynowych od momentu dodania chlorku wapnia w celu zainicjowania procesu krzepnięcia.
2. Przygotować 100 ml i 4,0 l 20 mM HEPES i 0,15 M NaCl w wodzie destylowanej w plastikowej zlewce, delikatnie mieszając. Dostosuj pH do 7,4 z powolnym dodawaniem kroplami 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
3. Dodać 6,0 ml HBS o pH 7,4 do każdej fiolki odczynnika tromboplastyny, założyć pokrywkę i delikatnie wstrząsnąć do rozpuszczenia. Inkubować odczynnik w zakorkowanych fiolkach przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu rozpuszczenia wysuszonego materiału. Delikatnie wstrząśnij, aż do całkowitego rozpuszczenia.
4. Odciąć odpowiednią długość rurki do dializy, dobrze spłukać wodą destylowaną i związać jeden koniec rurki węzłem. Przenieść tromboplastynę do rurki dializowej, usunąć powietrze i związać drugi koniec rurki węzłem.
5. Ostrożnie zawieś rurkę do dializy w 4,0 l HBS o pH 7,4 i delikatnie mieszaj pokrytą Saran Wrap w temperaturze 4 °C przez 14-16 godzin.
6. Przenieść 3,0 ml podwielokrotności dializowanej tromboplastyny do 15 ml zakręcanych probówek i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

3. Przygotowanie 1-etapowego testu koagulacji mikropłytek FV Standardowe krzywe aktywności

1. Rozmrażanie osocza z niedoborem FV, NHP i tromboplastyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Delikatnie wymieszać osocze z niedoborem FV i tromboplastynę niezależnie, przenieść na oddzielne plastikowe tacki do mycia i inkubować na lodzie. Przechowuj NHP na lodzie po delikatnym wymieszaniu. Chlorek wapnia (25 mM w wodzie destylowanej) należy przechowywać na osobnej tacy myjącej w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować po 200 μl po 2-krotne seryjne rozcieńczenia NHP z 0-, 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 128-, 256-, 512-krotnie w HBS, pH 7,4 za pomocą 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Dobrze wirować i inkubować na lodzie.
3. Umieść wyjmowane 8-dołkowe paski immunomodułu w plastikowym uchwycie szablonu i włóż do czytnika mikropłytek.
4. Zorientuj paski immunomodułu w czytniku mikropłytek jako: puste, puste, próbka, puste, puste, próbka, puste i puste od lewej do prawej w uchwycie szablonu, aby zminimalizować interferencję rozpraszania światła od sąsiednich pasków zawierających próbkę. Należy również używać tylko dołków 2-7 od góry do dołu w każdym 8-dołkowym pasku immunomodułu, aby zminimalizować zakłócenia rozpraszania światła od krawędzi plastikowego uchwytu szablonu.
5. Test mikropłytek FV jest w stanie zmierzyć tworzenie się skrzepów fibryny w co najmniej 12 różnych próbkach jednocześnie (6 próbek na pasek immunomodułu na 2 paski immunomodułowe).
6. Włącz czytnik mikropłytek i uzyskaj dostęp do oprogramowania do aplikacji mikropłytek SoftMax Pro.
7. Za pomocą pipety wielokanałowej należy jednocześnie dodać osocze z niedoborem FV (50 μl) do wszystkich dołków na mikropłytki próbki. Za pomocą jednej pipety dodać 50 μl z 10 seryjnych rozcieńczeń NHP przygotowanych powyżej, aby oddzielić studzienki na mikropłytki.
8. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać tromboplastynę (50 μl) do wszystkich dołków na próbki. Inkubować w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 °C przez 1 minutę i zaprogramować czytnik mikropłytek tak, aby wstrząsał płytką w ciągu 15-25 sekund 1-minutowej inkubacji.
9. Korzystając z komputera połączonego z czytnikiem mikropłytek, uzyskaj dostęp do aplikacji do mikropłytek w oprogramowaniu SoftMax Pro. Ustaw czytnik na Absorbancja, długość fali na 405 nm, tryb na Kinetyczny, temperaturę na 25 °C i zaprogramuj czytnik mikropłytek tak, aby wstrząsał przez pierwsze 5 sekund po dodaniu chlorku wapnia, a następnie mierz absorbancję przy 405 nm co 5 sekund przez 6 minut. 5-sekundowy interwał wytrząsania nie jest uwzględniany w obliczonych czasach krzepnięcia (patrz poniżej).
10. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj chlorek wapnia (50 μl z 25 mM w wodzie destylowanej; stężenie końcowe 3,5 mM) do wszystkich dołków mikropłytki próbki, odczekaj 15 sekund, naciśnij ikonę "Start" w aplikacji mikropłytki w SoftMax Pro z komputera, aby rozpocząć test.
11. Czasy krzepnięcia są obliczane jako czas w sekundach do osiągnięcia punktu środkowego między minimalną a maksymalną absorbancją przy 405 nm po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia.
12. Początkowe tempo tworzenia skrzepów oblicza się jako szybkość wzrostu absorbancji przy 405 nm (mUnits/min), która obejmuje pierwsze 5 punktów czasowych tworzenia się skrzepów w liniowej części krzywej absorbancji w funkcji czasu.
13. Zakres powstawania skrzepów obliczono jako różnicę między maksymalną a minimalną absorbancją przy 405 nm (jednostkach) osiągniętą podczas zdarzenia tworzenia się skrzepu.

