Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Podsumowanie

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na stymulacji ograniczonej przestrzennie (lokalnej) nocyceptorów termicznych^1,2, natomiast drugi obejmuje całkowitą (globalną) aktywację większości lub wszystkich takich neuronów³. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych neuronów sensorycznych nocyceptywnych Drosophila.

Streszczenie

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Pierwszy test polega na stymulacji lokalnej (przestrzenie ograniczonej) nocyceptorów termicznych^1,2, natomiast drugi polega na aktywacji globalnej większości lub wszystkich takich neuronów³. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych nocyceptywnych neuronów sensorycznych Drosophila.

Larwa Drosophila jest uznanym systemem modelowym do badania nocycepcji termicznej, czyli reakcji sensorycznej na potencjalnie szkodliwe temperatury, która jest konserwatywna ewolucyjnie u wielu gatunków^1,2. Zaletą wykorzystania Drosophila w takich badaniach jest relatywna prostota jej układu nerwowego oraz zaawansowanie technik genetycznych, które można zastosować do analizy molekularnych podstaw związanych z tą biologią^4-6. U Drosophila, podobnie jak u wszystkich metazoa, odpowiedź na szkodliwe bodźce termiczne objawia się zazwyczaj „nocyfensywnym”, awersyjnym wycofaniem się od prezentowanego bodźca⁷. Bodźce te są wykrywane przez wolne zakończenia nerwowe lub nocyceptory, a amplituda reakcji organizmu zależy od liczby nocyceptorów odbierających szkodliwy bodziec⁸. U Drosophila to neurony sensoryczne klasy IV o rozgałęzionym drzewie dendrytycznym wykrywają szkodliwe bodźce termiczne i mechaniczne⁹, poza ich niedawno odkrytą rolą jako fotoreceptorów¹⁰. Neurony te, bardzo dokładnie zbadane na poziomie rozwojowym, rozgałęziają się nad barierowym arkuszem epidermy i nawiązują kontakty z niemal wszystkimi komórkami epidermy^11,12. Pojedynczy akson każdego neuronu klasy IV projekuje do brzusznego sznura nerwowego ośrodkowego układu nerwowego¹¹, gdzie mogą one łączyć się z neuronami drugiego rzędu, które projekują do mózgu.

W warunkach bazowych neurony sensoryczne nocyceptywne nie będą generować impulsów, dopóki nie zostanie osiągnięty stosunkowo wysoki próg pobudzenia. Opisane tutaj testy pozwalają badaczowi na ilościowe określenie bazowych odpowiedzi behawioralnych lub, prawdopodobnie, uwrażliwienia, które następuje po uszkodzeniu tkanki. Każdy test wywołuje odmienne, ale powiązane reakcje behawioralne w zakresie lokomocji w odpowiedzi na szkodliwe bodźce termiczne, umożliwiając badaczowi wizualizację i kwantyfikację różnych aspektów nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Testy te można zastosować u larw o pożądanych genotypach lub u larw hodowanych w różnych warunkach środowiskowych, które mogą wpływać na nocycepcję. Ponieważ nocycepcja termiczna jest konserwatywna między gatunkami, wnioski płynące z analizy genetycznej u Drosophila prawdopodobnie przyczynią się do zrozumienia nocycepcji termicznej u innych gatunków, w tym u kręgowców.

Protokół

Typowy schemat kroków eksperymentalnych przygotowania larw prawidłowych lub uwrażliwionych na promieniowanie UV do dwóch testów nocycepcji termicznej przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przygotowanie larw

1. Larwy potomstwa płci męskiej i żeńskiej o pożądanym genotypie można testować bezpośrednio. Alternatywnie można przeprowadzić krzyżówkę genetyczną w celu uzyskania larw potomstwa o określonym, interesującym nas genotypie. Krzyżówki należy przeprowadzić w butelkach z pożywką dla much, wykorzystując 20-30 dziewiczych samic i 15-20 samców.
2. 5 dni po złożeniu jaj zebrać i oczyścić larwy wczesnego trzeciego stadium, usuwając miękką pożywkę i delikatnie płucząc pod bieżącą wodą przez sito o rozmiarze oczek 630 μm. Przenieść larwy wczesnego trzeciego stadium (o długości ok. 3-4 mm wzdłuż osi przednio-tylnej) na małą, wilgotną porcję pożywki, aby zapobiec ich zagłodzeniu i wysuszeniu. Jeśli testowana ma być sensytyzacja nocyceptywna, należy wykonać kolejne kroki 2.1- 2.11. Jeśli larwy mają być testowane bez uszkodzenia tkanek, przejść bezpośrednio do kroku 3.1.

