Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Streszczenie

Wpływ rusztowań trójwymiarowych (3D) na wzrost, proliferację i ostatecznie różnicowanie neuronalne jest przedmiotem dużego zainteresowania w celu znalezienia nowych metod standaryzowanych terapii opartych na komórkach w leczeniu schorzeń neurologicznych lub chorób neurodegeneracyjnych. Oczekuje się, że struktury 3D zapewnią środowisko znacznie bardziej zbliżone do warunków in vivo niż hodowle 2D. W kontekście medycyny regeneracyjnej połączenie rusztowań z biomateriałów z neuralnymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi stanowi obiecujące narzędzie terapeutyczne.^1-5 Wykazano, że systemy hodowlane emulujące środowisko trójwymiarowe wpływają na proliferację i różnicowanie różnych typów komórek macierzystych i progenitorowych. W tym przypadku formowanie i funkcjonalizacja mikrośrodowiska 3D są kluczowe dla określenia przeżywalności i dalszego losu osadzonych komórek.^6-8 W niniejszej pracy zastosowano PuraMatrix^9,10 (RADA16, PM), rusztowanie w postaci hydrożelu peptydowego, który jest dobrze opisany i wykorzystywany do badania wpływu środowiska 3D na różne typy komórek.^7,11-14 PuraMatrix można łatwo modyfikować, a syntetyczne wytwarzanie nanowłókien zapewnia system hodowli 3D o wysokiej niezawodności, który dodatkowo jest wolny od komponentów pochodzenia zwierzęcego (xeno-free).

Niedawno zbadaliśmy wpływ stężenia PM na formowanie się rusztowania.¹³ W badaniu tym zastosowane stężenia PM miały bezpośredni wpływ na powstanie struktury 3D, co zostało wykazane za pomocą mikroskopii sił atomowych. Następująca analiza przeżywalności i różnicowania hNPC ujawniła wpływ zastosowanych stężeń PM na losy osadzonych komórek. Jednak analiza przeżywalności lub różnicowania neuronalnego za pomocą technik immunofluorescencji wiąże się z pewnymi trudnościami. Aby uzyskać wiarygodne dane, należy określić całkowitą liczbę komórek wewnątrz macierzy, aby otrzymać względną liczbę np. komórek neuronalnych znakowanych βIII-tubuliną. Wymaga to zastosowania techniki pozwalającej na analizę rusztowań w trzech wymiarach za pomocą mikroskopu konfokalnego lub porównywalnej techniki, takiej jak mikroskopy fluorescencyjne zdolne do wykonywania serii zdjęć z-stack preparatu. Ponadto tego rodzaju analiza jest niezwykle czasochłonna.

W niniejszej pracy prezentujemy metodę uwalniania komórek z rusztowań 3D w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. W tym protokole ludzkie komórki progenitorowe neuronów (hNPCs) z linii komórkowej ReNcell VM (Millipore USA) były hodowane i różnicowane w rusztowaniach 3D składających się z PuraMatrix (PM) lub PuraMatrix uzupełnionego o lamininę (PML). W naszych badaniach optymalnym stężeniem PM dla hodowli komórek było 0,25%¹³, jednak stężenie to może być dostosowane do innych typów komórek.¹² Uwolnione komórki mogą być wykorzystane np. do badań immunocytochemicznych, a następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Przyspiesza to analizę, a ponadto uzyskane dane opierają się na szerszej bazie, co zwiększa ich wiarygodność.

Protokół

1. Część 1: Hodowla hNPC w PuraMatrix

1. Przed wytworzeniem rusztowania z PuraMatrix o stężeniu 0,25% bez lamininy należy przygotować następujące roztwory
2. Przygotować roztwór zawierający 20% sacharozy oraz roztwór zawierający 10% sacharozy rozpuszczonej w sterylnej wodzie destylowanej.
3. W celu przygotowania roztworu 1 wymieszać 120 μl 20% roztworu sacharozy z 120 μl wody destylowanej w probówce stożkowej o pojemności 1,5 ml.
4. W celu przygotowania roztworu 2 wymieszać 60 μl roztworu PuraMatrix z 60 μl 20% roztworu sacharozy w probówce stożkowej o pojemności 1,5 ml.

W celu przygotowania rusztowania z PuraMatrix o stężeniu 0,25% z dodatkiem lamininy (8 μg na 100 μl Matrix) należy przygotować następujące roztwory.

