Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Podsumowanie

Niniejsze badanie opisuje nowatorski test na mikropłytce, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie, co nie było wcześniej raportowane. Metoda ta wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie.

Streszczenie

W odpowiedzi na uraz aktywowana jest krzepnięcie krwi, co prowadzi do powstania proteazy krzepnięcia – trombiny. Trombina rozszczepia fibrynogen do fibryny, która tworzy nierozpuszczalny skrzep hamujący krwotok. Czynnik V (FV) w swojej aktywnej formie, FVa, jest krytycznym kofaktorem dla proteazy FXa i akceleratorem generowania trombiny podczas tworzenia skrzepu fibrynowego jako element protrombinazy ^{1, 2}. Opisano manualne metody oznaczania FV ^{3, 4}, lecz są one czasochłonne i subiektywne. Zgłoszono zautomatyzowane metody oznaczania FV ^5-7, jednak analizatory i odczynniki są kosztowne i zazwyczaj dostarczają jedynie czasu krzepnięcia, a nie szybkości i zakresu tworzenia fibryny. Platforma mikropłytek jest preferowana do pomiaru zdarzeń katalizowanych enzymatycznie ze względu na wygodę, czas, koszt, małe objętości, możliwość ciągłego monitorowania i wysoką przepustowość ^{8, 9}. Metody z wykorzystaniem mikropłytek opisano w przypadku lizy skrzepu ¹⁰, agregacji płytek krwi ¹¹ oraz czynników krzepnięcia ¹², ale nie w odniesieniu do aktywności FV w ludzkiej plazmie. Celem niniejszej metody było opracowanie testu na mikropłytkach umożliwiającego pomiar aktywności FV podczas tworzenia fibryny w ludzkiej plazmie.

Ta nowatorska metoda z użyciem mikropłytek opisuje prosty, niedrogi i szybki test aktywności FV w ludzkiej plazmie. Test wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do monitorowania zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia fibryny w ludzkiej plazmie (Rysunek 1) ¹³. Test precyzyjnie mierzy czas, początkową szybkość oraz zakres tworzenia skrzepu fibrynowego. Wymaga on jedynie ilości plazmy rzędu μl, trwa 6 min, charakteryzuje się wysoką przepustowością, wykazuje czułość na poziomie 24-80pM FV oraz mierzy ilość nieumyślnie aktywowanego (aktywność 1-etapowa) i aktywowanego trombiną FV (aktywność 2-etapowa), aby uzyskać pełną ocenę jego całkowitej aktywności funkcjonalnej (aktywność 2-etapowa - aktywność 1-etapowa).

Rozsiane krzepnięcie wewnątrz naczyniowe (DIC) jest nabytą koagulopatią, która najczęściej rozwija się w przebiegu istniejących wcześniej infekcji ¹⁴. DIC wiąże się ze złym rokowaniem i zwiększa śmiertelność ponad poziom wynikający z pierwotnej patologii ¹⁵. Przeprowadzone badanie wykazało, że u 9 pacjentów z DIC aktywność czynnika V (FV) w modelu 1-stopniowym, 2-stopniowym oraz aktywność całkowita były obniżone średnio o odpowiednio 54%, 44% i 42% w porównaniu z normalną pulą referencyjną osocza ludzkiego (NHP).

Test mikro płytkowy FV można łatwo dostosować do pomiaru aktywności dowolnego czynnika krzepnięcia. Badanie to zwiększy naszą wiedzę na temat biochemii FV poprzez dokładniejszy i pełniejszy pomiar jego aktywności w warunkach badawczych i klinicznych. Informacje te pozytywnie wpłyną na opiekę zdrowotną dzięki wcześniejszej diagnostyce oraz opracowaniu skuteczniejszych metod leczenia zaburzeń krzepnięcia, takich jak DIC.

