System ECIS/Taxis to zautomatyzowany test w czasie rzeczywistym, który służy do pomiaru chemotaksji komórkowej. W tym teście komórki przemieszczają się pod warstwą agarozy, aby dotrzeć do elektrody docelowej. Ruch komórkowy jest mierzony poprzez pojawienie się oporu dla prądu AC 0.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ruch komórek w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne jest fundamentalny dla wielu procesów komórkowych, w tym dla gojenia ran, stanu zapalnego oraz odpowiedzi na infekcję. Powszechną metodą pomiaru chemotaksji jest test z wykorzystaniem komory Boydena, w której komórki i chemoatraktant są oddzielone porowatą membraną. W miarę jak komórki migrują przez membranę w kierunku chemoatraktanta, przywierają one do jej dolnej strony lub opadają do znajdującego się poniżej medium, a następnie zostają zabarwione i przeliczone wizualnie 1. W tej metodzie komórki są wystawione na działanie gwałtownego i przejściowego gradientu chemoatraktanta, co uważa się za słabe odwzorowanie gradientów występujących w tkankach 2.
Inny system analizy, test chemotaksji pod agarozą, 3, 4 mierzy ruch komórek po stałym podłożu w cienkim filmie wodnym, który tworzy się pod warstwą agarozy. Gradient powstający w agarozie jest łagodny i uważa się go za odpowiednią reprezentację gradientów występujących naturalnie. Chemotaksję można ocenić poprzez obrazowanie mikroskopowe przebytej odległości. Zarówno test z komorą Boydena, jak i test pod agarozą są zazwyczaj konfigurowane jako analizy punktu końcowego.
Zautomatyzowany system ECIS/Taxis łączy podejście z zastosowaniem warstwy agarozy z elektrycznym pomiarem impedancji między komórkami a podłożem (ECIS) 5, 6. W tym teście elektrody docelowe znajdują się w każdej z 8 komór. Duża elektroda pomocnicza przebiega przez każdą z 8 komór (Ryc. 2). Każda komora jest wypełniona agarozą, a w niej, po obu stronach elektrody docelowej, wycięto dwa małe otwory. Jeden otwór wypełnia się badaną populacją komórek, natomiast w drugim umieszcza się źródła dyfundującego chemoatraktanta (Ryc. 3). Prąd przepływający przez system pozwala określić zmianę rezystancji, która następuje w momencie, gdy komórki przechodzą nad elektrodą docelową. Komórki znajdujące się na elektrodzie docelowej zwiększają rezystancję systemu 6. Ponadto gwałtowne wahania rezystancji odzwierciedlają zmiany w oddziaływaniach komórek z powierzchnią elektrody i wskazują na zachodzące zmiany kształtu komórek. System ECIS/Taxis umożliwia pomiar ruchu populacji komórek w czasie rzeczywistym przez dłuższe okresy, a jednocześnie jest na tyle czuły, że pozwala wykryć dotarcie pojedynczej komórki do elektrody docelowej.
Dictyostelium discoidium wykazuje zdolność do migracji w obecności gradientu folianów 7, 8, a jego odpowiedź chemotaktyczną można precyzyjnie zmierzyć za pomocą ECIS/Taxis 9. Za pomocą ECIS/Taxis mierzono również chemotaksję leukocytów w odpowiedzi na SDF1α oraz na antagonisty chemotaksji 10, 11. Przykład odpowiedzi leukocytów na SDF1α przedstawiono na Rysunku 1.
Protokół
1. Przygotowanie elektrod ECIS/Taxis
- Złotą powierzchnię matrycy elektrod ECIS/taxis (składającej się z 8 komór na slajd) stabilizuje się wstępnie poprzez inkubację ze sterylną 10 mM cysteiną w wodzie dejonizowanej (dH2O) przez 15 min w temperaturze pokojowej w warunkach sterylnych.
- Odsysa się roztwór cysteiny z każdej komory elektrod i płucze ją 3 razy sterylną dH2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nowatorskie cechy testu ECIS/Taxis obejmują możliwość zautomatyzowanego gromadzenia danych w czasie rzeczywistym podczas reakcji komórek na chemoatraktant. Chociaż najpowszechniejszym zastosowaniem tej technologii jest pomiar odpowiedzi komórkowych na pojedyncze gradienty chemotaktyczne lub gradienty składające się z mieszanin agonistów i antagonistów chemotaksji, podejście ECIS/Taxis dopuszcza również modyfikacje tych konfiguracji, które mogą być bardzo pomocne w ocenie responsywności komórkowej. Istnieją przekonujące d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
David A Knecht i Michael A Lynes posiadają wydany patent na technologię ECIS/Taxis, która została licencjonowana przez University of Connecticut firmie Applied Biophysics, Inc.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health (ES07408 i EB00208).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| Macierz elektrod ECIS | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Agaroza Seakem GTG | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| Płodowa surowica bydlęca HyClone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicylina/Streptomycyna | MP Biomedicals | 1670049 | Penicylina 5,000 IU/ml; Streptomycyna 5 mg/ml |
| Bufor HEPES | MP Biomedicals | 1688449 | roztwór 1M, stopień do hodowli komórkowych |
| Kanula ze stali nierdzewnej 14 Gauge (2) 4 cale | General Supply | 5-8365-1 | tępy koniec |
Bibliografia
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
