Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Podsumowanie

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na stymulacji ograniczonej przestrzennie (lokalnej) nocyceptorów termicznych^1,2, natomiast drugi obejmuje całkowitą (globalną) aktywację większości lub wszystkich takich neuronów³. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych neuronów sensorycznych nocyceptywnych Drosophila.

Streszczenie

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Pierwszy test polega na stymulacji lokalnej (przestrzenie ograniczonej) nocyceptorów termicznych^1,2, natomiast drugi polega na aktywacji globalnej większości lub wszystkich takich neuronów³. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych nocyceptywnych neuronów sensorycznych Drosophila.

Larwa Drosophila jest uznanym systemem modelowym do badania nocycepcji termicznej, czyli reakcji sensorycznej na potencjalnie szkodliwe temperatury, która jest konserwatywna ewolucyjnie u wielu gatunków^1,2. Zaletą wykorzystania Drosophila w takich badaniach jest relatywna prostota jej układu nerwowego oraz zaawansowanie technik genetycznych, które można zastosować do analizy molekularnych podstaw związanych z tą biologią^4-6. U Drosophila, podobnie jak u wszystkich metazoa, odpowiedź na szkodliwe bodźce termiczne objawia się zazwyczaj „nocyfensywnym”, awersyjnym wycofaniem się od prezentowanego bodźca⁷. Bodźce te są wykrywane przez wolne zakończenia nerwowe lub nocyceptory, a amplituda reakcji organizmu zależy od liczby nocyceptorów odbierających szkodliwy bodziec⁸. U Drosophila to neurony sensoryczne klasy IV o rozgałęzionym drzewie dendrytycznym wykrywają szkodliwe bodźce termiczne i mechaniczne⁹, poza ich niedawno odkrytą rolą jako fotoreceptorów¹⁰. Neurony te, bardzo dokładnie zbadane na poziomie rozwojowym, rozgałęziają się nad barierowym arkuszem epidermy i nawiązują kontakty z niemal wszystkimi komórkami epidermy^11,12. Pojedynczy akson każdego neuronu klasy IV projekuje do brzusznego sznura nerwowego ośrodkowego układu nerwowego¹¹, gdzie mogą one łączyć się z neuronami drugiego rzędu, które projekują do mózgu.

W warunkach bazowych neurony sensoryczne nocyceptywne nie będą generować impulsów, dopóki nie zostanie osiągnięty stosunkowo wysoki próg pobudzenia. Opisane tutaj testy pozwalają badaczowi na ilościowe określenie bazowych odpowiedzi behawioralnych lub, prawdopodobnie, uwrażliwienia, które następuje po uszkodzeniu tkanki. Każdy test wywołuje odmienne, ale powiązane reakcje behawioralne w zakresie lokomocji w odpowiedzi na szkodliwe bodźce termiczne, umożliwiając badaczowi wizualizację i kwantyfikację różnych aspektów nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Testy te można zastosować u larw o pożądanych genotypach lub u larw hodowanych w różnych warunkach środowiskowych, które mogą wpływać na nocycepcję. Ponieważ nocycepcja termiczna jest konserwatywna między gatunkami, wnioski płynące z analizy genetycznej u Drosophila prawdopodobnie przyczynią się do zrozumienia nocycepcji termicznej u innych gatunków, w tym u kręgowców.

Protokół

Typowy schemat kroków eksperymentalnych przygotowania larw prawidłowych lub uwrażliwionych na promieniowanie UV do dwóch testów nocycepcji termicznej przedstawiono na Ryc. 1.

1. Przygotowanie larw

1. Larwy potomstwa płci męskiej i żeńskiej o pożądanym genotypie można badać bezpośrednio. Alternatywnie można przeprowadzić krzyżówkę genetyczną w celu uzyskania larw potomstwa o określonym, interesującym nas genotypie. Krzyżówki należy przeprowadzić w butelkach z pożywką dla much, wykorzystując 20-30 dziewiczych samic i 15-20 samców.
2. 5 dni po zniesieniu jaj zbiera się i oczyszcza larwy z wczesnego trzeciego stadium, usuwając miękką pożywkę i delikatnie płucząc pod bieżącą wodą przez sito o rozmiarze oczek 630 μm. Larwy z wczesnego trzeciego stadium (o długości ok. 3-4 mm wzdłuż osi przednio-tylnej) należy przenieść na małą, wilgotną porcję pożywki, aby zapobiec głodowaniu i wysychaniu. Jeśli badana jest sensytyzacja nocyceptywna, należy wykonać kolejne kroki 2.1- 2.11. Jeśli larwy mają być badane bez uszkodzenia tkanek, należy przejść bezpośrednio do kroku 3.1.