Protokół

1. Przygotowanie ludzkiej plazmy pozbawionej czynnika V

1. Niniejsza metoda jest modyfikacją procedury pierwotnie opisanej przez Blooma et al ⁴.
2. Pobierz pełną krew ludzką od zdrowego, dorosłego ochotnika (mężczyzny lub kobiety w wieku 18–50 lat), który nie przyjmuje żadnych leków. Przez cały czas trwania procedury używaj rękawiczek lateksowych i fartucha laboratoryjnego.
3. Przygotuj 100 ml 3,2% (w/v) cytrynianu trisodowego w wodzie destylowanej. Napełnij osobne strzykawki 60 ml taką ilością tego roztworu, aby w każdej znalazło się 6,0 ml. Usuń powietrze, ostrożnie dociskając tłok do oznaczenia 6,0 ml na strzykawce.
4. Użyj gazika nasączonego alkoholem, aby oczyścić obszar żyły łokciowej między bicepsem a przedramieniem. Podłącz zestaw motylek o rozmiarze 20G do strzykawki 3 ml. Wprowadź igłę motylek do żyły łokciowej i delikatnie pociągnij tłok, aż krew wypełni strzykawkę do oznaczenia 3 ml. Wyrzuć strzykawkę z krwią. Krok ten wykonuje się w celu usunięcia czynnika tkankowego uwolnionego z uszkodzonego śródbłonka w miejscu nakłucia igłą, który mógłby aktywować proces krzepnięcia i zakłócić przygotowanie plazmy pozbawionej FV.
5. Podłącz igłę motylek do strzykawki 60 ml „załadowanej” 6,0 ml cytrynianu trisodowego i delikatnie pociągnij tłok, aż krew osiągnie oznaczenie 60 ml na strzykawce (końcowe stężenie cytrynianu 10,9 mM).
6. Zdejmij strzykawkę z igły motylek i delikatnie wymieszaj zawartość strzykawki, trzymając palec lub kciuk w rękawiczce na wylocie strzykawki.
7. Kontynuuj pobieranie krwi do strzykawek 60 ml, z których każda jest wypełniona 6,0 ml 3,2% cytrynianu trisodowego, zgodnie z powyższym opisem. Należy spodziewać się odzyskania ok. 50% objętości krwi cytrynianowej w postaci plazmy po wirowaniu; do każdego badania na mikropłytce wymagane jest 50 μl plazmy pozbawionej FV. Nasze laboratorium rutynowo przetwarza jednocześnie 300–420 ml krwi cytrynianowej, używając 5–7 strzykawek 60 ml, z których każda zawiera 6,0 ml 3,2% cytrynianu trisodowego. Jest to wystarczająca ilość plazmy pozbawionej FV dla około 3000 badań na mikropłytkach (patrz poniżej).
8. Usuń igłę motylek z ramienia ochotnika i przez 1,0 min uciskaj miejsce nakłucia żyły sterylnym gazikiem. Przykryj miejsce nakłucia sterylnym opatrunkiem.
9. Wiruj krew z cytrynianem przy 3300 ×g przez 20 min w temperaturze pokojowej. Przenieś górną, żółtą warstwę plazmy do plastikowego zlewka z mieszadłem magnetycznym za pomocą plastikowej pipety transferowej, uważając, aby nie zmącić dolnej warstwy czerwonych i białych krwinek.
10. Zmierz objętość plazmy w ml i zachowaj 100 μl plazmy na lodzie przed dodaniem EDTA do przyszłych badań czasu krzepnięcia protrombinowego (PT) (patrz poniżej).
11. Powoli dodawaj stałe EDTA do plazmy z cytrynianem przy delikatnym mieszaniu w temperaturze pokojowej, aby uzyskać stężenie końcowe 5 mM. Po rozpuszczeniu EDTA dostosuj pH do 7,0 poprzez kroplowe dodawanie 1,0 M NaOH przy delikatnym mieszaniu.
12. Przykryj zlewkę folią spożywczą i inkubuj przez 8–10 h bez mieszania w temperaturze 37 °C.
13. Co 2 h pobieraj 100 μl plazmy traktowanej EDTA na lód, wyznaczaj PT w danym czasie inkubacji z EDTA i porównuj z PT plazmy przed dodaniem EDTA (patrz powyżej).
14. Do oznaczeń PT umieść wymienne paski immunomodularne z 8 dołkami w plastikowym uchwycie szablonu i włóż je do czytnika mikropłytek.
15. Zorientuj paski immunomodularne w czytniku mikropłytek w kolejności: pusty, pusty, próbka, pusty, pusty, próbka, pusty i pusty (od lewej do prawej w uchwycie szablonu), aby zminimalizować zakłócenia spowodowane rozproszeniem światła z sąsiednich pasków zawierających próbki. Ponadto w każdym 8-dołkowym pasku immunomodularnym używaj tylko dołków od 2 do 7 (od góry do dołu), aby zminimalizować zakłócenia rozproszenia światła z krawędzi plastikowego uchwytu szablonu.
16. Badanie FV na mikropłytce pozwala na jednoczesny pomiar tworzenia skrzepu fibrynowego w co najmniej 12 różnych próbkach (6 próbek na pasek immunomodularny w dwóch paskach immunomodularnych).
17. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 50 μl HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) do każdego dołka mikropłytki dla każdej badanej próbki. Używając pojedynczej pipety, dodaj 50 μl normalnej ludzkiej pulowanej plazmy referencyjnej (NHP) lub plazmy przed dodaniem EDTA bądź w różnych czasach inkubacji po dodaniu EDTA do osobnych dołków mikropłytki.
18. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 50 μl tromboplastyny (metoda przygotowania opisana poniżej) do wszystkich dołków mikropłytki z plazmą przeznaczoną do badania. Inkubuj w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 °C przez 1 min i zaprogramuj czytnik tak, aby wstrząsał płytką przez 15–25 s w trakcie tej 1-minutowej inkubacji.
19. Korzystając z komputera połączonego z czytnikiem mikropłytek, uruchom aplikację mikropłytkową oprogramowania SoftMax Pro. Ustaw czytnik na Absorbancję, długość fali na 405 nm, tryb na Kinetyczny, temperaturę na 25 °C i zaprogramuj czytnik na wstrząsanie przez 5 s oraz odczyt absorbancji przy 405 nm co 5 s przez 6 min.
20. Używając pipety wielokanałowej, dodaj chlorek wapnia (50 μl 25 mM w wodzie destylowanej; stężenie końcowe 2,1 mM) do wszystkich dołków mikropłytki, odczekaj 15 s i naciśnij ikonę „Start” w menu SoftMax Pro, aby rozpocząć badanie.
21. Wyznacz PT z profili Absorbancja vs Czas w programie SoftMax Pro jako czas potrzebny do osiągnięcia połowy maksymalnego wzrostu absorbancji przy 405 nm (punkt środkowy sigmoidalnej krzywej Absorbancja vs Czas powstałej po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia; patrz poniżej, Rysunek 1).
22. Oblicz aktywność FV w metodzie jednowykrocznej z zależności Log czasu skrzepnięcia (s) vs Log aktywności FV (Jednostki/ml), jak zilustrowano poniżej na Rysunku 2A. W celach ilościowych 1 Jednostkę aktywności FV definiuje się jako aktywność obecną w 1,0 ml NHP przed celową aktywacją dodanym trombiną (patrz poniżej: Oznaczanie próbek ludzkiej plazmy za pomocą jednowykrocznego i dwuwykrocznego badania krzepnięcia na mikropłytce dla FV).
23. Przygotuj 4,0 l 20 mM HEPES zawierającego 0,15 M NaCl w wodzie destylowanej przy delikatnym mieszaniu. Dostosuj pH do 7,4 poprzez powolne, kroplowe dodawanie 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
24. Odetnij odpowiednią długość rurki do dializy i dokładnie wypłucz ją wodą destylowaną. Zawiąż węzeł na jednym końcu rurki. Przenieś plazmę traktowaną EDTA do rurki do dializy za pomocą plastikowej pipety transferowej, usuń powietrze i zawiąż węzeł na drugim końcu rurki.
25. Ostrożnie zawieś rurkę z plazmą traktowaną EDTA w HBS przy delikatnym mieszaniu. Przykryj folią spożywczą i dializuj przez 14–16 h przy delikatnym mieszaniu w temperaturze 4 °C.
26. Ostrożnie przelej plazmę traktowaną EDTA i dializowaną w alikwotach po 3,0 ml do probówek z nakrętką o pojemności 15,0 ml i zachowaj 100 μl na lodzie do badania PT „końcowej” plazmy pozbawionej FV. Przechowuj plazmę pozbawioną FV w temperaturze -80 °C do momentu użycia. W opisanych powyżej warunkach PT zwiększa się z 10–15 s przed dodaniem EDTA do 90–100 s po 8–10 h od dodania EDTA. Plazma pozbawiona FV przygotowana tą metodą rutynowo zawiera mniej niż 0,1% aktywnego FV obecnego w wyjściowej świeżej ludzkiej plazmie.