4. Oznaczanie próbek ludzkiego osocza za pomocą FV 1-stopniowego i 2-stopniowego testu krzepnięcia mikropłytek

1. Rozmrażać osocze z niedoborem FV, NHP, próbkę osocza i tromboplastynę w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Delikatnie wymieszać osocze z niedoborem FV i tromboplastynę niezależnie, przenieść na oddzielne plastikowe tacki do mycia ELISA i inkubować na lodzie. Przechowywać NHP i próbkę osocza na lodzie po delikatnym wymieszaniu. Chlorek wapnia (25 mM w wodzie destylowanej) należy przechowywać w oddzielnej tacy myjącej ELISA w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować po 200 μl 40-krotnego rozcieńczenia NHP i próbki osocza w HBS, pH 7,4, używając 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Dobrze wirować i inkubować na lodzie.
3. Włóż wyjmowane 8-dołkowe paski immunomodułu do plastikowego uchwytu szablonu i włóż do czytnika mikropłytek.
4. Naprzemiennie puste, puste, próbki, puste, puste, próbki, puste i puste paski immunomodułu od lewej do prawej w uchwycie szablonu, aby zminimalizować interferencję rozpraszania światła od sąsiednich pasków zawierających próbkę. Używaj tylko studzienek 2-7 od góry do dołu w każdym pasku immunomodułu, aby zminimalizować zakłócenia rozpraszania światła od krawędzi plastikowego uchwytu szablonu.
5. Włącz czytnik mikropłytek i uzyskaj dostęp do oprogramowania do aplikacji mikropłytek SoftMax Pro.
6. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać osocze z niedoborem FV (50 μl) do wszystkich dołków na mikropłytki próbki. Za pomocą jednej pipety dodać 50 μl 40-krotnie rozcieńczonego NHP lub próbki osocza przygotowanej powyżej, aby oddzielić dołki na mikropłytki.
7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać tromboplastynę (50 μl) do wszystkich dołków na próbki. Inkubować w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 °C przez 1 minutę i zaprogramować czytnik mikropłytek tak, aby wstrząsał płytką w ciągu 15-25 sekund 1-minutowej inkubacji.
8. Korzystając z komputera połączonego z czytnikiem mikropłytek, uzyskaj dostęp do aplikacji do mikropłytek w oprogramowaniu SoftMax Pro. Ustaw czytnik na Absorbancja, długość fali na 405 nm, tryb na Kinetyczny, temperaturę na 25 °C i zaprogramuj czytnik mikropłytek tak, aby wstrząsał przez pierwsze 5 sekund po dodaniu chlorku wapnia, a następnie mierz absorbancję przy 405 nm co 5 sekund przez 6 minut. 5-sekundowy interwał wytrząsania nie jest uwzględniany w obliczonych czasach krzepnięcia (patrz poniżej).
9. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj chlorek wapnia (50 μl z 25 mM w wodzie destylowanej; stężenie końcowe 6,25 mM) do wszystkich studzienek na mikropłytki próbki i natychmiast naciśnij ikonę "Start" w aplikacji mikropłytki w SoftMax Pro z komputera, aby rozpocząć test.
10. Na koniec serii określ czas, początkową szybkość i zakres tworzenia się skrzepów dla 40-krotnie rozcieńczonego NHP i próbki osocza na podstawie profili absorbancji w funkcji czasu w SoftMax Pro.
11. Biorąc pod uwagę 40-krotne rozcieńczenie, należy użyć czasu krzepnięcia dla każdej próbki, aby obliczyć aktywność FV w jednostkach/ml z 1-stopniowej krzywej standardowej aktywności FV logarytmicznej czasu krzepnięcia w funkcji logarytmu aktywności FV (rysunek 2A). Reprezentuje to aktywność w stadium FV-1 lub bez "zamierzonej" aktywacji przez trombinę.
12. Ponieważ FV jest aktywowany trombiną do aktywnego kofaktora, FVa ¹, drugi test po dodaniu i inkubacji z trombiną ma kluczowe znaczenie dla dokładnego pomiaru 2-stopniowej aktywności FV próbki osocza (z "celową" aktywacją przez dodaną trombinę).
13. Do 2-etapowego testu FV przygotować 200-300 μl oczyszczonej trombiny ¹⁸ o temperaturze 100 nM w HBS, pH 7,4 i inkubować na lodzie. Planuje się użycie 10 μl rozcieńczonej trombiny dla każdej próbki osocza, która ma być oznaczona za pomocą 2-stopniowego testu FV.
14. Rozcieńczyć 120 μl powyższego NHP i pobrać próbkę osocza od 40-krotnie do 100-krotnie 170 μl HBS o pH 7,4 zawierającym 2,8 mM chlorku wapnia. Dodać 10 μl trombiny (stężenie końcowe 10 nM) do każdej próbki. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.
15. Rozcieńczyć NHP i próbkę osocza 500-krotnie, dodając 400 μl HBS, pH 7,4, studzienkę wirową i oznaczenie 50 μl każdej próbki osocza w 1-stopniowym teście mikropłytek FV, jak opisano powyżej.
16. Określ czas krzepnięcia dla NHP i każdej próbki osocza oznaczanej na podstawie profili absorbancji w funkcji czasu w SoftMax Pro. Biorąc pod uwagę 500-krotne rozcieńczenie, użyj czasu krzepnięcia dla każdej próbki, aby obliczyć 2-etapową aktywność FV na podstawie 1-stopniowej krzywej standardowej FV logarytmicznej czasu krzepnięcia w funkcji logarytmu aktywności FV (rysunek 2A).
17. Całkowita aktywność FV może być następnie obliczona jako FV 2-etapowa aktywność - FV 1-etapowa aktywność.