2. Eteryzacja i naświetlanie UV

1. Przygotuj komorę do eteryzacji.
   1. Odetnij dno probówki do mikrowirówki o objętości 1,5 ml.
   2. Za pomocą rozgrzanej metalowej szpatułki stop krawędź odciętej probówki.
   3. Przymocuj gęstą siatkę do stopionej powierzchni probówki i odczekaj do ostygnięcia. Komora do eteryzacji umożliwi przedostawanie się oparów eteru, ale zapobiegnie ucieczce larw.
2. Używając pęsety lub pędzla, delikatnie umieść 10 larw wczesnego trzeciego stadium w wykonanej komorze do eteryzacji.
3. Ułóż larwy wzdłuż wewnętrznej strony pokrywki i zamknij ją.

Uwaga: Kolejne dwa kroki należy przeprowadzić w dygestorium, ponieważ eter jest substancją potencjalnie wybuchową, a jego opary mogą działać znieczulająco na człowieka, jak i na larwę.

4. Umieścić komorę do eteryzacji zawierającą larwy w słoiku Coplina, w którym znajduje się zlewka o pojemności 10 ml z kulką waty nasączoną ~1.5 ml eteru dietylowego.
5. Zakręcić słoik Coplina, aby poddać larwy działaniu oparów eteru przez 2 do 2.5 minuty. Należy pamiętać, że dłuższy czas eteryzacji może niekorzystnie wpłynąć na zachowanie lub przeżywalność larw.
6. Po eteryzacji wyjąć komorę z słoika Coplina/zlewki i odczekać kilka sekund w dygestorium, aż opary eteru się rozproszą. Można teraz przenieść się z dygestorium z powrotem do laboratorium.
7. Za pomocą butelki z wodą delikatnie wypłukać larwy z komory do eteryzacji do małej szalki Petriego.
8. Używając pęsety i chusteczki Kimwipe, osuszyć znieczulone larwy i delikatnie przymocować je grzbietem do góry do paska dwustronnej taśmy klejącej przytwierdzonej do szkiełka przedmiotowego o wymiarach 3" x 1".
9. Położyć szkiełko na dolnej powierzchni komory do naświetlania UV i naświetlać larwy światłem UV przez 6 sekund przy intensywności 20 mJ/cm².
10. Zanurzyć szkiełko w wodzie, aby delikatnie oddzielić larwy od dwustronnej taśmy klejącej.
11. Używając pęsety lub pędzla, delikatnie przenieść napromieniowane larwy do szklanej fiolki hodowlanej o wymiarach 15 x 45 mm zawierającej ~1.0 ml pożywki dla muszek, gdzie mogą one regenerować się przez zmienny czas (8 -24 godziny) w temperaturze 25 °C lub innej pożądanej temperaturze hodowli przed ponownym pobraniem do testów nocycepcji termicznej.

3. Analiza z użyciem lokalnej sondy cieplnej

Dostarczamy szkodliwy bodziec termiczny do pojedynczego segmentu ciała larwy za pomocą specjalnie skonstruowanej sondy termicznej wyprodukowanej przez Pro-Dev Engineering (patrz Tabela materiałów). Chociaż sonda ta posiada optymalne cechy konstrukcyjne (mały metalowy grot o powierzchni ~ .07 mm² oraz możliwość precyzyjnego utrzymania zadanej temperatury od 23 °C do 65 °C), w zasadzie każde narzędzie z małym grotem, który może być podgrzany do określonej temperatury przez czas do 20 sekund, powinno być wystarczające. Grota sondy używa się do stymulowania wczesnych larw 3^rd stadium dokładnie w linii środkowej grzbietowej w segmencie odwłosa A4 (patrz Rysunek 2). W odpowiedzi na ten bodziec termiczny larwy zazwyczaj wykazują awersyjny odruch wycofania polegający na zwijaniu się bocznie o 360 stopni lub więcej. Zachowanie to różni się od ich reakcji na lekki dotyk nieszkodliwej, metalowej sondy w temperaturze pokojowej, która zazwyczaj objawia się krótką przerwą w aktywności lokomocyjnej¹³.