2. Przygotowanie tromboplastyny

1. Dializa jest niezbędna do usunięcia wapnia z tego odczynnika, aby umożliwić precyzyjne pomiar czasu tworzenia się skrzepu fibryny od momentu dodania chlorku wapnia w celu zainicjowania procesu krzepnięcia.
2. Przygotować 100 ml oraz 4,0 l 20mM HEPES i 0,15M NaCl w wodzie destylowanej w plastikowym zlewce, mieszając delikatnie. Dostosować pH do 7,4 poprzez powolne, kroplowe dodawanie 5,0M NaOH (HBS, pH 7,4).
3. Do każdej fiolki z odczynnikiem tromboplastyną dodać 6,0 ml HBS, pH 7,4, zamknąć pokrywkę i delikatnie wstrząsnąć w celu rozpuszczenia. Inkubować odczynnik w zamkniętych fiolkach przez 15 min w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić wysuszony materiał. Wstrząsnąć delikatnie do całkowitego rozpuszczenia.
4. Odciąć odpowiednią długość rurki do dializy, dobrze wypłukać wodą destylowaną i zawiązać jeden koniec rurki na węzeł. Przenieść tromboplastynę do rurki do dializy, usunąć powietrze i zawiązać drugi koniec rurki na węzeł.
5. Ostrożnie zawiesić rurkę do dializy w 4,0 l HBS, pH 7,4 i delikatnie mieszać pod przykryciem z folii Saran Wrap w temperaturze 4 °C przez 14-16 hr.
6. Przenieść alikwoty 3,0 ml dializowanej tromboplastyny do probówek z nakrętką o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

