Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Streszczenie

Metoda bezpośredniej reakcji PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych próbek, co zostało tutaj zademonstrowano dla kilku tkanek roślinnych i zwierzęcych (Rysunek 1). Bezpośrednia reakcja PCR opiera się na specjalnie zmodyfikowanych polimerazach DNA Thermo Scientific Phusion oraz Phire, które zawierają domenę wiążącą dwuniciowy DNA, co nadaje im unikalne właściwości, takie jak wysoka tolerancja na inhibitory.

Detekcja docelowego DNA oparta na metodzie PCR znajduje liczne zastosowania w badaniach roślin, w tym w analizie genotypu roślin oraz weryfikacji transgenów. PCR z tkanek roślinnych tradycyjnie obejmuje wstępny etap izolacji DNA, który może wymagać zastosowania drogich lub toksycznych odczynników. Proces ten jest czasochłonny i zwiększa ryzyko kontaminacji krzyżowej^{1, 2}. Z kolei dzięki zastosowaniu zestawu Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit docelowe DNA można łatwo wykryć bez uprzedniej ekstrakcji DNA. W prezentowanym tutaj modelu analiza pochodnych sekwencji polimorficznych wzmacnianych i ciętych (dCAPS)^3,4 jest przeprowadzana bezpośrednio z liści rośliny Arabidopsis. Testy genotypowania dCAPS mogą być wykorzystywane do identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) poprzez trawienie endonukleazą restrykcyjną specyficzną dla allelu SNP³.

Niektóre próbki roślin mogą sprawiać trudności podczas stosowania metod Direct PCR, ponieważ zawierają składniki zakłócające przebieg tej reakcji, takie jak związki fenolowe. W takich przypadkach tradycyjnie wymagany jest dodatkowy etap usuwania tych związków^2,5. W niniejszym protokole problem ten rozwiązano poprzez zastosowanie szybkiego i prostego protokołu rozcieńczania, po którym następuje amplifikacja Direct PCR (Rysunek 1). Jako model trudnych w obróbce roślin wykorzystano liście piętnastoletniego dębu, ponieważ próbki te zawierają duże ilości związków fenolowych, w tym tanin.

Transfer genów do organizmów myszy jest powszechnie stosowany w badaniach nad rolą genów w rozwoju, fizjologii i chorobach ludzkich. Wykorzystanie tych zwierząt wymaga przesiewowego badania obecności transgenu, zazwyczaj za pomocą metody PCR. Tradycyjnie wiąże się to z czasochłonnym etapem izolacji DNA, podczas którego DNA do analizy PCR jest oczyszczane z tkanek ucha, ogona lub palców^6,7. Jednak dzięki zestawowi Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit genotypowanie myszy transgenicznych może być przeprowadzone bez wcześniejszego oczyszczania DNA. W niniejszym protokole genotypowanie myszy transgenicznej jest realizowane bezpośrednio z tkanek ucha myszy, co zademonstrowano na trudnym przykładzie, w którym do amplifikacji dwóch fragmentów znacznie różniących się wielkością zastosowano tylko jeden zestaw starterów.

Protokół

1. Genotypowanie osobników roślin Arabidopsis przy użyciu protokołu bezpośredniego

1. Aby rozpocząć badanie genotypowania dCAPS bezpośrednio na liściu rośliny Arabidopsis, najpierw przygotuj 20 lub 50 μl reakcji PCR, korzystając z zestawu Phire Plant Direct PCR Kit zgodnie z opisem w Tabeli 1.
2. Następnie, za pomocą Harris Uni-Core i maty do wycinania Harris Cutting Mat, wytnij fragment liścia rośliny Arabidopsis o średnicy 0,50 mm. Mocno trzymając wycinak, dociśnij krawędź tnącą do tkanki i wykonaj ruchy obrotowe w przód i w tył.
3. Naciśnij tłok, aby wyrzucić wycięty krążek bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej PCR. Upewnij się, że próbka wpadła do roztworu PCR i nie przykleiła się do ścianek probówki.
4. Aby zapobiec kontaminacji krzyżowej, oczyszczaj krawędź tnącą wycinaka pomiędzy każdą próbką, zanurzając go w 2% roztworze NaClO. Kilka razy naciśnij tłok w górę i w dół, a następnie wytrzyj krawędź tnącą czystym ręcznikiem papierowym. Matę do wycinania należy również płukać pomiędzy próbkami.
5. Następnie użyj termocyklera Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler oraz płyty Thermo Scientific Piko PCR Plate, aby przeprowadzić reakcje PCR zgodnie z warunkami cykli opisanymi w Tabeli 2. Reakcje PCR można przeprowadzać również w konwencjonalnych termocyklerach PCR.
6. Po zakończeniu PCR odwiruj materiał roślinny. Przenieś 5 μl supernatantu do nowej probówki do mikrocentryfugi. Dodaj 4 μl wody i 1 μl enzymu restrykcyjnego SspI. Delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj, aby zebrać zawartość na dnie probówki. Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Inaktywuj enzym restrykcyjny, inkubując go w temperaturze 65 °C przez 20 min.
7. Podczas amplifikacji DNA bezpośrednio z tkanek roślinnych, produkty PCR zawierają komponenty roślinne i pochodzące z reakcji PCR, które mogą zakłócać działanie enzymu restrykcyjnego. Dlatego przed kolejnym trawieniem konieczne może być rozcieńczenie (np. 1:2 lub 1:3 w wodzie) lub oczyszczenie produktu PCR, na przykład przy użyciu odpowiedniego komercyjnego zestawu, takiego jak Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit.
8. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym przeanalizuj powstałe fragmenty na żelu agarozowym. Dodaj 2,5 μl buforu do ładowania 5x do reakcji i przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym, nakładając 10 μl otrzymanej mieszaniny.