Protokół analizy z użyciem sondy termicznej:

1. Ustaw temperaturę sondy termicznej na pożądaną wartość.
2. Używając pędzelka lub pęsety, delikatnie przenieś pojedynczą larwę na płaską platformę (zazwyczaj używamy małego kawałka winylu wyciętego z segregatora), na której larwy będą następnie stymulowane. Przed kontaktem z sondą termiczną larwa powinna być pokryta cienką warstwą wody. Warstwa wody pokrywająca larwę powinna być jak najcieńsza, ale całkowicie zakrywać larwę, zapewniając, że nie będzie ona sucha w momencie zetknięcia z winylem.
3. Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larwy w obrębie segmentu A4, wywierając lekki nacisk końcówką pod kątem około 45° między sondą a powierzchnią larwy (patrz Rycina 2). Nacisk powinien spowodować niewielkie wgłębienie w powierzchni larwy i zazwyczaj będzie wystarczający, aby zapobiec lokomocji. Jeśli larwa nadal się porusza, należy zastosować nieco większy nacisk, co zazwyczaj spowoduje jej zatrzymanie. Nie zapisuj danych z larw, które wyjdą poza pole widzenia lub w przypadku których nie można utrzymać stałego kontaktu z sondą aż do wystąpienia odpowiedzi lub osiągnięcia limitu czasu 20 s.
4. Kontynuuj stymulację larwy, aż wystąpi reakcja wycofania lub do momentu osiągnięcia 20-sekundowego limitu czasu, w zależności od tego, co nastąpi pierwsze. Larwy reagujące zazwyczaj najpierw wykazują wstępne zachowanie polegające na unoszeniu głowy i ogona. Następnie zazwyczaj następuje zachowanie wycofania w postaci obrotu o co najmniej 360 stopni. Tylko pełny obrót o 360 stopni jest oceniany jako zachowanie nocyfencyjne (wstępne uniesienie głowy lub ogona nie jest tak oceniane).
5. Po rozpoczęciu zachowania wycofania przerwij kontakt z sondą i zapisz latencję lub czas do wycofania. Jeśli w ciągu 20 sekund nie zaobserwowano zachowania wycofania, larwa jest uznawana za osobnika niereagującego. Osobniki reagujące można podzielić na dwie kategorie. Jeśli zachowanie wycofania wystąpi w ciągu 5 sekund, larwa jest szybka reagująca. Jeśli zachowanie wycofania wystąpi między 5 a 20 sekundą, larwa jest wolno reagująca (patrz Rycina 1 w Babcock, et al. 2009)¹.

4. Globalny test z płytą grzejną

Test na płycie grzewczej został opracowany w celu pomiaru nocycepcji termicznej u larw Drosophila w sytuacji, gdy cały organizm jest poddany szkodliwemu bodźcowi termicznemu. Pojedyncze larwy w połowie 3^rd stadium rozwojowego umieszcza się w kropli 80 μl wody na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm – schemat oraz zdjęcia konfiguracji testu przedstawiono na Rysunku 3. Szalkę Petriego umieszcza się następnie na stałym bloku grzejnym (zwanym „płytą grzewczą”). W miarę wzrostu temperatury kropli wody larwa wykazuje szereg pięciu stereotypowych zachowań, które określiliśmy jako gwałtowne ruchy głową (head thrash), toczenie się (roll), smaganie (whip), drgawki (seizure) i paraliż (paralysis). Ponieważ zachowania te są w pewnym stopniu funkcją ustawionej temperatury płyty grzewczej oraz objętości wody, w której zanurzona jest larwa, przedstawiamy tutaj warunki, które okazały się optymalne (płyta grzewcza 95 °C, kropla wody 80 μl) dla obserwacji wszystkich 5 zachowań przy minimalnym nakładaniu się na siebie.