3. Przygotowanie krzywych kalibracyjnych aktywności dla jednowykorzystywalnego testu krzepnięcia na mikropłytkach FV

1. Rozmrozić plazmę z niedoborem FV, NHP oraz tromboplastynę w temperaturze 37 °C przez 10 min. Delikatnie i osobno wymieszać plazmę z niedoborem FV oraz tromboplastynę, przenieść do oddzielnych plastikowych kuwet do płukania i inkubować w lodzie. Przechowywać NHP w lodzie po delikatnym wymieszaniu. Chlorek wapnia (25mM w wodzie destylowanej) przechowywać w oddzielnej kuwecie do płukania w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować po 200 μl dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych NHP w HBS, pH 7.4 (rozcieńczenia: 0-, 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 128-, 256- oraz 512-krotne), używając probówek mikrocentryfużowych o pojemności 1,5 ml. Dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w lodzie.
3. Umieścić wymienne paski immunomodułów 8-dołkowych w plastikowym uchwycie szablonowym i włożyć do czytnika mikropłytek.
4. Zorientować paski immunomodułów w czytniku mikropłytek w następujący sposób: puste, puste, próbka, puste, puste, próbka, puste i puste (od lewej do prawej w uchwycie szablonowym), aby zminimalizować interferencję wynikającą z rozproszenia światła z sąsiednich pasków zawierających próbki. Ponadto, w każdym 8-dołkowym pasku immunomodułu używać wyłącznie dołków od 2 do 7 (od góry do dołu), aby zminimalizować interferencję rozproszenia światła z krawędzi plastikowego uchwytu szablonowego.
5. Test na mikropłytce FV umożliwia jednoczesny pomiar tworzenia skrzepu fibryny w co najmniej 12 różnych próbkach (6 próbek na pasek immunomodułu w dwóch paskach immunomodułowych).
6. Włączyć czytnik mikropłytek i uruchomić oprogramowanie aplikacyjne SoftMax Pro.
7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać jednocześnie do wszystkich dołków z próbkami na mikropłytce plazmę z niedoborem FV (50 μl). Za pomocą pojedynczej pipety dodać 50 μl każdego z 10 przygotowanych wcześniej rozcieńczeń seryjnych NHP do oddzielnych dołków mikropłytki.
8. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać tromboplastynę (50 μl) do wszystkich dołków z próbkami. Inkubować w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 °C przez 1 min i zaprogramować czytnik tak, aby wstrząsał płytką przez 15-25 s w trakcie tej 1-minutowej inkubacji.
9. Za pomocą komputera połączonego z czytnikiem mikropłytek uruchomić aplikację SoftMax Pro. Ustawić czytnik na pomiar Absorbancji, długość fali na 405nm, tryb Kinetyczny, temperaturę na 25 °C oraz zaprogramować czytnik na wstrząsanie przez pierwsze 5 s po dodaniu chlorku wapnia, a następnie mierzyć absorbancję przy 405nm co 5 s przez kolejne 6 min. 5-sekundowy interwał wstrząsania nie jest wliczany do obliczonego czasu krzepnięcia (patrz poniżej).
10. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać chlorek wapnia (50 μl stężenia 25mM w wodzie destylowanej; stężenie końcowe 3,5mM) do wszystkich dołków z próbkami na mikropłytce, odczekać 15 s, a następnie nacisnąć ikonę „Start” w aplikacji SoftMax Pro w komputerze, aby rozpocząć analizę.
11. Czas krzepnięcia oblicza się jako czas w sekundach do osiągnięcia wartości średniej między minimalną a maksymalną absorbancją przy 405nm po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia.
12. Wstępne szybkości tworzenia skrzepu oblicza się jako szybkość wzrostu absorbancji przy 405nm (mUnits/min), obejmującą pierwsze 5 punktów czasowych tworzenia skrzepu w liniowej części krzywej Absorbancji w funkcji czasu.
13. Zakres tworzenia skrzepu obliczono jako różnicę między maksymalną a minimalną absorbancją przy 405nm (Units) osiągniętą podczas procesu tworzenia skrzepu.

4. Analiza próbek ludzkiej osocza z wykorzystaniem jednowyrazowego i dwuwyrazowego mikro płytkowego testu krzepnięcia FV

1. Rozmrozić plazmę pozbawioną czynnika V (FV), plazmę NHP, próbki plazmy oraz tromboplastynę w temperaturze 37 °C przez 10 min. Ostrożnie wymieszać osobno plazmę pozbawioną FV oraz tromboplastynę, przenieść do oddzielnych plastikowych kuwet myjących do ELISA i inkubować na lodzie. Plazmę NHP i próbki plazmy po delikatnym wymieszaniu przechowywać na lodzie. Chlorek wapnia (25mM w wodzie destylowanej) przechowywać w oddzielnej kuwecie myjącej do ELISA w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować po 200 μl 40-krotnych rozcieńczeń plazmy NHP i próbek plazmy w buforze HBS, pH 7.4, używając probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dobrze wymieszać w wstrząsaczu Vortex i inkubować na lodzie.
3. Włożyć wymienne paski immunomodułów 8-dołkowych do plastikowego uchwytu matrycy, a następnie umieścić w czytniku mikropłytek.
4. W uchwycie matrycy rozmieścić paski immunomodułów od lewej do prawej w sekwencji: pusty, pusty, próbka, pusty, pusty, próbka, pusty i pusty, aby zminimalizować zakłócenia spowodowane rozproszeniem światła z sąsiednich pasków zawierających próbki. W każdym pasku immunomodułu używać tylko dołków od 2 do 7 (od góry do dołu), aby zminimalizować zakłócenia rozproszenia światłaB przy krawędziach plastikowego uchwytu matrycy.
5. Włączyć czytnik mikropłytek i uruchomić oprogramowanie aplikacyjne do mikropłytek SoftMax Pro.
6. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać plazmę pozbawioną FV (50 μl) do wszystkich dołków z próbkami na mikropłytce. Za pomocą pojedynczej pipety dodać 50 μl 40-krotnie rozcieńczonej plazmy NHP lub próbek plazmy przygotowanych wcześniej do oddzielnych dołków mikropłytki.
7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać tromboplastynę (50 μl) do wszystkich dołków z próbkami. Inkubować w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 °C przez 1 min, programując czytnik tak, aby wstrząsał płytką przez okres 15-25 s w trakcie 1-minutowej inkubacji.
8. Za pomocą komputera połączonego z czytnikiem mikropłytek uruchomić aplikację do mikropłytek w oprogramowaniu SoftMax Pro. Ustawić czytnik na pomiar absorbancji (Absorbance), długość fali na 405nm, tryb kinetyczny (Kinetic), temperaturę 25 °C i zaprogramować czytnik tak, aby wstrząsał płytką przez pierwsze 5 s po dodaniu chlorku wapnia, a następnie mierzyć absorbancję przy 405nm co 5 s przez kolejne 6 min. 5-sekundowy interwał wstrząsania nie jest wliczany do obliczonych czasów krzepnięcia (patrz poniżej).
9. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać chlorek wapnia (50 μl roztworu 25mM w wodzie destylowanej; końcowe stężenie 6,25mM) do wszystkich dołków z próbkami na mikropłytce i niezwłocznie nacisnąć ikonę „Start” w aplikacji SoftMax Pro na komputerze, aby rozpocząć analizę.
10. Po zakończeniu pomiaru określić czas, początkową szybkość oraz zakres tworzenia skrzepu dla 40-krotnie rozcieńczonej plazmy NHP i próbek plazmy na podstawie profilu absorbancji w funkcji czasu w programie SoftMax Pro.
11. Uwzględniając 40-krotne rozcieńczenie, wykorzystać czas krzepnięcia dla każdej próbki do obliczenia aktywności FV w jednostkach Units/ml na podstawie standardowej krzywej aktywności jednofazowej FV (Log czasu krzepnięcia vs. Log aktywności FV) (Rysunek 2A). Reprezentuje to aktywność jednofazową FV lub aktywność bez „zamierzonej” aktywacji trombiną.
12. Ponieważ FV jest aktywowany przez trombinę do aktywnego kofaktora, FVa ¹, dla dokładnego pomiaru aktywności dwufazowej FV próbki plazmy (z „zamierzoną” aktywacją dodaną trombiną) kluczowe jest przeprowadzenie drugiej analizy po dodaniu trombiny i inkubacji.
13. W przypadku analizy dwufazowej FV przygotować 200-300 μl oczyszczonej trombiny ¹⁸ o stężeniu 100nM w buforze HBS, pH 7.4 i inkubować na lodzie. Przyjąć zużycie 10 μl rozcieńczonej trombiny dla każdej próbki plazmy poddawanej analizie dwufazowej FV.
14. Rozcieńczyć 120 μl wyżej wymienionych plazm NHP i próbek plazmy ze 100-krotnego do 40-krotnego za pomocą 170 μl buforu HBS, pH 7.4 zawierającego 2,8mM chlorku wapnia. Dodać 10 μl trombiny (końcowe stężenie 10nM) do każdej próbki. Dobrze wymieszać w wstrząsaczu Vortex i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 min.
15. Rozcieńczyć plazmę NHP i próbki plazmy 500-krotnie, dodając 400 μl buforu HBS, pH 7.4, dobrze wymieszać w wstrząsaczu Vortex i poddać 50 μl każdej próbki plazmy analizie jednofazowej FV na mikropłytce zgodnie z opisem powyżej.
16. Określić czas krzepnięcia dla NHP i każdej analizowanej próbki plazmy na podstawie profilu absorbancji w funkcji czasu w programie SoftMax Pro. Uwzględniając 500-krotne rozcieńczenie, wykorzystać czas krzepnięcia dla każdej próbki do obliczenia aktywności dwufazowej FV z jednofazowej krzywej standardowej FV (Log czasu krzepnięcia vs. Log aktywności FV) (Rysunek 2A).
17. Całkowitą aktywność FV można następnie obliczyć jako różnicę: aktywność dwufazowa FV minus aktywność jednofazowa FV.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki - Przygotowanie krzywych wzorcowych aktywności dla jednofazowego testu krzepnięcia na mikropłytkach dla FV