2. Eteryzacja i naświetlanie promieniami UV

1. Przygotuj komorę do eteryzacji.
   1. Odetnij dno probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
   2. Za pomocą rozgrzanej metalowej szpatułki stop krawędź odciętej probówki.
   3. Przymocuj drobną siatkę do stopionej powierzchni probówki i pozostaw do ostygnięcia. Komora do eteryzacji umożliwi przedostawanie się oparów eteru, jednocześnie zapobiegając ucieczce larw.
2. Używając pęsety lub pędzla, ostrożnie umieść 10 larw wczesnego trzeciego stadium w wykonanej samodzielnie komorze do eteryzacji.
3. Ustaw larwy wzdłuż wewnętrznej strony pokrywki i zamknij ją.

Uwaga: Następne dwa kroki należy przeprowadzić w dygestorium, ponieważ eter jest substancją potencjalnie wybuchową, a jego opary mogą działać znieczulająco zarówno na ludzi, jak i na larwy.

4. Umieść komorę do eteryzacji zawierającą larwy w słoiku Coplina, w którym znajduje się zlewka o pojemności 10 ml z kulką waty nasączoną ~1,5 ml eteru dietylowego.
5. Zakręć słoik Coplina, aby wystawić larwy na działanie oparów eteru przez 2 do 2,5 minuty. Należy pamiętać, że dłuższy czas eteryzacji może negatywnie wpłynąć na zachowanie lub przeżywalność larw.
6. Po eteryzacji wyjmij komorę do eteryzacji ze słoika Coplina/zlewki, odczekując kilka sekund w dygestorium, aby opary eteru ulotniły się. Można teraz wyjść z dygestorium z powrotem do laboratorium.
7. Używając butelki z wodą do spryskiwania, delikatnie wypłucz larwy z komory do eteryzacji do małej szalki Petriego.
8. Używając pęsety i chusteczki Kimwipe, osusz znieczulone larwy i delikatnie przymocuj je grzbietem do góry do paska dwustronnej taśmy klejącej przyklejonej do szkiełka przedmiotowego o wymiarach 3" x 1".
9. Umieść szkiełko na dolnej powierzchni komory do naświetlania UV i wystaw larwy na działanie światła UV przez 6 sekund przy intensywności 20 mJ/cm².
10. Zanurz szkiełko w wodzie, aby delikatnie oddzielić larwy od dwustronnej taśmy klejącej.
11. Używając pęsety lub pędzla, delikatnie przenieś napromieniowane larwy do szklanej fiolki hodowlanej o wymiarach 15 x 45 mm zawierającej ~ 1,0 ml pożywki dla much, gdzie mogą regenerować się przez zmienny czas (8–24 godziny) w temperaturze 25 °C lub innej żądanej temperaturze hodowli przed ponownym pobraniem do testów nocycepcji termicznej.

3. Analiza z użyciem lokalnej sondy termicznej

Dostarczamy szkodliwy bodziec termiczny do pojedynczego segmentu ciała larwy, używając specjalnie zbudowanej sondy termicznej wykonanej przez Pro-Dev Engineering (patrz Tabela materiałów). Chociaż sonda ta posiada optymalne cechy konstrukcyjne (małą metalową końcówkę o powierzchni ok. .07 mm² oraz możliwość precyzyjnego utrzymania temperatury zadanej w zakresie od 23 °C do 65 °C), w zasadzie każde narzędzie z małą końcówką, którą można nagrzać do określonej temperatury przez okres do 20 sekund, powinno być wystarczające. Końcówkę sondy wykorzystuje się do stymulowania larw we wczesnym 3^rd stadium dokładnie w linii środkowej grzbietu na segmencie brzusznym A4 (patrz Rysunek 2). W odpowiedzi na ten bodziec termiczny larwy zazwyczaj wykazują awersyjny odruch wycofania polegający na obrocie bocznym o 360 stopni lub więcej. Zachowanie to różni się od ich odpowiedzi na lekki dotyk nieszkodliwej, metalowej sondy w temperaturze pokojowej, która zazwyczaj objawia się krótką przerwą w aktywności lokomocyjnej¹³.