Protokół testu na płycie grzejnej:

1. Ustaw światłowodowe prowadnice świetlne tak, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie o wysokim kontraście do obserwacji larwy. W razie potrzeby użyj larwy testowej. Moc światła powinna być ustawiona na niską, aby uniknąć nagrzewania larwy poddawanej badaniu.
2. Umieść blok grzejny na płycie grzewczej płaską powierzchnią do góry, a następnie ustaw płytę grzewczą na podstawie mikroskopu. Włącz płytę grzewczą w pozycji „High”, odczekaj około 15 minut do ustabilizowania się temperatury i dostosuj ją tak, aby uzyskać temperaturę powierzchni 95 °C.
3. Odmierz 80 μl wody destylowanej i za pomocą mikropipety nanieś kroplę wody na środek polistyrenowej szalki Petri o wymiarach 60 x 15 mm.
4. Za pomocą pincety ostrożnie umieść czystą larwę w połowie 3^rd stadium w centrum kropli wody. Staraj się przenosić larwę z jak najmniejszą objętością wody, aby kropla przeznaczona do podgrzania pozostała jak najbliższa pierwotnym 80 μl.
5. Ostrożnie ustaw szalkę Petri zawierającą kroplę wody i larwę na litej blokowej grzałce na płycie grzewczej. Szybko skoryguj położenie szalki tak, aby cała larwa i kropla wody były widoczne. Patrz Rysunek 3 i filmy 1-6.
6. Uruchom stoper w momencie umieszczenia szalki Petri na litej blokowej grzałce płyty grzewczej i zapisuj czas wystąpienia każdego zachowania. W razie potrzeby zachowania można również rejestrować wideo – patrz Filmy 1-5 w celu uzyskania reprezentatywnych przykładów każdego zachowania. Do nagrywania filmów użyto oprogramowania Leica w wersji 3.7; tryb nagrywania ustawiono na „Continuous”, rozdzielczość kamery wynosiła 3 Megapiksele (zastosowano zoom 0,63x, przy którym obliczona rozdzielczość obrazu wynosi 10 μm/pixel), a liczba klatek na sekundę wynosiła 44,5.

5. Reprezentatywne wyniki

Analiza za pomocą lokalnej sondy cieplnej:

Po kontakcie z sondą termiczną larwa zazwyczaj wykazuje wstępną reakcję polegającą na unoszeniu głowy i odwłoka. Zazwyczaj w pierwszej kolejności obserwuje się unoszenie głowy, a następnie odwłoka. Kilka sekund po tym wstępnym zachowaniu larwa zazwyczaj zaczyna toczyć się bocznie, co określamy jako „zachowanie unikania” (aversive withdrawal behavior). Czas, po którym pojawia się zachowanie wstępne lub reakcja unikania, może różnić się w zależności od temperatury lub tła genetycznego. W naszym wstępnym badaniu zmierzyliśmy odsetek larw wykazujących reakcję unikania w różnych temperaturach zadanych sondy i stwierdziliśmy, że 48 °C była najniższą temperaturą, przy której wszystkie larwy zareagowały szybko (< 5 s). Tutaj raportujemy, że odpowiedź nocycepcji termicznej larw ma swój górny limit (Rycina 4A). 100% szybkich odpowiedzi obserwuje się do temperatury sondy 52 °C. Jednak w temperaturze 54 °C i wyższej 90% lub więcej larw nie reaguje nawet po 20 s kontaktu. Larwy te kontynuują ruch po upływie 20 s czasu pomiaru.

Jak wspomniano wcześniej¹, kategorie zachowań wycofania w każdej temperaturze mogą zostać przedstawione na wykresie i porównane statystycznie. Ze względu na to, że jest to test behawioralny, występuje pewna zmienność między poszczególnymi larwami oraz między poszczególnymi użytkownikami. Aby to uwzględnić, zazwyczaj mierzymy 3 zestawy po 30 larw na każdy warunek testowy. Oprócz prostej kategoryzacji czasu utajenia wycofania, o której raportowaliśmy wcześniej, wskazujemy tutaj, że można również zmierzyć amplitudę (liczbę obrotów lub czas spędzony na zachowaniu awersyjnego wycofania) (patrz Rysunek 4). Co zaskakujące, wydaje się istnieć odwrotna zależność między temperaturą wejściową a intensywnością reakcji, ponieważ niższe temperatury zdają się wywoływać większą liczbę obrotów (Rysunek 4B) oraz dłuższy czas spędzony na awersyjnym wycofaniu (dane nie zostały przedstawione). Może to wskazywać, że czas ekspozycji na szkodliwą temperaturę jest głównym czynnikiem determinującym intensywność odpowiedzi.