Reprezentatywny przykład tworzenia się skrzepu fibryny w czasie w teście FV, wygenerowany przez czytnik mikropłytek, przedstawiono na Rysunku 1. Test FV precyzyjnie mierzy czas, początkową szybkość oraz stopień tworzenia się skrzepu fibryny. Inspekcja dołków po zakończeniu testu potwierdziła zajście procesu krzepnięcia. Wszystkie reakcje osiągnęły w przybliżeniu ten sam stopień tworzenia skrzepu, przy ogólnej zmianie absorbancji przy 405nm o 0,35 - 0,45 jednostek pomiędzy absorbancją początkową a absorbancją maksymalną po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia. Reprezentatywne przykłady krzywych wzorcowych aktywności FV w jednej fazie dla Log Czasu Krzepnięcia (w sekundach) względem Log Aktywności FV (Units/ml) oraz Log Początkowej Szybkości Tworzenia Skrzepu (w mUnits/min) względem Log Aktywności FV (Units/ml) dla rozcieńczeń seryjnych NHP przedstawiono odpowiednio na Rysunku 2A oraz Rysunku 2B. Dopasowanie wykresu Log-Log Czasu Krzepnięcia względem Aktywności FV 1 wykazało silną zależność między tymi zmiennymi po analizie regresji liniowej (Rysunek 2A; R² = 0,980). Dopasowanie wykresu Log-Log Początkowej Szybkości Tworzenia Skrzepu względem Aktywności FV również wykazało silną zależność między tymi zmiennymi po analizie regresji liniowej (Rysunek 2B; R² = 0,983). Zależność zarówno Log Czasu Krzepnięcia, jak i Log Początkowej Szybkości Tworzenia Skrzepu względem Log Aktywności FV pozostała liniowa dla NHP rozcieńczonego do 512 razy. Ponieważ FV krąży w NHP w stężeniu ok. 12-40nM ¹⁶, test na mikropłytkach wykazuje czułość na poziomie ok. 24-80pM FV w NHP. Biorąc pod uwagę, że stała dysocjacji oddziaływania FVa-FXa-lipid w prothrombinase wynosi w przybliżeniu 1nM ¹⁷, test FV na mikropłytkach jest w pełni odpowiedni do pomiaru poziomów FV w fizjologicznie istotnym zakresie nM dla funkcji FVa w prothrombinase.