2. Amplifikacja specyficznych fragmentów DNA z 15-letnich liści dębu z zastosowaniem protokołu rozcieńczania

1. Na początek wyciąć fragment liścia dębu o średnicy 2 mm za pomocą wycinaka.
2. Umieścić próbkę w 20 μl Buforu Rozcieńczającego (Dilution Buffer) dostarczonego w zestawie Phire Plant Direct PCR Kit. Oczyścić krawędź tnącą wycinaka oraz matę tnącą w sposób opisany wcześniej.
3. Rozgnieść próbkę liścia końcówką pipety 100 μl, krótko dociskając ją do ścianki probówki. W zależności od materiału roślinnego protokół rozcieńczania czasami działa lepiej bez rozgniatania próbki.
4. Krótko wirować próbki w mikrowirówce, aż odczynniki osiądą na dnie probówek.
5. Nadpłyn można zastosować bezpośrednio w reakcji PCR lub rozcieńczyć w sterylnej wodzie w stosunku 1:10 lub 1:100, w zależności od rodzaju próbki. Jako matrycę do 20 μl reakcji PCR należy użyć od 0,5 μl do 1 μl nadpłynu lub rozcieńczenia. Próbkę reakcyjną przygotować zgodnie z opisem w Tabeli 1.
6. Po przygotowaniu reakcji, wykorzystać termocykler Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler oraz płytkę Thermo Scientific Piko PCR Plate do przeprowadzenia reakcji PCR zgodnie z warunkami cyklicznymi opisanymi w Tabeli 2. Reakcje PCR można przeprowadzać również w konwencjonalnych termocyklerach PCR.
7. Po zakończeniu PCR dodać do reakcji 5 μl 5x buforu do nakładania (loading buffer) i przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozy, wykorzystując 15 μl otrzymanej mieszaniny.

3. Genotypowanie myszy transgenicznych z wykorzystaniem protokołu rozcieńczeń

1. Rozpocznij protokół rozcieńczania u myszy transgenicznych, umieszczając wycinek ucha myszy o średnicy 2 mm w 20 μl buforu do rozcieńczania (Dilution Buffer) zawierającego 0,5 μl dodatku uwalniającego DNA (DNARelease Additive) dostarczonego w zestawie Phire Animal Tissue Direct PCR Kit.
2. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 2 min, a następnie inkubuj przez 2 min w temperaturze 98 °C.
3. Krótko odwiruj próbki w mikrocentryfudze, aż odczyny zbiorą się na dnie probówek.
4. Użyj 1 μl supernatantu jako matrycy do 20 μl reakcji PCR, przygotowanej zgodnie z opisem w Tabeli 3. Każdy supernatant, który nie zostanie użyty natychmiast, można przenieść do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Następnie wykorzystaj termocykler Thermo Scientific Piko 24-well oraz płytkę Thermo Scientific Piko PCR do przeprowadzenia reakcji PCR zgodnie z warunkami cyklicznymi opisanymi w Tabeli 4. Reakcje PCR można również przeprowadzić w konwencjonalnych termocyklerach PCR.
6. Po PCR dodaj 5 μl 5x buforu do nakładania (loading buffer) do odczynu i przeprowadź elektroforezę na żelu agarozowym, używając 15 μl otrzymanej mieszaniny.