Analiza na płytce grzewczej:

Po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytkę grzewczą obserwuje się pięć stereotypowych zachowań lokomocyjnych. Są one opisane poniżej i pokazane na filmie wraz z typowym zachowaniem lokomocyjnym niepodgrzewanej larwy w wodzie. Średnie latencje, przy których obserwuje się te zachowania, przedstawiono na Rysunku 5A, podobnie jak średnie temperatury kropli wody zmierzone dla każdej latencji. W optymalnych warunkach testowych przedstawionych w niniejszym opracowaniu procent larw wykazujących każde z odrębnych zachowań mieścił się w zakresie od 77 do 100% (Rysunek 5B), choć sporadycznie zachowania toczenia i smagania są pomijane, nakładają się na siebie lub występują w odwrotnej kolejności. Obserwowane zachowania, w kolejności chronologicznej, opisano następująco i można je obejrzeć na filmie w wskazanych poniżej momentach:

1. Normalny ruch w temperaturze pokojowej: Lokomocja perystaltyczna towarzysząca ruchom poszukiwawczym głowy. Patrz wideo od 6:27.
2. Gwałtowne ruchy głowy (Head Thrash): Larwa szybko porusza głową w kierunku przednim lub bocznym. Ruch ten przypomina ich normalną lokomocję w wodzie (patrz Wideo 1), ale ma charakter bardziej szarpany i uporczywy. Patrz wideo od 6:40.
3. Przewrot (Roll): Larwa wykonuje pełny obrót boczny o co najmniej 360°. Patrz wideo od 6:50. Może to wystąpić zmienną liczbę razy, a czasem obejmować niepełne obroty. Na potrzeby oceny behawioralnej liczymy tylko pełne obroty o 360°. Zachowanie to jest najbardziej zbliżone do obserwowanego podczas miejscowego przykładania sondy termicznej.
4. Smaganie (Whip): Larwa wykazuje gwałtowne ruchy skurczu i rozluźnienia wzdłuż osi przednio-tylnej, które sprawiają, że głowa na bardzo krótką chwilę zbliża się do ogona. Patrz wideo od 7:11. Smaganie jest często obserwowane w szybkim następstwie lub równocześnie z przewrotami.
5. Drgawki (Seizure): Larwa wyprostowuje się wzdłuż osi przednio-tylnej i wykazuje wysokoczęstotliwe drżenia całego ciała bez wyginania się. Patrz wideo od 7:25.
6. Paraliż: Larwa przestaje się poruszać. U niektórych larw jest to stan trwały, natomiast inne wykazują następnie niskoczęstotliwościowy ruch pulsacyjny. Patrz wideo od 7:36.

Dane te sugerują, że temperatura kropli wody oraz czas do wystąpienia pięciu charakterystycznych zachowań obserwowanych podczas globalnego podgrzewania larwy/kropli wody są silnie skorelowane.

Rysunek 1. Schemat kroków eksperymentalnych przygotowania i badania larw. Przed badaniem nocycepcji za pomocą sondy termicznej lub płyty grzewczej, larwy pochodzące z konkretnego szczepu lub krzyżówki genetycznej są zbierane i oczyszczane z pożywki. Jeśli ma zostać oceniona uwrażliwienie nocyceptywne (w przeciwieństwie do nocycepcji bazowej), po zbiorze następuje eteryzacja (ekspozycja na eter), montaż, naświetlanie promieniowaniem UV oraz okres rekonwalescencji na pożywce dla much. Zebrane lub zregenerowane larwy są następnie poddawane działaniu szkodliwych temperatur testowych podczas badania za pomocą sondy termicznej (lokalnie) lub płyty grzewczej (globalnie). Numery odnoszą się do sekcji tekstu metodyki opisujących przedstawione kroki.

Rysunek 2. Układ eksperymentalny dla testu z lokalną sondą termiczną. Sonda termiczna jest sterowana przez jednostkę kontroli termicznej, która służy do ustawiania i utrzymywania temperatury sondy. Sondę trzyma się prostopadle do osi przednio-tylnej i używa do stymulacji larwy pod kątem 45° do poziomu. Kontakt sondy następuje konkretnie w obrębie segmentu brzusznego A4, jak pokazano na rysunku. Operator musi utrzymywać ten kontakt poprzez delikatny nacisk aż do przekroczenia limitu czasu wynoszącego 20 sekund lub do momentu rozpoczęcia zachowania rolowania. Jeśli temperatura zostanie odebrana jako szkodliwa, larwa wykaże awersyjny odruch wycofania, charakteryzujący się co najmniej jednym obrotem o 360°. Liczba obrotów może być pojedyncza lub wielokrotna (patrz Rysunek 4B).