Results

Reprezentatywne wyniki - Przygotowanie standardowych krzywych aktywności testu koagulacji mikropłytek FV 1-etapowego

Reprezentatywny przykład tworzenia się skrzepów fibryny w teście FV w czasie, generowany przez czytnik mikropłytek, jest zilustrowany na rysunku 1. Test FV dokładnie mierzy czas, początkową szybkość i zakres tworzenia się skrzepów fibryny. Inspekcja studni po zakończeniu testu potwierdziła, że doszło do tworzenia się skrzepów. Wszystkie reakcje osiągnęły w przybliżeniu ten sam stopień tworzenia skrzepów z ogólną zmianą absorbancji przy 405 nm wynoszącą 0,35 - 0,45 jednostki między początkową absorbancją przed a maksymalną absorbancją po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia. Reprezentatywne przykłady standardowych krzywych aktywności 1-etapowej FV logarytmicznej czasu skrzepu (w sekundach) w porównaniu z aktywnością logarytmu FV (jednostki/ml) i początkową szybkością tworzenia skrzepów logarytmiczną (w mjednostkach/min) w porównaniu z aktywnością logarytmiczną FV (jednostki/ml) dla seryjnych rozcieńczeń NHP pokazano odpowiednio na rysunku 2A i rysunku 2B. Dopasowanie wykresu Log-Log czasu krzepnięcia w stosunku do aktywności FV 1 wykazało silny związek między tymi zmiennymi po analizie regresji liniowej (Rysunek 2A; R² = 0,980). Dopasowanie wykresu Log-Log początkowego tempa tworzenia skrzepów w stosunku do aktywności FV również wykazało silny związek między tymi zmiennymi po analizie regresji liniowej (Rysunek 2B; R² = 0,983). Zależność zarówno logarytmicznego czasu skrzepu, jak i logarytmicznej początkowej szybkości tworzenia skrzepów w stosunku do aktywności logarytmu FV pozostała liniowa dla NHP rozcieńczonego do 512-krotnie. Ponieważ FV krąży w NHP przy około 12-40nM ¹⁶, test mikropłytki jest wrażliwy na około 24-80pM FV w NHP. Biorąc pod uwagę, że stała dysocjacji oddziaływania lipidu FVa-FXa w protrombinazie wynosi około ^{1nM 17}, test mikropłytek FV jest całkowicie odpowiedni do pomiaru poziomów FV w fizjologicznie istotnym zakresie nM dla funkcji FVa w protrombinazie.