1. W celu przygotowania roztworu 1 zmieszaj 72 μl wody destylowanej z 120 μl 20% roztworu sacharozy oraz 48 μl lamininy w probówce stożkowej o pojemności 1,5 ml.
2. W celu przygotowania roztworu 2 zmieszaj 60 μl roztworu PuraMatrix z 60 μl 20% roztworu sacharozy w probówce stożkowej o pojemności 1,5 ml.

5. W celu osadzenia komórek w PuraMatrix należy przygotować 4-dołkową płytkę hodowlano i umieścić sterylizowane szkiełka nakrywki (średnica 13 mm) w dwóch dołkach. Płytkę należy przechowywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza do późniejszego użycia. Szkiełka nakrywki są wykorzystywane wyłącznie do badań immunocytochemicznych. Jeśli nie planuje się barwień immunocytochemicznych, ten krok można pominąć.

Aby przygotować hNPC do enkapsulacji w rusztowaniach 3D, należy sporządzić następujące roztwory. Rozcieńczyć Benzonazę w roztworze Trypsyny/EDTA, stosując czynnik rozcieńczenia 1:10.000. Aby uzyskać roztwór inhibitora trypsyny/Benzonazy, wymieszać: DMEM/F12 + Benzonaza 25U/μl + 1% HSA + inhibitor trypsyny (0,5mg/ml).

6. Odczep komórki, dodając 500 μl roztworu Trypsyny/Benzonukleazy, i inkubuj przez 5 min w inkubatorze (37°C, 5% CO₂). Przerwij reakcję, dodając roztwór Inhibitora Trypsyny/Benzonukleazy. Następnie odwiruj odczepione komórki przez 5 min przy 3000 x g. Przemyj komórki 5 ml 10% roztworem sacharozy i ponownie odwiruj. Odlej naddatek.
7. Resuspenduj komórki w 10% roztworze sacharozy; końcowy roztwór powinien zawierać 1x10⁶ komórek/ml.

Kolejne kroki, od 1.8 do 1.11, należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, ze względu na niskie pH roztworu PuraMatrix, które może być szkodliwe dla komórek.

8. Wymieszaj 60 μl zawiesiny komórkowej z roztworem 1.
9. Przenieś 120 μl roztworu 1 zawierającego komórki do probówki stożkowej z roztworem 2 i dokładnie wymieszaj.
10. Nanieś niezwłocznie 100 μl mieszaniny na każde szkiełko nakrywki znajdujące się w płytce 4-dołkowej.
11. Powoli dodaj 200 μl pożywki hodowlanej do każdego dołka, a po 2-3 minutach kolejne 200 μl. Zainicjuje to samoorganizację macierzy.
12. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 1h w komorze laminarnej na płytce grzewczej lub w ogrzewanej strefie komory. W miarę możliwości nie przesuwaj płytki, aby nie zakłócić procesu formowania się macierzy.
13. Za pomocą pipety 1000 μl usuń większość pożywki, nie usuwając jej całkowicie, aby zapobiec wyschnięciu macierzy. Dodaj 500 μl pożywki, aby płukać macierze przez 10 min. Na koniec usuń pożywkę, dodaj 500 μl świeżej pożywki i umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze (37°C, 5% CO₂). Ponieważ macierze są wrażliwe na wstrząsy, płytki należy przesuwać jak najmniej i w miarę możliwości przechowywać w oddzielnym inkubatorze.
14. Wykorzystane tutaj hNPC proliferowano przez 7 dni w rusztowaniach 3D, a różnicowanie zainicjowano poprzez usunięcie czynników wzrostu ¹³. Pożywkę wymieniano co 2-3 dni.