4. Reprezentatywne wyniki

W technice dCAPS miejsce restrykcyjne w obrębie badanego SNP jest wprowadzane lub niszczone przy użyciu starterów PCR z jednym lub więcej niedopasowaniami względem docelowego DNA. Genotypowanie osobników roślin Arabidopsis przeprowadzono techniką dCAPS bezpośrednio z wycinków liści. Amplifikowane produkty poddano trawieniu, a powstałe fragmenty ujawniające genotyp każdego osobnika analizowano za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 2).

W tym przykładzie produkty PCR o długości 160 bp zawierające analizowany polimorfizm SNP (allelu G lub A) w genomie Arabidopsis zostały namnożone z wycinków liści rośliny przy użyciu zestawu Phire Plant Direct PCR Kit. Starter forward zawierał jeden niedopasowany nukleotyd na końcu 3', co stworzyło specyficzną dla enzymu SspI miejsce restrykcyjne w docelowym DNA, obejmujące analizowany SNP (allel A), którego nie było w drugim allelu SNP (Rysunek 2B).

Protokoły rozcieńczania są niezbędne w przypadku trudnego materiału roślinnego, takiego jak liść dębu, ze względu na wysoką koncentrację związków fenolowych. Stosując opisany tutaj protokół rozcieńczania, fragment chloroplastowego DNA o długości 297 bp został powielony przy użyciu protokołu 3-etapowego. Próbki liści dębu przy różnych rozcieńczeniach przedstawiono na Rysunku 3, wraz z kontrolami pozytywną i negatywną.

Zestaw Phire Animal Tissue Direct PCR Kit został wykorzystany w wymagającym protokole, w którym do amplifikacji dwóch fragmentów o znacznej różnicy w wielkości zastosowano tylko jedną parę starterów, co pozwoliło na uzyskanie obfitych ilości obu produktów o prawidłowych rozmiarach: 1,500 bp dla myszy transgenicznych i 200 bp dla myszy typu dzikiego (Rysunek 4). Słabsza górna prążka u myszy heterozygotycznych wynika z konkurencji obu matryc (alleli) o tę samą parę starterów; niemniej jednak wyniki genotypowania są jednoznaczne.

Przebadano również stabilność próbek przygotowanych zgodnie z protokołem rozcieńczania. Wyniki pokazują, że rozcieńczone próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej rok. Co więcej, powtórne cykle zamrażania i rozmrażania nie wpłynęły znacząco na reakcję (Rycina 5). Przedstawiono również wydajną amplifikację z próbek tkanki ucha myszy z wykorzystaniem polimerazy DNA Phire i metody Direct PCR w porównaniu do polimerazy Taq typu hot start oraz oczyszczonego DNA (Rycina 6).

Składniki	reakcja 20 μl	reakcja 50 μl	Stęż. końcowe
H2O	uzupełnić do 20 μl	uzupełnić do 50 μl
2x Phire Plant PCR Buffer	10 μl	25 μl	1x
starter A	X μl	X μl	0.5 μM
starter B	X μl	X μl	0.5 μM
Phire Hot Start II DNA Polymerase	0.4 μl	1 μl
Próbka/protokół bezpośredni		wycinek 0.50 mm
Próbka/protokół z rozcieńczeniem	0.5-1 μl

Tabela 1. Warunki reakcji dla PCR roślin wykorzystanego w niniejszym protokole.

Etap cyklu	Temp.	Czas	Cykle
Denaturacja wstępna	98 °C	5 min	1
Denaturacja Przyłączanie* Elongacja	98 °C X °C 72 °C	5 sec 5 sec 20 sec	40
Elongacja końcowa	72 °C 4 °C	1 min podtrzymanie	1

Tabela 2. Warunki cykliczne dla PCR roślin wykorzystanego w tym protokole.

* Do wyznaczania Tm dla starterów stosowanych z polimerazą DNA Phire Hot Start II zaleca się korzystanie z kalkulatora Tm dostępnego pod adresem www.thermoscientific.com/pcrwebtools. Zalecana temperatura przyłączania dla starterów ≤ 20 nt jest równa niższej wartości Tm podanej przez narzędzie internetowe. W przypadku starterów > 20 nt należy zastosować temperaturę przyłączania wyższą o 3 °C od niższej wartości Tm podanej przez narzędzie internetowe.

Składniki	Reakcja 20 μl	Stężenie końcowe
H2O	dopełnić do 20 μl
2x Phire Animal Tissue PCR Buffer	10 μl	1x
starter A	X μl	0.5 μM
starter B	X μl	0.5 μM
Phire Hot Start II DNA Polymerase	0.4 μl
Próbka/protokół rozcieńczenia	1 μl

Tabela 3. Warunki reakcji dla PCR z tkanek zwierzęcych zastosowanego w tym protokole.