Protokół analizy z wykorzystaniem sondy termicznej:

1. Ustaw temperaturę sondy termicznej na pożądaną wartość zadaną.
2. Za pomocą pędzla lub pęsety delikatnie przenieś pojedynczą larwę na płaską platformę (zazwyczaj używamy małego kawałka winylu wyciętego z segregatora), na której larwy będą następnie stymulowane. Przed kontaktem z sondą termiczną larwa powinna być pokryta cienką warstwą wody. Warstwa wody pokrywająca larwę powinna być jak najmniejsza, ale całkowicie ją zakrywać, zapewniając jednocześnie, że larwa nie jest sucha w momencie dotykania winylu.
3. Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larwy na wysokości segmentu A4, wywierając lekki nacisk pod kątem około 45° między sondą a powierzchnią larwy (patrz Rycina 2). Nacisk ten powinien spowodować lekkie wgłębienie na powierzchni larwy i zazwyczaj jest wystarczający, aby zapobiec lokomocji. Jeśli larwa nadal się porusza, należy zastosować nieco większy nacisk, co zazwyczaj spowoduje jej zatrzymanie. Nie rejestruj danych z larw, które przemieszczą się poza pole widzenia lub w przypadku których nie można utrzymać stałego kontaktu z sondą aż do wystąpienia reakcji lub upływu 20 s.
4. Kontynuuj stymulację larwy aż do wystąpienia reakcji wycofania lub do osiągnięcia limitu czasu 20 sekund, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Larwy reagujące zazwyczaj najpierw wykazują zachowanie wstępne w postaci unoszenia głowy i odwłoka. Następnie zazwyczaj występuje zachowanie wycofania polegające na obróceniu się o co najmniej 360 stopni. Tylko pełny obrót o 360 stopni jest klasyfikowany jako zachowanie nocyceptywne (wstępne uniesienie głowy lub odwłoka nie jest tak klasyfikowane).
5. Po zainicjowaniu zachowania wycofania przerwij kontakt z sondą i zarejestruj latencję lub czas do wycofania. Jeśli w ciągu 20 sekund nie zaobserwowano zachowania wycofania, larwa zostaje uznana za osobnika niereagującego. Osobniki reagujące można podzielić na 2 kategorie. Jeśli zachowanie wycofania wystąpi w ciągu 5 sekund, larwa jest osobnikiem szybko reagującym. Jeśli zachowanie wycofania wystąpi między 5 a 20 sekundami, larwa jest osobnikiem wolno reagującym (patrz Rycina 1 w Babcock, et al. 2009)¹.

4. Test płytki grzejnej w skali globalnej

Test z płytką grzejną został opracowany w celu pomiaru nocycepcji termicznej u larw Drosophila w sytuacji, gdy cały organizm jest narażony na szkodliwy bodziec termiczny. Pojedyncze larwy w połowie 3^rd stadium rozwojowego umieszcza się w kropli wody o objętości 80 μl na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm – schemat i zdjęcia konfiguracji testu przedstawiono na Rysunku 3. Szalkę Petriego umieszcza się następnie na litej płytce grzejnej (określanej jako „płyta grzejna”). Wraz ze wzrostem temperatury kropli wody larwa wykazuje serię pięciu stereotypowych zachowań, które określiliśmy jako gwałtowne ruchy głową, turlanie się, smaganie, drgawki i paraliż. Ponieważ zachowania te są w pewnym stopniu funkcją ustawionej temperatury płyty grzejnej oraz objętości wody, w której zanurzona jest larva, przedstawiamy tutaj warunki, które okazały się optymalne (płyta grzejna 95 °C, kropla wody 80 μl) dla obserwacji wszystkich 5 zachowań przy minimalnym ich nakładaniu się.