Z wykorzystaniem testu na mikropłytkach FV określono również, że norma aktywności FV w jednofazowym teście aktywności FV dla 15 osoczy zdrowych kontroli (mężczyzn i kobiet w wieku 18-20 lat) wynosiła (średnia ± odchylenie standardowe; zakres): 0.96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Wyniki te są zgodne z prawidłową aktywnością i zakresem FV u osób zdrowych (0.66-1.14U/ml) raportowanymi przez Cutler et al. dla jednofazowej aktywności FV oznaczonej za pomocą analizatora automatycznego ⁷. Zmienność wewnątrzseryjną czasu, stopnia oraz początkowej szybkości tworzenia skrzepu w jednofazowym teście FV w 6 dołkach w ciągu 8 różnych dni określono odpowiednio na 3,4%, 4,4% i 3,1%. Zmienność międzyseryjną czasu, stopnia oraz początkowej szybkości tworzenia skrzepu w jednofazowym teście FV w 6 dołkach w 8 różnych eksperymentach przeprowadzonych w 8 różnych dni określono odpowiednio na 7,1%, 7,8% i 9,2%. Zatem zmienność wewnątrz- i międzyseryjna tych trzech mierzonych zmiennych znajdowała się na niskim i dopuszczalnym poziomie, zapewniając stabilne działanie testu w obrębie i pomiędzy analizami na mikropłytkach dla wielu próbek jednocześnie (do 12).

Reprezentatywne wyniki – Analiza próbek ludzkiej osocza z wykorzystaniem 1- i 2-stopniowego mikro płytkowego testu krzepliwości FV

Krzywa wzorcowa zależności logarytmu czasu krzepnięcia (Log Clot Time) od logarytmu aktywności FV (Log FV Activity) (Rysunek 2A) została wykorzystana do pomiaru aktywności FV w osoczu NHP oraz u 9 pacjentów z DIC, w próbkach które nie były celowo aktywowane poprzez dodanie trombiny (aktywność FV w teście jednostopniowym) lub były celowo aktywowane poprzez dodanie trombiny (aktywność FV w teście dwustopniowym); wyniki przedstawiono w Tabeli 1. We wszystkich 9 próbkach osocza pacjentów z DIC zaobserwowano aktywność FV w teście jednostopniowym oraz początkowe szybkości tworzenia skrzepu, które były średnio niższe odpowiednio o 54% i 18% w porównaniu do NHP. Zakres tworzenia skrzepu w teście jednostopniowym FV u pacjentów z DIC nie różnił się znacząco od NHP i był średnio o 13% wyższy w porównaniu do NHP.

Aktywacja NHP trombiną spowodowała około 8-krotny wzrost aktywności FV w teście dwuetapowym w porównaniu do aktywności FV w teście jednoetapowym (Tabela 1). Wskazuje to, że FV w NHP występowało głównie w formie nieaktywnej, co jest zgodne z wcześniej raportowanymi wynikami uzyskanymi za pomocą manualnych testów FV w rurkach nachylonych ^{3, 4} oraz zautomatyzowanych testów FV ^5-7. Aktywność FV w teście dwuetapowym oraz całkowita aktywność były również obniżone u pacjentów z DIC średnio o odpowiednio 44% i 42% w stosunku do NHP. Początkowe szybkości i zakresy tworzenia się skrzepu w teście dwuetapowym FV u pacjentów z DIC nie różniły się istotnie od NHP i różniły się średnio o odpowiednio ok. 9% i 4% w porównaniu do wartości zaobserwowanych dla NHP. Wyniki te wskazują, że w porównaniu z FV w NHP, FV w osoczu pacjentów z DIC prowadziło do wydłużenia czasu i zmniejszenia szybkości tworzenia się skrzepu fibryny oraz że FV pacjentów było średnio tylko w 56% podatne na aktywację trombiną.

Rysunek 1. Tworzenie skrzepu w normalnej puli ludzkiej plazmy referencyjnej mierzone za pomocą kinetycznego mikro płytkowego testu krzepnięcia FV w jednym etapie. Tworzenie skrzepu fibrynowego w NHP było stale monitorowane przy 405 nm przy użyciu kinetycznego czytnika mikro płytek. Wykres przedstawia wynik z czytnika mikro płytek dla 6-minutowej reakcji 32-krotnie rozcieńczonej NHP, plazmy z niedoborem FV, tromboplastyny i chlorku wapnia w dołku mikro płytki. Oś pionowa reprezentuje zmianę absorbancji przy 405 nm, która wystąpiła w wyniku tworzenia fibryny w plazmie. Czas tworzenia fibryny zdefiniowano jako czas do osiągnięcia połowy maksymalnego wzrostu absorbancji lub punkt środkowy krzywej (36,40 sec). Szybkość początkową tworzenia skrzepu zdefiniowano jako szybkość zmiany absorbancji przy 405 nm w ciągu pierwszych 5 punktów czasowych liniowego wzrostu części absorbancji krzywej (611,88 mUnits/min). Zakres tworzenia skrzepu zdefiniowano jako różnicę między maksymalną a minimalną absorbancją przy 405 nm (0,35 Units).

Rycina 2. Krzywe wzorcowe czasu i szybkości początkowej tworzenia skrzepu względem aktywności czynnika V w normalnej puli ludzkiej plazmy referencyjnej z wykorzystaniem jednofazowego testu mikroplatek na FV. NHP poddano rozcieńczeniom szeregowym (od 0- do 512-krotnego w HBS) i przeanalizowano za pomocą jednofazowego testu mikroplatek na FV zgodnie z opisem w protokole. Wykresy Log-Log czasu oraz szybkości początkowej tworzenia skrzepu względem aktywności FV w jednofazowym teście mikroplatek na FV przedstawiono po modelowaniu regresji liniowej danych odpowiednio na panelach A i B.