2. Część 2: Barwienie immunocytochemiczne całych macierzy

1. Przed przystąpieniem do procedury barwienia należy przygotować: roztwór buforu blokującego składający się z 5% normalnego surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 rozpuszczonego w PBS, 4% roztwór paraformaldehydu w 0,1 M PBS oraz, w razie potrzeby, roztwór 4',6-diamidyno-2-fenyloindolodihydrochlorku (DAPI) do barwienia jąder komórkowych, zawierający 100 ng DAPI/ml rozpuszczonego w PBS. Próbki zamontowano w mieszaninie Mowiol i DABCO.
2. Aby wypłukać matryce, należy usunąć medium pipetą 1000 μl i wypłukać rusztowania PBS raz przez 5 minut.
3. W celu utrwalenia rusztowań należy usunąć PBS i dodać 400 μl paraformaldehydu (4% w 0,1 M PBS) do każdej studzienki, a następnie inkubować matryce przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Utrwalone rusztowania można przechowywać w PBS z dodatkiem 0,02% NaN₃ w temperaturze 4°C przez kilka tygodni, a nawet kilka miesięcy.
4. Przed barwieniem należy wypłukać rusztowania w PBS przez 5 minut.
5. Inkubować rusztowania w roztworze buforu blokującego. Roztwór blokujący wymieniano trzykrotnie co 2-3 godziny, a następnie rusztowania inkubowano w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4°C.
6. Usunąć bufor blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozpuszczone w PBS z dodatkiem 1% normalnej surowicy koziej, a następnie inkubować matryce przez noc w temperaturze 4°C.
7. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i wypłukać rusztowania 4 razy przez 2 h, a następnie przez noc w temperaturze 4°C w PBS.
8. Usunąć PBS i dodać roztwór przeciwciała wtórnego, rozpuszczonego w PBS z dodatkiem 1% normalnej surowicy koziej, na 4 h w temperaturze pokojowej w ciemności.
9. Wypłukać próbki w PBS 4-6 razy przez 1 h, a następnie przez noc w temperaturze 4°C w ciemności.
10. W celu zabarwienia jąder komórkowych można dodać 400 μl roztworu DAPI na 30 min.
11. Do montowania próbek potrzebne są szkiełka przedmiotowe. Nanieść 50 μl Mowiol/Dabco na szkiełka przedmiotowe. Zdjąć szkiełka zakrywające z płytki 4-studzienkowej i ostrożnie położyć je na medium montującym.
12. W badaniu wykorzystano mikroskop Biozero 8000 (Keyence, Niemcy, Karlsruhe) do uzyskania pojedynczych mikrografii oraz stosów z-stack. Każdy stos zawiera 30 pojedynczych obrazów z odstępem 1-2 μm. Przy użyciu odpowiedniego oprogramowania analitycznego usunięto rozmycie charakterystyczne dla fluorescencji przed utworzeniem pełnych projekcji stosów z-stack.

3. Część 3: Uwalnianie hNPC z rusztowań do analizy metodą cytometrii przepływowej

1. Przed uwolnieniem komórek z rusztowań należy przemyć rusztowania 500 μl HBSS.
2. Przenieść rusztowania za pomocą pipety 1000 μl do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę do hodowli komórkowej.
3. Aby mechanicznie rozbić rusztowania, należy kilkukrotnie resuspendować zawiesinę komórkową pipetą 1000 μl, a następnie odwirować roztwór przy 3000 x g przez 5 min.
4. Usunąć nadsącz za pomocą pipety, dodać 500 μl roztworu Trypsyny/Benzonukleazy i kilkukrotnie resuspendować pellet komórkowy.
5. Inkubować komórki przez 5 min w temperaturze 37°C w roztworze Trypsyny/Benzonukleazy. Aby zatrzymać reakcję, dodać 1 ml roztworu inhibitora trypsyny/Benzonukleazy i kilkukrotnie pipetować w górę i w dół.
6. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 min przy 3000 x g, usunąć nadsącz i przemyć komórki 2 ml buforu HBSS. Powtórzyć ten krok dwukrotnie. Procedura ta pozwoli usunąć pozostałości macierzy.
7. Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (rozmiar oczek 70 μm) w celu usunięcia agregatów i zebrać komórki w pożywce do hodowli komórkowej. Uzyskane komórki można ponownie wysiać, np. na szkiełka podstawowe do badań funkcjonalnych, takich jak patch-clamp lub pomiary fluorymetryczne. Aby przygotować komórki do cytometrii przepływowej, należy je natychmiast utrwalić (patrz 4.1).