Protokół testu na płycie grzewczej:

1. Ustaw światłowodowe prowadnice światła tak, aby zapewnić odpowiednie, kontrastowe oświetlenie umożliwiające obserwację larwy. W razie potrzeby użyj larwy testowej. Moc światła powinna być ustawiona na niską, aby uniknąć nagrzewania larwy poddawanej badaniu przez ciepło otoczenia.
2. Włóż blok grzejny do płyty grzewczej płaską powierzchnią do góry, a następnie umieść płytę grzewczą na podstawie mikroskopu. Włącz płytę grzewczą w pozycji „High”, odczekaj około 15 minut do ustabilizowania temperatury i dostosuj ustawienia tak, aby uzyskać temperaturę powierzchni wynoszącą 95 °C.
3. Odmierz 80 μl wody destylowanej i za pomocą mikropipety nanieś kroplę wody na środek polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.
4. Za pomocą pęsety ostrożnie umieść czystą larwę w połowie 3^go stadium rozwojowego na środku kropli wody. Staraj się przenieść larwę z jak najmniejszą objętością wody, aby kropla poddawana podgrzewaniu pozostała jak najbliższa pierwotnej objętości 80 μl.
5. Ostrożnie umieść szalkę Petriego zawierającą kroplę wody i larwę na litym bloku grzejnym płyty grzewczej. Szybko skoryguj położenie szalki tak, aby cała larwa i kropla wody były widoczne. Patrz Rycina 3 i filmy 1-6.
6. Uruchom stoper w momencie umieszczenia szalki Petriego na litym bloku grzejnym płyty grzewczej i zapisz czas wystąpienia każdego zachowania. Jeśli jest to pożądane, zachowania można również zarejestrować w formie wideo – zaprezentowano reprezentatywne przykłady każdego zachowania w Filmach 1-5. Do nagrywania filmów użyto oprogramowania Leica w wersji 3.7, tryb nagrywania ustawiono na „Continuous”, rozdzielczość kamery wynosiła 3 Megapiksele (użyto zoomu 0,63x, przy którym obliczona rozdzielczość obrazu wynosi 10 μm/pixel), a liczba klatek na sekundę wynosiła 44,5.

5. Reprezentatywne wyniki

Test lokalnej sondy cieplnej:

Po kontakcie z sondą termiczną larwa zazwyczaj wykazuje wstępną reakcję polegającą na unoszeniu głowy i ogona. Zazwyczaj najpierw obserwuje się unoszenie głowy, a następnie ogona. Kilka sekund po tej wstępnej reakcji larwa zazwyczaj zaczyna toczyć się bocznie, co określamy mianem „zachowania ucieczkowego” (aversive withdrawal behavior). Czas, po którym występuje reakcja wstępna lub zachowanie ucieczkowe, może różnić się w zależności od temperatury lub tła genetycznego. W naszym wstępnym badaniu zmierzyliśmy odsetek larw wykazujących zachowanie ucieczkowe przy różnych temperaturach zadanych sondy i stwierdziliśmy, że 48 °C była najniższą temperaturą, przy której wszystkie larwy zareagowały szybko (< 5 s). Tutaj raportujemy istnienie górnego limitu odpowiedzi nocyceptywnej larw na bodziec termiczny (Rysunek 4A). 100% szybkich odpowiedzi obserwuje się do temperatury sondy 52 °C. Jednak przy 54 °C i wyższych, 90% lub więcej larw nie reaguje nawet po 20 s kontaktu. Larwy te nadal poruszają się po przekroczeniu limitu 20 s.

Jak wspomniano wcześniej¹, kategorie zachowań wycofania w każdej temperaturze można przedstawić na wykresach i porównać statystycznie. Biorąc pod uwagę, że jest to test behawioralny, występuje pewna zmienność między poszczególnymi larwami oraz pomiędzy użytkownikami. Aby to uwzględnić, zazwyczaj mierzymy 3 zestawy po 30 larw na każdy warunek testowy. Oprócz prostej kategoryzacji czasu utajenia wycofania, o której informowaliśmy wcześniej, wskazujemy tutaj, że można również zmierzyć amplitudę (liczbę obrotów lub czas spędzony na zachowaniach wycofania o charakterze awersyjnym) (patrz Rysunek 4). Co zaskakujące, wydaje się istnieć odwrotna zależność między temperaturą wejściową a intensywnością odpowiedzi, ponieważ niższe temperatury zdają się wywoływać większą liczbę obrotów (Rysunek 4B) i dłuższy czas spędzony na awersyjnym wycofaniu (dane nie pokazano). Może to wskazywać, że czas ekspozycji na temperaturę szkodliwą może być głównym czynnikiem determinującym intensywność reakcji.