Korzystając z testu mikropłytek FV, ustalono również, że normalny zakres aktywności FV w teście aktywności FV 1-etapowej 15 zdrowych osocza kontrolnego (mężczyzna i kobieta, wiek 18-20 lat) wynosił (średnia ± odchylenie standardowe; Zakres): 0,96 ± 0,14 U/ml; 0,68-1,11U/ml. Zgadza się to dobrze z normalną zdrową aktywnością i zakresem FV (0,66-1,14 U/ml) zgłoszonym przez Cutlera i wsp. dla aktywności FV 1-etapowej wyznaczonej za pomocą automatycznego analizatora ⁷. Zmienność wewnątrztestowa czasu, zakresu i początkowej szybkości tworzenia się skrzepów w teście FV 1-etapowym w 6 dołkach w 8 różnych dniach wynosiła odpowiednio 3,4%, 4,4% i 3,1%. Zmienność między testami czasu, zakresu i początkowej szybkości tworzenia się skrzepów w teście FV 1-etapowym w 6 dołkach 8 różnych eksperymentów w 8 różnych dniach wynosiła odpowiednio 7,1%, 7,8% i 9,2%. W związku z tym zmienność w teście i między tymi trzema mierzonymi zmiennymi była na niskim i akceptowalnym poziomie dla solidnej wydajności testu w obrębie i między testami mikropłytek wielu próbek jednocześnie (do 12).

Reprezentatywne wyniki - Oznaczanie próbek ludzkiego osocza za pomocą FV 1-stopniowego i 2-stopniowego testu koagulacji mikropłytek

Standardowa krzywa logarytmu czasu krzepnięcia w porównaniu z aktywnością logarytmu FV (Rysunek 2A) została użyta do zmierzenia aktywności FV w osocza pacjenta NHP i 9 DIC, które nie zostały celowo aktywowane z dodatkiem trombiny (aktywność FV 1-etapowa) lub zostały celowo aktywowane z dodaną trombiną (aktywność FV 2), a wyniki są pokazane w Tabeli 1. Wszystkie 9 osocza pacjentów z DIC wykazywało aktywność w stadium FV 1 i początkowe tempo tworzenia skrzepów, które zmniejszyły się średnio odpowiednio o 54% i 18% w porównaniu z NHP. Stopień tworzenia skrzepów w teście FV 1-etapowym u pacjentów z DIC nie różnił się znacznie od NHP i wzrastał średnio o 13% w stosunku do NHP.

Aktywacja NHP za pomocą trombiny wygenerowała około 8-krotny wzrost aktywności FV 2-etapowej powyżej aktywności FV 1-etapowej (Tabela 1). Wskazuje to, że FV w NHP był obecny głównie w postaci nieaktywowanej i zgadza się z wcześniej zgłoszonymi wynikami przy użyciu ręcznych testów FV z rurką przechylną ^{3, 4} i automatycznych testów FV ^5-7. Aktywność FV 2-etapowa i całkowita była również zmniejszona u pacjentów z DIC średnio o 44% i 42% z NHP. Początkowe tempo i zakres tworzenia się skrzepów w teście FV 2-etapowym u pacjentów z DIC nie różniły się istotnie od NHP i różniły się średnio odpowiednio o około 9% i 4% od obserwowanego w przypadku NHP. Wyniki te wskazały, że w porównaniu z FV w NHP, FV w osoczu pacjenta DIC skutkowało wydłużonym czasem i zmniejszoną szybkością tworzenia się skrzepów fibryny, a FV pacjenta było średnio tylko w 56% tak aktywowane z trombiną.