Rysunek 3. Układ eksperymentalny dla testu na płycie grzewczej. (A) Schemat widoku poziomego szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm zawierającej jedną larwę w średnim 3^rd stadium rozwojowym w kropli 80 μl wody. (B) Schemat widoku z góry larwy umieszczonej na środku kropli wody widzianej przez mikroskop. (C) Zdjęcie widoku poziomego stanowiska pracy dla tego testu. (D) Zdjęcie larwy widzianej przez mikroskop.

Rycina 4. Ilościowa ocena reakcji behawioralnej z użyciem testu sondy termicznej. (A) Wykres procentowego udziału osobników reagujących w każdej kategorii (szybko reagujących, wolno reagujących i niereagujących) w zależności od temperatury. (B) Wykres czasu utajenia reakcji wycofania w odpowiedzi na bodziec awersyjny w zależności od liczby obrotów wykonanych przez każdą larwę w czterech różnych temperaturach testowych o rosnącej szkodliwości (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C i 52 °C).

Rycina 5. Test na płycie grzejnej: czas latencji i temperatura a zachowanie. (A) Czas latencji i średnia temperatura kropli wody dla każdej odpowiedzi behawioralnej w optymalnych warunkach: 95 °C (temperatura powierzchni płyty grzejnej) i 80 μl kropli wody (n = 150). Należy zauważyć, że każde zachowanie jest obserwowane w określonym przedziale czasowym. Temperatury kropli wody mierzono za pomocą termopary umieszczonej w górnej lub dolnej części kropli (n = 10 kropli dla każdej lokalizacji), a następnie wyciągnięto z tych pomiarów średnią. (B) Procent larw wykazujących każdą z odpowiedzi behawioralnych w optymalnych warunkach testu. Miotanie się, drgawki i paraliż obserwuje się w prawie 100% przypadków, podczas gdy toczenie się i smaganie występują odpowiednio w 77% i 80% przypadków. Przy niższych wartościach nastawy temperatury powierzchni drgawki i paraliż nie są obserwowane w ciągu 200 s, a przy wyższych wartościach nastawy toczenie się i smaganie mogą zostać pominięte lub mogą wystąpić jednocześnie. n = 150. (C) Procent larw, które przeżyły po wystąpieniu zachowania paraliżu. Larwy podgrzewano do momentu rozpoczęcia paraliżu, a następnie przeniesiono do standardowych warunków hodowli w celu rekonwalescencji. Larwy w grupie kontrolnej (mock-treated) poddano analogicznej procedurze, z wyjątkiem ekspozycji na ciepło. Liczbę poczwerek i żyjących imago określano w dniach 7–13. n = 120.

Rysunek 6. Inaktywacja larwalnych nocyceptywnych neuronów sensorycznych zwiększa opóźnienie odpowiedzi behawioralnych. Wykres czasu reakcji dla każdego zachowania dla wskazanych genotypów: w¹¹¹⁸, Gal4^109(2)80 = md-Gal4/+, UAS-Ork1.Δ-C/+, UAS-Ork1.Δ-NC /+, md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-C oraz md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. md-Gal4 steruje ekspresją transgenów regulowanych przez UAS we wszystkich czterech klasach wielodendrytycznych obwodowych neuronów sensorycznych; UAS-Ork1.Δ-C¹⁴ wykazuje ekspresję zmodyfikowanej wersji kanału K+ typu open rectifier u Drosophila, niezbędnego do transmisji synaptycznej, a UAS-Ork1.Δ-NC¹⁴ wykazuje ekspresję dodatkowo zmodyfikowanej wersji tego samego kanału, która nie zakłóca transmisji synaptycznej. Należy zauważyć, że tylko larwy posiadające zarówno sterownik md-Gal4⁶, jak i transgeny UAS-Ork1.Δ-C wykazują zwiększone opóźnienia w czterech z pięciu obserwowanych zachowań (miotanie się, rolowanie, drgawki i paraliż). Zauważmy również, że ze względu na zwiększone opóźnienie w rolowaniu, zwierzęta te wykonują ruch smagający przed rolowaniem. Gwiazdka oznacza p < 0.05 w teście t Studenta. n = 30 larw na genotyp.