Analiza na płytce grzejnej:

Po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytkę grzewczą obserwuje się pięć stereotypowych zachowań lokomocyjnych. Są one opisane poniżej i przedstawione w materiale wideo wraz z typowym zachowaniem lokomocyjnym niepodgrzanej larwy w wodzie. Średnie opóźnienia, przy których obserwuje się te zachowania, przedstawiono na rysunku 5A, podobnie jak średnie temperatury kropli wody zmierzone dla każdego opóźnienia. W optymalnych warunkach testu przedstawionych w niniejszej pracy odsetek larw wykazujących każde z odrębnych zachowań wynosił od 77 do 100 % (rysunek 5B), choć sporadycznie zachowania takie jak toczenie się i smaganie są pomijane, nakładają się na siebie lub występują w odwrotnej kolejności. Obserwowane zachowania, w kolejności chronologicznej, opisano w następujący sposób; można je obejrzeć w materiale wideo w czasach wskazanych poniżej:

1. Normalny ruch w temperaturze pokojowej: Lokomocja perystaltyczna z towarzyszącymi ruchami poszukiwawczymi głowy. Patrz wideo od 6:27.
2. Szarpnięcie głową: Larwa gwałtownie porusza głową do przodu lub na boki. Ruch ten jest podobny do normalnej lokomocji w wodzie (patrz Wideo 1), lecz odbywa się w sposób bardziej rwany i uporczywy. Patrz wideo od 6:40.
3. Przewrót: Larwa wykonuje obrót boczny o co najmniej pełne 360°. Patrz wideo od 6:50. Może to następować zmienną liczbę razy i czasami obejmować niepełne obroty. Na potrzeby oceny zachowania liczone są tylko pełne obroty o 360°. Zachowanie to jest najbardziej zbliżone do obserwowanego przy miejscowym zastosowaniu sondy termicznej.
4. Smagnięcie: Larwa wykazuje szybkie ruchy skurczu i rozkurczu wzdłuż osi przednio-tylnej, które sprawiają, że głowa przez bardzo krótką chwilę znajduje się blisko ogona. Patrz wideo od 7:11. Smagnięcia są często obserwowane w szybkiej sekwencji po przewrotach lub równocześnie z nimi.
5. Drgawki: Larwa wyprostowuje się wzdłuż osi przednio-tylnej i wykazuje wysokoczęstotliwościowe drżenia całego ciała bez zginania. Patrz wideo od 7:25.
6. Paraliż: Larwa przestaje się poruszać. U niektórych larw stan ten jest trwały, podczas gdy inne wykazują następnie niskoczęstotliwościowe ruchy pulsacyjne. Patrz wideo od 7:36.

Dane te sugerują, że temperatura kropli wody oraz czas utajenia do wystąpienia pięciu charakterystycznych zachowań obserwowanych podczas ogólnego podgrzewania larwy/kropli wody są silnie skorelowane.

Rycina 1. Schemat etapów eksperymentalnych przygotowania i badania larw. Przed badaniem nocycepcji za pomocą sondy cieplnej lub płyty grzejnej, larwy pochodzące z konkretnej linii lub krzyżówki genetycznej są zbierane i oczyszczane z pożywki. W przypadku oceny uwrażliwienia nocyceptywnego (w przeciwieństwie do nocycepcji bazowej), po zbiorze następuje eteryzacja (ekspozycja na eter), montaż, naświetlanie UV oraz okres rekonwalescencji na pożywce dla muszek. Zebrane lub zregenerowane larwy są następnie poddawane działaniu szkodliwych temperatur testowych przy użyciu sondy cieplnej (lokalnie) lub płyty grzejnej (globalnie). Numery odnoszą się do sekcji tekstu metodologicznego opisujących przedstawione etapy.

Rysunek 2. Układ eksperymentalny do badania z wykorzystaniem lokalnej sondy cieplnej. Sonda cieplna jest sterowana przez jednostkę kontroli termicznej, która służy do ustawiania i utrzymywania temperatury sondy. Sondę trzymano prostopadle do osi przednio-tylnej i wykorzystywano do stymulacji larwy pod kątem 45° względem poziomu. Kontakt sondy nawiązywano konkretnie w obrębie segmentu brzusznego A4, jak pokazano na schemacie. Operator musi utrzymywać ten kontakt, przykładając delikatny nacisk aż do osiągnięcia 20 sekundowego limitu czasu lub do momentu rozpoczęcia zachowania rolowania. Jeśli temperatura zostanie odebrana jako szkodliwa, larwa wykaże awersyjne zachowanie wycofania, charakteryzujące się przynajmniej jednym obrotem o 360°. Liczba obrotów może być pojedyncza lub wielokrotna (patrz Rysunek 4B).