Rysunek 1. Tworzenie się skrzepów w normalnym puli ludzkiego osocza referencyjnego mierzone za pomocą kinetycznego 1-stopniowego testu krzepnięcia FV na mikropłytce. Tworzenie się skrzepów fibryny w NHP było stale monitorowane przy 405 nm za pomocą kinetycznego czytnika mikropłytek. Wykres jest wyjściem czytnika mikropłytek z 6-minutowej reakcji 32-krotnie rozcieńczonego NHP, osocza z niedoborem FV, tromboplastyny i chlorku wapnia w studzience mikropłytki. Oś pionowa reprezentuje zmianę absorbancji przy 405 nm, która nastąpiła w wyniku tworzenia się fibryny w osoczu. Czas powstawania fibryny zdefiniowano jako czas osiągnięcia połowy maksymalnego wzrostu absorbancji lub punktu środkowego krzywej (36,40 s). Początkowa szybkość tworzenia skrzepów została zdefiniowana jako szybkość zmiany absorbancji przy 405 nm w ciągu pierwszych 5 punktów czasowych liniowego wzrostu części absorbancji krzywej (611,88 mUnits/min). Stopień tworzenia się skrzepów zdefiniowano jako różnicę między maksymalną i minimalną absorbancją przy 405 nm (0,35 jednostki).

Rysunek 2. Standardowe krzywe czasu i początkowej szybkości tworzenia się skrzepów w funkcji aktywności czynnika V w normalnym puli ludzkiego osocza referencyjnego przy użyciu 1-stopniowego testu mikropłytki FV. NHP rozcieńczano seryjnie (od 0 do 512 razy w HBS) i oznaczano za pomocą 1-stopniowego testu mikropłytki FV, jak opisano w protokole. Wykresy logarytmiczne czasu i początkowej szybkości tworzenia się skrzepów w funkcji aktywności FV w 1-stopniowym teście mikropłytek FV pokazano po modelowaniu regresji liniowej danych odpowiednio w panelach A i B.

próbka Test 1-etapowy Aktywność (jednostki/ml) Test 1-etapowy Zasięg (jednostki) Test 1-stopniowy Szybkość początkowa (mUnits/min) Test 2-etapowy Aktywność (jednostki/ml) Test 2-etapowy Zakres (jednostki) Test 2-stopniowy Szybkość początkowa (mUnits/min) Całkowita aktywność (jednostki/ml) Narodowość Pytanie 1,02 0,363 pkt. 744,96 pkt. 7,93 pkt. 0,433 pkt. 375,84 pkt. 6,91 pkt. Pacjent 1 0,36 pkt. 0,404 pkt. 583,80 zł 3,84 pkt. 0,432 pkt. 249,96 TGL Rejon 3,48 Pacjent 2 0,67 pkt. 0,416 704.04 TGL Klasa 5,28 0,469 pkt. 323,16 TGL Norma 4,61 pkt. Pacjent 3 0,31 pkt. 0,435 pkt. 562.08 SZT. 3,92 pkt. 0,453 pkt. Kwota 294,96 TGL Pytanie 3,61 Pacjent 4 0,39 pkt. 0,435 pkt. 617.04 szt. Rozdział 4.14 0,462 pkt. 372,60 pkt. Klasa 3,75 Pacjent 5 0,73 pkt. 0,401 pkt. 641,40 zł Klasa 5,91 0,433 pkt. 354,24 pkt. Norma 5,18 Pacjent 6 0,45 pkt. 0,403 pkt. 600,72 TGL Rozdział 4.16 0,445 pkt. 393,96 zł Rejon 3,71 Pacjent 7 0,49 pkt. 0,395 pkt. 575,40 zł Godzina 4,89 0,449 357,48 pkt. Godzina 4.40 Pacjent 8 0,19 pkt. 0,448 pkt. Godzina 489,00 zł Klasa 2,89 0,450 pkt. 330,48 pkt. Godzina 2,70 Pacjent 9 0,64 pkt. 0,423 pkt. 699,48 pkt. Klasa 5.11 0,455 pkt. 417,24 pkt. Godzina 4,47

Tabela 1 Aktywność FV w NHP i u 9 pacjentów, u których rozwinęło się rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe (DIC). Aktywność FV 1-etapowa, 2-etapowa i całkowita w osoczu pacjenta NHP i 9 DIC została określona na podstawie standardowej krzywej czasu tworzenia się skrzepu w stosunku do aktywności FV w teście mikropłytki FV (Figura 2A) i są podane w jednostkach / ml. Pokazano również początkowe tempo tworzenia się skrzepów (początkowe tempo wzrostu A405 nm w pierwszych pięciu punktach czasowych w mjednostkach/min) i zakresy (maksimum A405 nm - minimum A405 nm) w 1- i 2-stopniowym teście mikropłytek FV.