4. Część 4: Ilościowe oznaczenie komórek pozytywnych pod kątem βIII-tubuliny za pomocą cytometrii przepływowej

1. Utrwal uwolnione komórki otrzymane w kroku 3.7, stosując 1% PFA przez 15 min w temperaturze pokojowej.
2. Odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min przy 3000 x g i usuń nadosad. W razie potrzeby komórki można przygotować do przechowywania w 4°C do późniejszej analizy; w tym celu resuspenduj komórki w buforze płuczącym (PBS uzupełniony o 0,5% BSA i 0,02% azotku sodu).
3. Aby przejść do przygotowania do cytometrii przepływowej, odwiruj zawiesinę komórkową przez 10 min przy 350 x g, odlej nadosad i resuspenduj komórki w 25 μl roztworu przeciwciał. W tym celu pierwsze przeciwciało (np. βIII-tubulin) zmieszaj z buforem saponinowym w stosunku 1:100. Bufor saponinowy składa się z PBS z 0,5% saponiny, 0,5% BSA i 0,02% azotku sodu.
4. Inkubuj zawiesinę komórkową z pierwszym przeciwciałem przez 2 h w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Jako kontrolę negatywną przygotuj próbkę bez pierwszego przeciwciała.
5. W pierwszym etapie płukania dodaj 300 μl buforu saponinowego bezpośrednio do komórek. Odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min przy 350 x g. W drugim etapie płukania odlej nadosad, dodaj 300 μl buforu i odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min przy 350 x g.
6. Usuń nadosad i dodaj 25 μl roztworu zawierającego przeciwciało wtórne (np. Alexa Fluor 647, 1:1000, rozpuszczone w buforze saponinowym). Inkubuj komórki z przeciwciałem wtórnym przez 1 h w temperaturze pokojowej, w ciemności.
7. W pierwszym etapie płukania dodaj 300 μl buforu saponinowego bezpośrednio do komórek. Odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min przy 350 x g. W drugim etapie płukania odlej nadosad, dodaj 300 μl buforu i odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min przy 350 x g.
8. Odlej nadosad i resuspenduj komórki w 500 μl buforu płuczącego do analizy cytometrycznej.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład hNPCs hodowanych w samoorganizującym się rusztowaniu hydrożelowym PuraMatrix przedstawiono na rysunku 1. hNPCs rosną w strukturach przypominających sfery w niezmodyfikowanym PM. W tych warunkach hodowli komórki są trudne do rozpoznania w świetle przechodzącym, choć widoczne są wiązki wypustek pomiędzy sferami (rys. 1A). W zależności od warunków hodowli zastosowanego typu komórek, matrycę można modyfikować, np. poprzez dodanie lamininy. Dla linii komórkowej hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina jest niezbędna do indukowania wzorca wzrostu z mniej gęstymi agregatami i bardziej jednorodnym rozkładem komórek (rys. 1B). Niezależnie od modyfikacji, matryca może być wykorzystywana do badania m.in. różnicowania neuronalnego. Rysunek 1C przedstawia barwienie hNPCs na marker neuronalny βIII-tubulinę. W tym przykładzie komórki hodowano przez 7 dni w matrycy, a następnie różnicowano przez 4 dni, przy czym różnicowanie indukowano poprzez usunięcie czynników wzrostu EGF i bFGF.¹³ Łatwo można rozpoznać ciała komórek oraz gęstą sieć wypustek zbudowaną przez komórki. Jest jednak oczywiste, że kwantyfikacja liczby komórek jest czasochłonna, ponieważ w celu uzyskania wiarygodnej bazy danych do analizy statystycznej należy przeanalizować dużą liczbę zdjęć z różnych obszarów matrycy. Na rys. 1D widoczny jest przykład komórek uwolnionych z matrycy i następnie wysianych na szkiełka podstawowe. Komórki te mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych.

Uwolnienie komórek z rusztowań 3D umożliwia analizę różnych parametrów, takich jak ekspresja białek markerowych czy przeżywalność komórek za pomocą barwienia AnnexinV/PI lub testu TUNEL. Rysunek 2 przedstawia przykład analizy cytometrycznej z przepływem komórek w celu określenia procentowej zawartości komórek βIII-tubulin⁺. Kontrolę negatywną (komórki nieoznaczone pod kątem βIII-tubuliny) przedstawiono na rysunku 2A. Kontrole te służą do wyznaczenia bramki dla późniejszej detekcji komórek βIII-tubulin⁺ (rys. 2B). Porównanie ręcznego liczenia komórek z analizą cytometryczną przedstawiono na rysunku 2C. Procent komórek βIII-tubulin⁺ określono poprzez zliczenie całkowitej liczby komórek (za pomocą barwienia jąder DAPI) oraz liczby komórek βIII-tubulin⁺ na zdjęciach fluorescencyjnych.