Próbka	Aktywność w teście 1-etapowym (Units/ml)	Zakres w teście 1-etapowym (Units)	Szybkość początkowa w teście 1-etapowym (mUnits/min)	Aktywność w teście 2-etapowym (Units/ml)	Zakres w teście 2-etapowym (Units)	Szybkość początkowa w teście 2-etapowym (mUnits/min)	Całkowita aktywność (Units/ml)
NHP	1,02	0,363	744,96	7,93	0,433	375,84	6,91
Pacjent 1	0,36	0,404	583,80	3,84	0,432	249,96	3,48
Pacjent 2	0,67	0,416	704,04	5,28	0,469	323,16	4,61
Pacjent 3	0,31	0,435	562,08	3,92	0,453	294,96	3,61
Pacjent 4	0,39	0,435	617,04	4,14	0,462	372,60	3,75
Pacjent 5	0,73	0,401	641,40	5,91	0,433	354,24	5,18
Pacjent 6	0,45	0,403	600,72	4,16	0,445	393,96	3,71
Pacjent 7	0,49	0,395	575,40	4,89	0,449	357,48	4,40
Pacjent 8	0,19	0,448	489,00	2,89	0,450	330,48	2,70
Pacjent 9	0,64	0,423	699,48	5,11	0,455	417,24	4,47

Tabela 1 Aktywność FV u NHP oraz u 9 pacjentów, u których rozwinęło się rozsiane krzepnięcie wewnątrznaczyniowe (DIC). Aktywność FV w teście 1-stopniowym, 2-stopniowym oraz całkowita aktywność w osoczu NHP i 9 pacjentów z DIC zostały określone na podstawie krzywej wzorcowej testu mikro płytkowego FV 1-stopniowego, przedstawiającej czas tworzenia skrzepu w funkcji aktywności FV (Rysunek 2A), i podano je w Units/ml. Przedstawiono również szybkości początkowe (początkowa szybkość wzrostu A405nm w ciągu pierwszych pięciu punktów czasowych w mUnits/min) oraz zakresy (maksymalne A405nm - minimalne A405nm) tworzenia skrzepu w testach mikro płytkowych FV 1- i 2-stopniowych.

Dyskusja

Metoda kinetycznego analizy na mikropłytkach opisuje opracowanie nowej, szybkiej, niedrogiej i wygodnej techniki pomiaru aktywności krzepnięcia FV w próbkach ludzkiej plazmy, które nie zostały (analiza FV jednofazowa) lub zostały celowo aktywowane poprzez dodanie trombiny (analiza FV dwufazowa). Analiza wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek, a wszystkie wymagane materiały i odczynniki są dostępne komercyjnie lub mogą zostać przygotowane wewnętrznie. Analiza stale monitoruje zmianę rozproszenia światła w plazmie podczas tworzenia skrzepu fibrynowego przy 405nm. Analiza na mikropłytkach ma zaletę wykorzystywania małych objętości próbek plazmy (μl) i umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek (do 12). Atrybuty tej analizy są korzystne w sytuacjach, gdy stosowany jest kosztowny sprzęt i odczynniki (analizatory automatyczne i plazmy pozbawione czynników), gdy dostępne są tylko małe objętości próbek (plazma pacjentów) lub podczas analizy dużej liczby próbek (podczas oczyszczania FV z plazmy).

Analiza FV na płytkach mikrotitracyjnych oferuje dodatkowe zalety w postaci wygody, szybkości oraz braku konieczności izolacji i oczyszczania wymaganych komponentów składowych. W porównaniu z opisywanymi analizami FV w metodzie ręcznej z probówkami nachylanymi ^{3, 4} oraz zautomatyzowanymi ^5-7, analiza FV na płytkach mikrotitracyjnych wykazuje porównywalny zakres użyteczności czasów krzepnięcia (25-75 sec) i odpowiadających im poziomów FV w próbce (0,5-0,005 Units/ml) oraz granice czułości/detekcji (20-80pM). W przeciwieństwie do ręcznych analiz FV w probówkach nachylanych, które obarczone są subiektywną wizualną oceną tworzenia skrzepu ^{3, 4}, analiza FV na płytkach mikrotitracyjnych umożliwia obiektywny i ilościowy pomiar czasu krzepnięcia, szybkości początkowej oraz stopnia tworzenia skrzepu fibrynowego. W porównaniu z zautomatyzowanymi analizami FV, które wymagają kosztownych analizatorów i odczynników ^5-7, odczynniki i materiały do analizy FV na płytkach mikrotitracyjnych są tanie, a wszystkie niezbędne materiały można nabyć komercyjnie lub przygotować we własnym zakresie. Ręczne analizy FV w probówkach nachylanych ^{3, 4} i analizy zautomatyzowane ^5-7 zazwyczaj dostarczają jedynie czasu tworzenia skrzepu; nie określają zaś czasu, szybkości początkowej ani stopnia tworzenia skrzepu fibrynowego, które w analizie FV na płytkach mikrotitracyjnych są wszystkie dokładnie mierzone spektrofotometrycznie. Wreszcie, ręczne analizy FV w probówkach nachylanych ^3,4 oraz zautomatyzowane ^5-7 pozwalają na pomiar aktywności FV w próbkach osocza jedynie pojedynczo, podczas gdy analiza FV na płytkach mikrotitracyjnych umożliwia wysoką przepustowość i jednoczesne badanie 12 próbek.