Rycina 3. Układ eksperymentalny dla testu z płytą grzewczą. (A) Schematyczna widok z boku szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm zawierającej jedną larwę w połowie 3^rd stadium w kropli wody o objętości 80 μl. (B) Schematyczny widok z góry larwy umieszczonej w środku kropli wody widzianej przez mikroskop. (C) Fotografia stanowiska pracy do tego testu widzianego z boku. (D) Fotografia larwy widzianej przez mikroskop.

Rycina 4. Ilościowe określenie odpowiedzi behawioralnej z wykorzystaniem testu z sondą termiczną. (A) Wykres procentowej liczby osobników reagujących należących do każdej kategorii (reagujący szybko, reagujący wolno i niereagujący) w funkcji temperatury. (B) Wykres czasu utajenia reakcji unikania w funkcji liczby obrotów wykonanych przez każdą larwę w czterech różnych temperaturach testowych o rosnącym stopniu szkodliwości (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C i 52 °C).

Rycina 5. Test na płycie grzejnej: Latencja i temperatura w zależności od zachowania. (A) Latencja i średnia temperatura kropli wody dla każdej odpowiedzi behawioralnej w optymalnych warunkach: 95 °C (temperatura powierzchni płyty grzejnej) i 80 μl kropli wody (n = 150). Należy zauważyć, że każde zachowanie jest obserwowane w określonym przedziale czasowym. Temperatury kropli wody mierzono za pomocą termopary wprowadzonej do górnej lub dolnej części kropli (n = 10 kropli dla każdej lokalizacji), a następnie wyciągnięto z nich średnią. (B) Procent larw wykazujących każdą z odpowiedzi behawioralnych w optymalnych warunkach testu. Miotanie się, drgawki i paraliż obserwuje się w niemal 100% przypadków, natomiast toczenie się i smaganie w 77% i 80% przypadków, odpowiednio. Przy niższych ustawieniach temperatury powierzchni drgawki i paraliż nie są obserwowane w ciągu 200 s, a przy wyższych ustawieniach toczenie się i smaganie mogą zostać pominięte lub wystąpić jednocześnie. n = 150. (C) Procent larw, które przeżyły po wystąpieniu zachowania paraliżu. Larwy podgrzewano aż do rozpoczęcia paraliżu, a następnie przeniesiono do standardowych warunków hodowli w celu regeneracji. Larwy w grupie kontrolnej (mock-treated) poddano analogicznym zabiegom, z wyjątkiem ekspozycji na ciepło. Powstawanie poczwarek i żywotnych osobników dorosłych ilościowo określono w dniach 7–13. n = 120.

Rycina 6. Inaktywacja larwalnych nocyceptywnych neuronów sensorycznych zwiększa czas utajenia reakcji behawioralnych. Wykres czasu utajenia dla każdego zachowania dla wskazanych genotypów: w¹¹¹⁸, Gal4^109(2)80 = md-Gal4/+, UAS-Ork1.Δ-C/+, UAS-Ork1.Δ-NC /+, md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-C oraz md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. md-Gal4 steruje ekspresją transgenów regulowanych przez UAS we wszystkich czterech klasach wielodendrytycznych obwodowych neuronów sensorycznych; UAS-Ork1.Δ-C¹⁴ wykazuje ekspresję zmodyfikowanej wersji otwartego kanału K+ typu prostownika Drosophila niezbędnego do przekazywania sygnałów synaptycznych, a UAS-Ork1.Δ-NC¹⁴ wykazuje ekspresję dalej zmodyfikowanej wersji tego samego kanału, która nie zakłóca przekazywania synaptycznego. Należy zauważyć, że tylko larwy posiadające zarówno driver md-Gal4⁶, jak i transgen UAS-Ork1.Δ-C wykazują zwiększony czas utajenia dla czterech z pięciu obserwowanych zachowań (miotania się, toczenia, drgawek i paraliżu). Zauważalna jest również zależność, zgodnie z którą ze względu na zwiększony czas utajenia toczenia się, zwierzęta te smagają się przed rozpoczęciem toczenia. Gwiazdka oznacza p < 0.05 w teście t Studenta. n = 30 larw na genotyp.