Rysunek 1. hNPCs hodowane w samomontującym się hydrożelu peptydowym PuraMatrix. A) hNPCs enkapsulowane w PuraMatrix (PM) rosną w formie sferycznych, gęsto upakowanych struktur, w których średnica sfer może osiągać nawet kilkaset μm. Pomiędzy sferami można rozpoznać pęczki wypustek tworzone przez komórki (strzałki). B) Komórki enkapsulowane w PuraMatrix z dodatkiem lamininy (PML) rosną w strukturach o mniejszej gęstości, bardziej jednorodnie rozłożonych. W macierzy z dodatkiem lamininy można rozpoznać pojedyncze komórki w obszarach o mniejszej gęstości (strzałki), jednak ilościowe określenie liczby komórek jest trudne. C) hNPCs różnicowane przez 4 dni w PML wykazują ekspresję markerów neuronalnych, takich jak βIII-tubulin (kolor zielony). Aby ocenić odsetek komórek pozytywnych, należy wyznaczyć całkowitą liczbę komórek za pomocą barwienia jąder, np. DAPI (kolor niebieski). Mikrofotografia przedstawia pełną projekcję stosu z-stack zdjęć wykonanych za pomocą mikroskopu Biozero-8000. D) Komórki uwolnione z macierzy mogą zostać wysiane np. na szkiełka nakrywkowe do dalszych badań funkcjonalnych. Mikrofotografia przedstawia komórki hodowane przez 3d po procedurze uwalniania. Barwienie na βIII-tubulin (kolor czerwony) wykazuje morfologię porównywalną do komórek hodowanych w rusztowaniu 3D.

Rycina 2. Analiza cytometrii przepływowej komórek uwolnionych z PuraMatrix. Aby uniknąć czasochłonnej kwantyfikacji mikrofotografii, zastosowano protokół uwalniania komórek hodowanych w PuraMatrix, co umożliwiło szybszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej. A) Niefarbowane komórki posłużyły jako kontrola negatywna do ustawienia bramki (czarna ramka) dla późniejszej analizy m.in. komórek βIII-tubuliny. B) Do określenia procentowej zawartości komórek βIII-tubulin⁺ wykorzystano tę samą bramkę, którą ustawiono w kontroli negatywnej. Komórki pozytywne znajdują się w prawej części osi x, gdzie zaobserwowano również populację pośrednią (ramka kropkowana), reprezentującą najprawdopodobniej debris komórkowy. C) Porównanie liczby komórek policzonych ręcznie oraz za pomocą cytometrii przepływowej wykazało znacznie wyższy odsetek komórek pozytywnych, przy czym zależność liczby komórek βIII-tubulin⁺ od czasu była porównywalna, co wskazuje na wiarygodność protokołu cytometrii przepływowej.

Dyskusja

Zastosowanie rusztowań 3D daje możliwość badania rozwoju różnych typów komórek w warunkach hodowli komórkowej bardziej zbliżonych do warunków in vivo. Jednakże w przypadku analizy m.in. różnicowania neuronalnego lub badań funkcjonalnych należy pokonać pewne przeszkody, aby uzyskać wiarygodne dane, np. do kwantyfikacji typów komórek.

W niniejszej pracy opisano hodowlę hNPC w rusztowaniu opartym na hydrożelu peptydowym PuraMatrix oraz późniejsze uwalnianie komórek do badań w układzie 2D...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
hydrożel peptydowy PuraMatrix	BD Biosciences	354250
Laminina I mysia	Cultrex	400-2009090
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
Normalne surowica kozia	Dako	X0907
Triton X-100	Carl Roth GmbH	3051.3
bufor PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14170-088	Hanks’ Zrównoważony roztwór soli 1X
βprzeciwciało przeciwko III-tubulinie	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-51670	mysi, monoklonalny, 1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11029	Koza α mysz, 1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11031	Koza α mysz, 1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21235	Koza α mysz, 1:1000
Odczynnik Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2,780-2	1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan 98%
Sito do komórek	BD Biosciences	352350	70 μwielkość porów m
Saponina	Merck & Co., Inc.	7695
Trypsyna/EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300-054
Benzonaza 250 U/μl	Merck & Co., Inc.	1.01654.0001
Inhibitor trypsyny	Sigma-Aldrich	T6522 (500 mg)
20% HSA	Octapharma	Albumin ludzka Kabi 20%