Etap cyklu	Temp.	Czas	Cykle
Wstępna denaturacja	98 °C	5 min	1
Denaturacja Przyłączanie* Wydłużanie	98 °C X °C 72 °C	5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec/kb > 1 kb	40
Finalne wydłużanie	72 °C 4 °C	1 min Przechowywanie	1

Tabela 4. Warunki cyklu dla reakcji PCR z tkankami zwierzęcymi zastosowanej w tym protokole.

* W przypadku wyznaczania Tm dla starterów stosowanych z polimerazą DNA Phire Hot Start II zaleca się korzystanie z kalkulatora Tm dostępnego pod adresem www.thermoscientific.com/pcrwebtools. Zalecana temperatura przyłączania dla starterów ≤ 20 nt jest równa niższej wartości Tm podanej przez narzędzie internetowe. Dla starterów > 20 nt należy zastosować temperaturę przyłączania o 3 °C wyższą od niższej wartości Tm podanej przez narzędzie internetowe.

Rycina 1. Schemat procedury bezpośredniej reakcji PCR. Bezpośrednią reakcję PCR można przeprowadzić przy użyciu dwóch alternatywnych protokołów. W protokole bezpośrednim niewielka ilość próbki jest dodawana bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej PCR. Protokół z rozcieńczeniem wykorzystuje krótki etap wstępnej inkubacji przed PCR w celu uwolnienia DNA z materiału próbki.

Rycina 2. Genotypowanie osobników roślin Arabidopsis metodą dCAPS bezpośrednio z wycinków liści. A) Rycina 2A przedstawia zasadę przeprowadzonego testu dCAPS. Miejsce restrykcyjne w obrębie badanego SNP jest wprowadzane lub usuwane podczas PCR przy użyciu startera z jednym lub więcej niedopasowaniami do docelowego DNA. Produkty PCR są trawione, a powstałe fragmenty ujawniają genotyp każdego osobnika po analizie elektroforetycznej. B) Wycinki o średnicy 0.50 mm z liści roślin umieszczono bezpośrednio w 50 μl reakcji PCR. Produkty PCR o długości 160 bp zawierające miejsce SNP (allela G lub A) zostały namnożone za pomocą starterów wprowadzających unikalne miejsce SspI do alleli A. Nieoczyszczone produkty PCR poddano trawieniu enzymem restrykcyjnym SspI. Powstałe fragmenty przeanalizowano na 3% żelu agarozowym. Ścieżka M to marker wielkości; ścieżki A i G odpowiadają allelom SNP każdego preparatu. Otrzymane wyniki potwierdzono metodą konwencjonalną poprzez ekstrakcję DNA, a następnie PCR i trawienie restrykcyjne (dane nie pokazane). W układzie testowym uwzględniono reakcje kontrolne ujemne bez matrycowego DNA, które przeprowadzono na osobnym żelu agarozowym równolegle z właściwymi reakcjami PCR przed wykonaniem trawienia (dane nie pokazane).

Rycina 3. Protokół rozcieńczania z wykorzystaniem próbek liści dębu. Protokół rozcieńczania został zastosowany w celu amplifikacji fragmentu chloroplastowego DNA o długości 297 bp w próbkach liści dębu (protokół 3-stopniowy, przyłączanie w 62 °C) przy różnych rozcieńczeniach (1:100, 1:10, 1:1 i 2:1) oraz z użyciem kontroli pozytywnej i negatywnej [C+: kontrola pozytywna z oczyszczonego DNA (Arabidopsis), C-: kontrola negatywna bez matrycowego DNA]. Nazewnictwo próbek odnosi się do miejsca pobrania próbki (miasta w Finlandii) oraz numeracji próbek.

Rycina 4. Genotypowanie myszy transgenicznych z użyciem jednej pary starterów zgodnie z protokołem rozcieńczania. Tkanki uszne dziewięciu poszczególnych myszy (ścieżki 1-9) umieszczono w 20 μl buforu do rozcieńczania (Dilution Buffer) zawierającego dodatek uwalniający DNA (DNARelease Additive). Po inkubacji w temperaturze pokojowej oraz w 98 °C, 1 μl supernatantu wykorzystano jako matrycę w 20 μl reakcji PCR. Wielkości fragmentów: 1 500 bp (transgeniczne) i 200 bp (dzikie).