Wideo uzupełniające 1. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 2. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 3. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 4. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 5. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Film uzupełniający 6. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Opisane tutaj testy mogą być wykorzystane do jakościowej i ilościowej oceny reaktywności larw różnych genotypów na szkodliwe bodźce termiczne. Główną cechą testu z sondą grzewczą jest to, że bodziec jest przykładany tylko w jednym miejscu. Prawdopodobnie prowadzi to do aktywacji jedynie niewielkiej grupy neuronów klasy IV – tych znajdujących się w segmencie kontaktu z sondą oraz być może w segmentach bezpośrednio sąsiednich¹¹. Ze względu na lokalną stymulację, test z sondą grzewczą naśladuje powszechne doświadczenie sensoryczne wykrywania szkodliwego bodźca zlokalizowanego w konkretnym regionie ciała – na przykład kontaktu dłoni z gorącą kuchenką. Wadą testu z sondą grzewczą jest pewna zmienność zależna od operatora, którą można prawdopodobnie przypisać trzem czynnikom: i) naciskowi, z jakim operator przykładuje sondę do larwy, ii) precyzyjnej lokalizacji sondy na larwie względem leżących poniżej neuronów nocyceptywnych oraz iii) dokładnemu kątowi, pod którym sonda styka się z powierzchnią larwy.

Wcześniej opisaliśmy ilościową strategię kategoryzacji larw na nieodpowiadające, wolno odpowiadające i szybko odpowiadające w oparciu o czas latencji wycofania w odpowiedzi na określoną temperaturę¹. W niniejszej pracy raportujemy reakcję larw na jeszcze wyższe temperatury. Co ciekawe, odkryliśmy, że istnieje górna granica termicznych odpowiedzi nocyceptywnych u larw i że granica ta znajduje się między 52 a 54 °C. Może to wskazywać, że larwy nie posiadają kanału potencjału przejściowego (TRP) zdolnego do otwierania się w temperaturach wyższych niż 52 °C. Alternatywnie może to sugerować, że neurony lub mięśnie wykorzystywane do inicjowania lub wykonywania odpowiedzi motorycznej ulegają uszkodzeniu, zanim zdołają one funkcjonować w mechanizmie unikowym wycofania. Przedstawiamy również inną analizę amplitudy odpowiedzi wycofania, wykorzystując liczbę obrotów jako wskaźnik „siły” reakcji. Intuicyjnie można by oczekiwać, że parametry te będą rosły wraz ze wzrostem temperatury lub czasu stymulacji. Zaskakujące jest to, że tak nie jest. Larwy stymulowane przez dłuższy czas w temperaturze z dolnego zakresu szkodliwego (42 °C) wykonują więcej obrotów i spędzają więcej czasu na rolowaniu niż larwy badane w wyższych temperaturach (48-52 °C). Sugeruje to, że w obrębie okna temperatur szkodliwych to przede wszystkim czas ekspozycji determinuje amplitudę odpowiedzi. Ponieważ larwy poddane bardzo szkodliwym temperaturom (48-52 °C) reagują średnio bardzo szybko, nie wykonują tak wielu obrotów jak larwy poddane mniej szkodliwej temperaturze przez dłuższy czas. Opisana tutaj analiza amplitudy odpowiedzi dodaje kolejny wymiar ilościowy, w ramach którego można porównywać różne genotypy lub manipulacje środowiskowe.