Test na mikropłytkach został wykorzystany do wykazania, że FV w osoczu 9 pacjentów z DIC była mniej aktywna niż w NHP ze względu na połączenie opóźnionego czasu krzepnięcia i niższych początkowych szybkości tworzenia skrzepów w jednofazowym teście FV. Początkowe szybkości tworzenia skrzepów w dwufazowym teście FV w osoczu pacjentów z DIC nie uległy zmianie w porównaniu do NHP. Zakres tworzenia skrzepów w osoczu pacjentów z DIC również nie różnił się od NHP w jednofazowym i dwufazowym teście FV. Obniżona aktywność FV w teście jednofazowym, dwufazowym i aktywność całkowita mogły wynikać ze zwiększonego zużycia FV ¹⁹ i/lub inaktywacji ⁶, zgodnie z innymi badaniami nad patogenezą tego nabytego zaburzenia krzepnięcia krwi. Biorąc pod uwagę, że zakres tworzenia skrzepów w osoczach z DIC był taki sam, jak zaobserwowano w NHP, zmienna ta była najprawdopodobniej wynikiem stężenia fibrynogenu w osoczu z niedoborem FV, a nie cech osocza pacjentów.

Wyniki testu na mikropłytce wykazały, że pomiar aktywności FV w próbkach ludzkiej osocza można uzyskać na podstawie czasu i początkowej szybkości tworzenia skrzepu w teście FV jednoetapowym oraz czasu tworzenia skrzepu i całkowitej aktywności w teście FV dwuetapowym. Nie udało się uzyskać ilościowego pomiaru aktywności FV w próbce osocza na podstawie stopnia tworzenia skrzepu w testach FV jedno- i dwuetapowych ani na podstawie początkowej szybkości tworzenia skrzepu w teście FV dwuetapowym. Biorąc pod uwagę, że we wszystkich reakcjach osiągnięto w przybliżeniu ten sam stopień tworzenia skrzepu wynoszący 0,35 - 0,45 jednostek pomiędzy absorbancją początkową a absorbancją maksymalną po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia, pomiar stopnia tworzenia skrzepu nie zapewnia ilościowej oceny aktywności FV w danej próbce osocza.

Nowy test na mikropłytkach znajdzie zastosowanie w badaniach naukowych i diagnostyce klinicznej do pomiaru aktywności FV w próbkach osocza ludzkiego oraz w jego frakcjach podczas oczyszczania z osocza ludzkiego i zwierzęcego. Test na mikropłytkach może być wykorzystany do pomiaru czasu, szybkości początkowej i zakresu tworzenia skrzepu; są to parametry, których zazwyczaj nie monitoruje się jednocześnie w manualnych testach w probówkach przechylanych oraz w automatycznych analizatorach krzepliwości. Informacje te zapewniają bardziej pełną ocenę ilościową udziału FV w procesie tworzenia skrzepu w osoczu ludzkim, niż raportowano wcześniej ^3-7. Dane te są szczególnie istotne zarówno w laboratoriach badawczych, jak i klinicznych, podczas pomiaru istotnych zmian w aktywności FV w próbkach osocza lub w przypadku oczyszczonego FV lub FVa. Test na mikropłytkach FV może być również stosowany do charakteryzowania i pomiaru związków, które mogą aktywować lub dezaktywować FV i FVa, pomiaru aktywności FV u pacjentów z ryzykiem zakrzepicy żył w wyniku mutacji FV Leiden ^{20, 21} oraz do monitorowania aktywności FV podczas jego oczyszczania z osocza.

Test mikroplatek FV można łatwo dostosować do pomiaru aktywności dowolnego czynnika krzepnięcia w drodze zewnętrznej, wewnętrznej lub wspólnej, wykorzystując odpowiednią plazmę z niedoborem danego czynnika oraz odczynniki inicjujące tworzenie fibryny. Test ten zwiększy naszą wiedzę na temat biochemii FV poprzez dokładniejszy i pełniejszy pomiar jego aktywności w laboratoriach badawczych i klinicznych. W ostateczności informacje te wpłyną korzystnie na opiekę zdrowotną dzięki wcześniejszej diagnostyce i opracowaniu skuteczniejszych metod leczenia osób cierpiących na zaburzenia krzepnięcia, takie jak DIC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kinetyczny czytnik mikropłytek	Molecular Devices	Spectra Max 190	Oprogramowanie SOFTmax PRO 4.3 LS
Normalna pulowana ludzka plazma referencyjna	Precision Biologicals	CCN-10
Cytrynian trCydowy	Becton Dickenson	B10242
EDTA	Becton Dickenson	B10093
Ludzka plazma z niedoborem FV4			Przygotowana ze świeżej ludzkiej plazmy i przechowywana w aliquotach w -70 °C.
Strzykawki 3 i 60 ml	Becton Dickenson	309585 i 136898
Kaniula motylkowa	Vacutainer	367251	rozmiar 20 G
HEPES	Sigma/Aldrich	H-3375
NaCl	Fisher	BP358-212
Tromboplastyna	Trinity Biotech	T1106	Dializowana przeciwko HBS, pH 7.4 i przechowywana w aliquotach w -70 °C.
Chlorek wapnia	Becton Dickenson	B10070
Ludzka trombina15			Z ludzkiej plazmy; przechowywana w -20 °C w 50% (v/v) glicerolu.
Membrana dializacyjna	Fisher	21-152-6	próg odcięcia masy cząsteczkowej 6-8 kDa; 50 mm x 3 m.
Uchwyt do szablonu i wymienne paski 8-dołkowe.	Nunc	14-245-63 i 469957
Tace do mycia ELISA	BioRad	224-4872
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml i probówki z nakrętką 15 ml.	Sarstedt	72690 i 62554205
Pipeta wielokanałowa	Fisher	2703630	model 8-kanałowy.