Discussion

Metoda kinetycznego oznaczania mikropłytek nakreśla opracowanie nowatorskiej, szybkiej, niedrogiej i wygodnej techniki pomiaru aktywności krzepnięcia FV w próbkach ludzkiego osocza, które nie zostały poddane (test FV 1-etapowy) lub zostały celowo aktywowane dodatkiem trombiny (test 2-etapowy FV). Test wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek, a wszystkie wymagane materiały i odczynniki są dostępne na rynku lub mogą być wytwarzane we własnym zakresie. Test w sposób ciągły monitoruje zmianę rozproszenia światła osocza podczas tworzenia skrzepów fibryny przy 405 nm. Test mikropłytek ma tę zaletę, że wykorzystuje małe objętości próbek osocza (μl) i nadaje się do jednoczesnej analizy wielu próbek (do 12). Te atrybuty testu są korzystne, gdy używany jest drogi sprzęt i odczynniki (zautomatyzowane analizatory i osocze z niedoborem czynnika); dostępne są tylko małe objętości próbek (Osocze pacjenta) lub analizowanie dużej liczby próbek (podczas oczyszczania FV z osocza).

Test mikropłytek FV ma tę dodatkową zaletę, że jest wygodny, szybki i nie wymaga izolacji i oczyszczania wymaganych składników składowych. W porównaniu z ręcznymi testami z rurką przechylną ^{3, 4} i automatycznymi ^{testami 5-7} FV, które zostały zgłoszone, test mikropłytek FV ma porównywalny użyteczny zakres czasów krzepnięcia (25-75 sekund) i odpowiadających im poziomów FV w próbce (0,5-0,005 jednostek/ml) oraz granic czułości/wykrywalności (20-80pM). W porównaniu z ręcznymi testami FV z rurką przechylną, które podlegają subiektywnej wizualnej ocenie tworzenia się skrzepów ^{3, 4}, test mikropłytek FV umożliwia obiektywny i ilościowy pomiar czasu krzepnięcia, początkowej szybkości i zakresu tworzenia się skrzepów fibrynowych. W porównaniu z automatycznymi testami FV, które wymagają drogich analizatorów i odczynników ^5-7, odczynniki i materiały do testów mikropłytek FV są niedrogie, a wszystkie wymagane materiały można kupić komercyjnie lub wyprodukować we własnym zakresie. Ręczne testy z rurką przechylną ^{3, 4} i automatyczne ^{testy 5-7} FV na ogół zapewniają tylko czas tworzenia się skrzepu; nie czas, szybkość początkowa i zakres tworzenia się skrzepów fibryny, które są dokładnie mierzone spektrofotometrycznie za pomocą testu mikropłytek FV. Wreszcie, ręczne testy z rurką przechylną ^3,4 i automatyczne ^{testy 5-7} FV cierpią z powodu możliwości pomiaru aktywności FV w próbkach osocza tylko pojedynczo; podczas gdy test mikropłytkowy FV jest podatny na wysoką przepustowość i jednocześnie można badać 12 próbek.

Test mikropłytek wykorzystano do wykazania, że FV w osoczu pacjenta z 9 DIC było mniej aktywne niż w NHP ze względu na połączenie opóźnionych czasów krzepnięcia i niższych początkowych wskaźników tworzenia się skrzepów w teście FV 1-etapowym. Początkowe tempo tworzenia się skrzepów w teście FV 2-etapowym w osoczu pacjenta z DIC nie uległo zmianie w stosunku do NHP. Stopień tworzenia się skrzepów w osoczu pacjenta z DIC również nie uległ zmianie w stosunku do NHP w testach FV 1-etapowych i 2-etapowych. Zmniejszona aktywność FV 1-etapowa, 2-etapowa i całkowita mogła być spowodowana zwiększonym spożyciem FV ¹⁹ i / lub inaktywacją ⁶ , zgodnie z innymi badaniami podczas patogenezy tej nabytej choroby krwi. Biorąc pod uwagę, że zakres tworzenia się skrzepów w osoczu DIC był taki sam, jak obserwowano w przypadku NHP, zmienna ta była najprawdopodobniej wynikiem stężenia fibrynogenu w osoczu z niedoborem FV i nie była związana z charakterystyką osocza pacjenta.