Główną cechą testu na płytce grzewczej jest to, że wiąże się on z globalną ekspozycją na szkodliwe ciepło. W związku z tym jest on bardziej zbliżony do sytuacji, w której zwierzę znajduje się w rozgrzanym kotle, niż do dotknięcia gorącej kuchenki. Chociaż nie jest jasne, kiedy larwa może doświadczyć globalnego bodźca szkodliwego w naturze, w warunkach laboratoryjnych reakcje behawioralne na taką globalną ekspozycję są bardziej złożone niż te obserwowane podczas stymulacji miejscowej. Atutem testu na płytce grzewczej, zauważony również przez innych autorów³, jest niewielka zmienność między użytkownikami, ponieważ dotykanie larwy nie jest elementem protokołu. Jedyną istotną zmienną wydaje się być definiowanie momentu rozpoczęcia każdego zachowania, co można zminimalizować poprzez wielokrotną obserwację i oswojenie się z procedurą. Interesującą różnicą między testami są temperatury, przy których rozpoczynają się zachowania awersyjne. Są one znacznie niższe w teście na płytce grzewczej niż w przypadku sondy grzewczej. Wstępne zachowanie wykazywane przez larwy w kontakcie z sondą grzewczą (podnoszenie głowy i ogona) może być korelatem gwałtownych ruchów głową obserwowanych w temperaturze ok. 27 °C w teście na płytce grzewczej. Możliwe, że reakcja ta odzwierciedla raczej „dyskomfort” niż „ból”. W teście z sondą grzewczą nie zaobserwowaliśmy korelatów smagania, drgawek i paraliżu nawet w wysokich temperaturach (do 48 °C); może to oznaczać, że do wywołania tych zachowań niezbędna jest krytyczna masa wyładowań neuronów sensorycznych z więcej niż jednego regionu ciała. Co ciekawe, zachowania takie jak drgawki i paraliż obserwuje się w temperaturach (~34 – 37 °C) poniżej dolnej granicy progu nocyceptywnego odnotowanego przy użyciu sondy grzewczej, co wskazuje, że stymulacja globalna może wiązać się z sumowaniem odpowiedzi neuronalnych, które są niewystarczające do wywołania zachowania przy miejscowym zastosowaniu sondy grzewczej. Fakt, że temperatury te są rzeczywiście odczuwane przez larwy jako szkodliwe, potwierdza obserwacja, że larwy, u których rozpoczyna się paraliż, a następnie pozostawia się je do regeneracji na pożywce dla much, w większości przypadków nie przeżywają (Rysunek 5C). Argument, że test na płytce grzewczej odczytuje odpowiedzi nocyceptywne, wspiera również fakt, że blokowanie przekazywania synaptycznego w znanych nocyceptywnych neuronach sensorycznych zwiększa latencję większości obserwowanych zachowań (Rysunek 6). Obserwacja, że w przypadku zachowania smagania w wyższych temperaturach nie następuje zwiększenie latencji, sugeruje, że do tego zachowania mogą być wymagane inne neurony sensoryczne, które nie wykazują ekspresji md-Gal4.

Podsumowując, oba testy polegają na poddaniu pojedynczej larwy szkodliwemu bodźcom termicznym o określonej temperaturze – w teście lokalnym jest to gorący czubek małej metalowej sondy, a w teście globalnym zanurzenie w kropli szybko nagrzewanej wody. Za pomocą tych testów można badać i kwantyfikować odpowiedzi behawioralne larw Drosophila o różnych podłożach genetycznych i/lub wystawionych na różne warunki środowiskowe (na przykład z uszkodzeniem tkanek lub bez niego). Ostatecznie wyniki tych badań pomogą nam lepiej zrozumieć sieci genetyczne kontrolujące nocycepcję u Drosophila oraz innych pokrewnych gatunków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sonda termiczna	Pro-Dev Engineering	Budowa na zamówienie	Informacje kontaktowe dostępne na żądanie
Inkubator z suchą kąpielą	Fisher Scientific	11-718	1 jednolity blok grzewczy i 1 blok grzewczy z otworami 16mm
Kamera kolorowa Leica DFC290 12v/400mA	Leica Microsystems	12730080	Można użyć dowolnej równoważnej kamery.
Mikroskop Leica MZ6	Leica Microsystems	Numer katalogowy korpusu zoom MZ6 (nośnik optyki) to 10445614
Jednostka Modulamp Schott Ace	Schott AG	A20500
Podwójny gęsi szyja 23-calowy światłowodowy przewód światłowodowy Schott	Schott AG	Schott A08575
Jednostka kontroli termicznej	TSCI corp.	Budowa na zamówienie	Szczegóły dostępne na żądanie
Mikroskop Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Można użyć dowolnego równoważnego mikroskopu.
Pęseta	Fine Science Tools	FS-1670
Sito o oczkach 1mm	Genesee Scientific	57-101
Pędzel	Blick Art Materials	06762-1002
Crosslinker UV	Fisher Scientific	1199289
Słoiki Coplin	Fisher Scientific	08-816
Zlewka 10ml	Fisher Scientific	02-540C
Eter dietylowy	Fisher Scientific	E138-500
Polistyrenowa szalka Petri 35 X 10 mm	Falcon BD	351008	Nie testowaliśmy alternatywnych szalek.
Szkiełko mikroskopowe	Corning	26003
Termopara	Omega Engineering, Inc.	HH802U
Kawałek winylu	Office Depot	480009
Probówka do mikrocentryfugi	Denville Scientific	C-2170