Wideo uzupełniające 1. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 2. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 3. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 4. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Film uzupełniający 5. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Wideo uzupełniające 6. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Dyskusja

Opisane tutaj testy mogą być wykorzystane do jakościowej i ilościowej oceny reaktywności larw różnych genotypów na szkodliwe bodźce termiczne. Główną cechą testu z sondą grzewczą jest to, że bodziec jest przykładany tylko w jednym miejscu. Prawdopodobnie prowadzi to do aktywacji jedynie niewielkiej grupy neuronów klasy IV – tych znajdujących się w segmencie kontaktu z sondą oraz być może w segmentach bezpośrednio sąsiednich¹¹. Ze względu na lokalną stymulację, test z sondą grzewczą naśladuje powszechne doświadczenie sensoryczne wykrywania szkodliwego bodźca zlokalizowanego w konkretnym regionie ciała – na przykład kontaktu dłoni z gorącą kuchenką. Wadą testu z sondą grzewczą jest pewna zmienność zależna od operatora, którą można prawdopodobnie przypisać trzem czynnikom: i) naciskowi, z jakim operator przykładuje sondę do larwy, ii) precyzyjnej lokalizacji sondy na larwie względem leżących poniżej neuronów nocyceptywnych oraz iii) dokładnemu kątowi, pod którym sonda styka się z powierzchnią larwy.

Wcześniej opisaliśmy ilościową strategię kategoryzacji larw na nieodpowiadające, wolno odpowiadające i szybko odpowiadające w oparciu o czas latencji wycofania w odpowiedzi na określoną temperaturę¹. W niniejszej pracy raportujemy reakcję larw na jeszcze wyższe temperatury. Co ciekawe, odkryliśmy, że istnieje górna granica termicznych odpowiedzi nocyceptywnych u larw i że granica ta znajduje się między 52 a 54 °C. Może to wskazywać, że larwy nie posiadają kanału potencjału przejściowego (TRP) zdolnego do otwierania się w temperaturach wyższych niż 52 °C. Alternatywnie może to sugerować, że neurony lub mięśnie wykorzystywane do inicjowania lub wykonywania odpowiedzi motorycznej ulegają uszkodzeniu, zanim zdołają one funkcjonować w mechanizmie unikowym wycofania. Przedstawiamy również inną analizę amplitudy odpowiedzi wycofania, wykorzystując liczbę obrotów jako wskaźnik „siły” reakcji. Intuicyjnie można by oczekiwać, że parametry te będą rosły wraz ze wzrostem temperatury lub czasu stymulacji. Zaskakujące jest to, że tak nie jest. Larwy stymulowane przez dłuższy czas w temperaturze z dolnego zakresu szkodliwego (42 °C) wykonują więcej obrotów i spędzają więcej czasu na rolowaniu niż larwy badane w wyższych temperaturach (48-52 °C). Sugeruje to, że w obrębie okna temperatur szkodliwych to przede wszystkim czas ekspozycji determinuje amplitudę odpowiedzi. Ponieważ larwy poddane bardzo szkodliwym temperaturom (48-52 °C) reagują średnio bardzo szybko, nie wykonują tak wielu obrotów jak larwy poddane mniej szkodliwej temperaturze przez dłuższy czas. Opisana tutaj analiza amplitudy odpowiedzi dodaje kolejny wymiar ilościowy, w ramach którego można porównywać różne genotypy lub manipulacje środowiskowe.