Wyniki testu mikropłytek wykazały, że pomiar aktywności FV w próbkach osocza ludzkiego można uzyskać na podstawie czasu i początkowej szybkości tworzenia się skrzepów z testu FV 1-etapowego oraz czasu tworzenia się skrzepu i całkowitej aktywności z testu FV 2-etapowego. Nie było możliwe uzyskanie ilościowego pomiaru aktywności FV w próbce osocza w oparciu o stopień tworzenia się skrzepów w testach FV 1- i 2-etapowych lub początkową szybkość tworzenia się skrzepów w teście FV 2-etapowym. Biorąc pod uwagę, że wszystkie reakcje osiągnęły w przybliżeniu ten sam stopień tworzenia skrzepów wynoszący 0,35 - 0,45 jednostki między początkową absorbancją przed a maksymalną absorbancją po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia, pomiar stopnia powstawania skrzepów nie zapewnia ilościowej oceny aktywności FV w danej próbce osocza.

Nowatorski test mikropłytek znajdzie zastosowanie w warunkach badawczych i klinicznych do pomiaru aktywności FV w próbkach ludzkiego osocza i frakcjach podczas jego oczyszczania z osocza ludzkiego i zwierzęcego. Test mikropłytek może być stosowany do pomiaru czasu, początkowej szybkości i zakresu tworzenia się skrzepów; Parametry, które na ogół nie są monitorowane jednocześnie w ręcznych testach z rurką przechylną i automatycznych analizatorach krzepnięcia. Informacje te dostarczają bardziej kompletnej oceny ilościowej udziału FV podczas tworzenia się skrzepów w ludzkim osoczu, niż wcześniej podawano ^3-7. Informacje te są szczególnie ważne zarówno w laboratoriach badawczych, jak i klinicznych przy pomiarze istotnych zmian aktywności FV w próbkach osocza lub z oczyszczonym FV lub FVa. Test mikropłytek FV może być również stosowany do charakteryzowania i pomiaru związków, które mogą aktywować lub dezaktywować FV i FVa, pomiaru aktywności FV u pacjentów zagrożonych zakrzepicą żylną w wyniku mutacji FV Leiden ^{20, 21} oraz do monitorowania aktywności FV podczas jego oczyszczania z osocza.

Test mikropłytek FV można łatwo dostosować do pomiaru aktywności dowolnego czynnika krzepnięcia w szlaku zewnętrznym, wewnętrznym lub wspólnym przy użyciu odpowiedniego osocza z niedoborem czynnika i odczynników inicjujących tworzenie fibryny. Test poszerzy naszą wiedzę na temat biochemii FV poprzez dokładniejszy i pełniejszy pomiar jego aktywności w laboratoriach badawczych i klinicznych. Ostatecznie informacje te pozytywnie wpłyną na środowiska opieki zdrowotnej dzięki wcześniejszej diagnozie i opracowaniu skuteczniejszych metod leczenia osób cierpiących na zaburzenia krzepnięcia, takie jak DIC.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Czytnik mikropłytek kinetycznych	Urządzenia molekularne	Spectra Max 190	SOFTmax PRO 4.3 LS oprogramowanie
Normalne połączone ludzkie osocze referencyjne	Precision Biologicals	CCN-10
Cytrynian trisodowy	Becton Dickenson	B10242
EDTA	Becton Dickenson	B10093
Ludzkie osocze z niedoborem FV4			Wytwarzany ze świeżego osocza ludzkiego i przechowywany w porcjach w temperaturze -70 °C.
Strzykawki 3 i 60 ml	Becton Dickenson	309585 i 136898
Aparat motylkowy	Vacutainer	367251	20 gauge
HEPES	Sigma/Aldrich	H-3375
NaCl	Fisher	BP358-212
Tromboplastyna	Trinity Biotech	T1106	Dializowany vs. HBS, pH 7,4 i przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -70 & stopni C.
Chlorek wapnia	Becton Dickenson	B10070
Trombina15			Z osocza ludzkiego; przechowywany w temperaturze -20 ° C w 50% (v/v) glicerolu.
Membrana do dializy	Fisher	21-152-6	6-8kDa odcięcie masy cząsteczkowej; 50mm x 3m.
Uchwyt szablonu i wyjmowane paski 8 dołków.	Nunc	14-245-63 i 469957
tace do mycia ELISA	BioRad	224-4872
1,5 ml mikrofuge i 15 ml probówki z nakrętką.	Pipeta wielokanałowa Sarstedt	72690 i 62554205
	model 8-kanałowy	Fisher	2703630