Główną cechą testu na płytce grzewczej jest to, że wiąże się on z globalną ekspozycją na szkodliwe ciepło. W związku z tym jest on bardziej zbliżony do sytuacji, w której zwierzę znajduje się w rozgrzanym kotle, niż do dotknięcia gorącej kuchenki. Chociaż nie jest jasne, kiedy larwa może doświadczyć globalnego bodźca szkodliwego w naturze, w warunkach laboratoryjnych reakcje behawioralne na taką globalną ekspozycję są bardziej złożone niż te obserwowane podczas stymulacji miejscowej. Atutem testu na płytce grzewczej, zauważony również przez innych autorów³, jest niewielka zmienność między użytkownikami, ponieważ dotykanie larwy nie jest elementem protokołu. Jedyną istotną zmienną wydaje się być definiowanie momentu rozpoczęcia każdego zachowania, co można zminimalizować poprzez wielokrotną obserwację i oswojenie się z procedurą. Interesującą różnicą między testami są temperatury, przy których rozpoczynają się zachowania awersyjne. Są one znacznie niższe w teście na płytce grzewczej niż w przypadku sondy grzewczej. Wstępne zachowanie wykazywane przez larwy w kontakcie z sondą grzewczą (podnoszenie głowy i ogona) może być korelatem gwałtownych ruchów głową obserwowanych w temperaturze ok. 27 °C w teście na płytce grzewczej. Możliwe, że reakcja ta odzwierciedla raczej „dyskomfort” niż „ból”. W teście z sondą grzewczą nie zaobserwowaliśmy korelatów smagania, drgawek i paraliżu nawet w wysokich temperaturach (do 48 °C); może to oznaczać, że do wywołania tych zachowań niezbędna jest krytyczna masa wyładowań neuronów sensorycznych z więcej niż jednego regionu ciała. Co ciekawe, zachowania takie jak drgawki i paraliż obserwuje się w temperaturach (~34 – 37 °C) poniżej dolnej granicy progu nocyceptywnego odnotowanego przy użyciu sondy grzewczej, co wskazuje, że stymulacja globalna może wiązać się z sumowaniem odpowiedzi neuronalnych, które są niewystarczające do wywołania zachowania przy miejscowym zastosowaniu sondy grzewczej. Fakt, że temperatury te są rzeczywiście odczuwane przez larwy jako szkodliwe, potwierdza obserwacja, że larwy, u których rozpoczyna się paraliż, a następnie pozostawia się je do regeneracji na pożywce dla much, w większości przypadków nie przeżywają (Rysunek 5C). Argument, że test na płytce grzewczej odczytuje odpowiedzi nocyceptywne, wspiera również fakt, że blokowanie przekazywania synaptycznego w znanych nocyceptywnych neuronach sensorycznych zwiększa latencję większości obserwowanych zachowań (Rysunek 6). Obserwacja, że w przypadku zachowania smagania w wyższych temperaturach nie następuje zwiększenie latencji, sugeruje, że do tego zachowania mogą być wymagane inne neurony sensoryczne, które nie wykazują ekspresji md-Gal4.

Podsumowując, oba testy polegają na poddaniu pojedynczej larwy szkodliwemu bodźcom termicznym o określonej temperaturze – w teście lokalnym jest to gorący czubek małej metalowej sondy, a w teście globalnym zanurzenie w kropli szybko nagrzewanej wody. Za pomocą tych testów można badać i kwantyfikować odpowiedzi behawioralne larw Drosophila o różnych podłożach genetycznych i/lub wystawionych na różne warunki środowiskowe (na przykład z uszkodzeniem tkanek lub bez niego). Ostatecznie wyniki tych badań pomogą nam lepiej zrozumieć sieci genetyczne kontrolujące nocycepcję u Drosophila oraz innych pokrewnych gatunków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sonda termiczna	Pro-Dev Engineering	Budowa na zamówienie	Informacje kontaktowe dostępne na żądanie
Inkubator z suchą kąpielą	Fisher Scientific	11-718	1 jednolity blok grzewczy i 1 blok grzewczy z otworami 16mm
Kamera kolorowa Leica DFC290 12v/400mA	Leica Microsystems	12730080	Można użyć dowolnej równoważnej kamery.
Mikroskop Leica MZ6	Leica Microsystems	Numer katalogowy korpusu zoom MZ6 (nośnik optyki) to 10445614
Jednostka Modulamp Schott Ace	Schott AG	A20500
Podwójny gęsi szyja 23-calowy światłowodowy przewód światłowodowy Schott	Schott AG	Schott A08575
Jednostka kontroli termicznej	TSCI corp.	Budowa na zamówienie	Szczegóły dostępne na żądanie
Mikroskop Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Można użyć dowolnego równoważnego mikroskopu.
Pęseta	Fine Science Tools	FS-1670
Sito o oczkach 1mm	Genesee Scientific	57-101
Pędzel	Blick Art Materials	06762-1002
Crosslinker UV	Fisher Scientific	1199289
Słoiki Coplin	Fisher Scientific	08-816
Zlewka 10ml	Fisher Scientific	02-540C
Eter dietylowy	Fisher Scientific	E138-500
Polistyrenowa szalka Petri 35 X 10 mm	Falcon BD	351008	Nie testowaliśmy alternatywnych szalek.
Szkiełko mikroskopowe	Corning	26003
Termopara	Omega Engineering, Inc.	HH802U
Kawałek winylu	Office Depot	480009
Probówka do mikrocentryfugi	Denville Scientific	C-2170