Rysunek 5. Próbki przygotowane zgodnie z protokołem rozcieńczania są stabilne podczas długotrwałego przechowywania. Próbki tkanek ucha myszy inkubowano w 20 μl buforu do rozcieńczeń (Dilution Buffer) zawierającego dodatek uwalniający DNA (DNARelease Additive) i poddano wielokrotnemu zamrażaniu i rozmrażaniu (ścieżka 1), przechowywano w temperaturze -20 °C przez rok (ścieżka 2) lub wykorzystano natychmiast do PCR (ścieżka 3). Wielkości amplifikowanych fragmentów wynosiły 900 bp, 1 500 bp oraz 3 200 bp.

Rycina 6. Zestaw Phire Animal Tissue Direct PCR Kit wykazuje wyższą skuteczność niż komercyjny system oczyszczania DNA w połączeniu z polimerazą DNA Taq typu hot start. Cztery amplikony (0,5-1,5 kb) zostały namnożone z tkanek ucha myszy z zastosowaniem protokołu rozcieńczania z zestawu Phire Animal Tissue Direct PCR Kit. Dla porównania DNA zostało najpierw oczyszczone przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, a następnie te same fragmenty namnożono z użyciem polimerazy DNA Taq typu hot start zgodnie z zaleceniami producenta. Tylko przy użyciu zestawu Phire Animal Tissue Direct PCR Kit wszystkie cztery amplikony zostały pomyślnie namnożone.

Rysunek 7. Uniwersalne porównanie przepływu pracy z szacunkowym czasem i zużyciem odczynników. Porównano podejście Thermo Scientific Direct PCR z metodą izolacji DNA, metodą z użyciem buforu do ekstrakcji oraz metodą z użyciem buforu do PCR. Szacowany czas dla każdego podejścia przed etapem PCR jest podany czerwonym tekstem. W podejściu Thermo Scientific Direct PCR przygotowanie próbki przed PCR zajmuje jedynie 0-4 min. Poniżej każdej metody wymieniono zużyte odczynniki. Metoda Thermo Scientific Direct PCR wykorzystuje najmniejszą ilość odczynników w porównaniu z pozostałymi metodami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych próbek, co skraca czas pracy i upraszcza proces genotypowania roślin i zwierząt (Rysunek 7). Zaprezentowano również zastosowanie protokołu rozcieńczania w połączeniu z metodą Direct PCR (Rysunek 3). Protokół rozcieńczania jest zalecany w przypadku trudnych próbek (np. starych liści roślin, gatunków roślin zawierających związki interferujące) lub przy długich (lub bogatych w GC) amplikonach. Protokół ten jest szczególnie przydatny podczas rozpoczynania nowego eksperymentu Direct PCR, umożliwiając optymalizację reakcji. Może on służyć jako narzędzie do rozwiązywania sporadycznych problemów, takich jak niska wydajność produktu wynikająca z różnic w materiale tkankowym i/lub zastosowanych starterach. Ponadto, przy przeprowadzaniu wielu reakcji z tej samej próbki, zastosowanie protokołu rozcieńczania gwarantuje, że cała próbka nie zostanie zużyta w jednej reakcji.

W celu oczyszczania DNA z roślin do analizy PCR przyjętą praktyką było przeprowadzanie lizy komórek, a następnie izolacji DNA przy użyciu różnych komponentów, które potencjalnie mogły zakłócać analizę PCR⁸. W przypadku roślin szczególnie trudnych, o wysokiej zawartości związków fenolowych, tradycyjnie stosowano dodatek poliwinilopirolidonu w celu usunięcia związków wiążących się z DNA po lizie komórek^2,5. Jak tutaj pokazano, tych skomplikowanych i czasochłonnych etapów można uniknąć, stosując zestaw Phire Plant Direct PCR Kit do wykrywania docelowego DNA. Etapy lizy komórek i izolacji DNA można pominąć, wykorzystując czułe techniki dCAPS bezpośrednio z liści rośliny Arabidopsis (Rycina 2). Jak wykazano w niniejszym materiale, protokół rozcieńczania skutecznie niweluje obecność problematycznych komponentów, które mogą zakłócać reakcję PCR (Rycina 3).

Tradycyjnie warunkiem wstępnym genotypowania zwierząt była izolacja genomicznego DNA z tkanki zwierzęcej za pomocą toksycznego i czasochłonnego procesu, charakteryzującego się długą inkubacją z proteinazą K w celu strawienia skóry i tkanki łącznej, a następnie etapami ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi, wytrącania alkoholem i wirowania^6,9,10. Jak wykazano w niniejszej pracy, uproszczenie tego procesu osiągnięto dzięki zastosowaniu zestawu Phire Animal Tissue Direct PCR Kit, co pozwoliło na genotypowanie myszy transgenicznych bez wcześniejszego oczyszczania DNA (Rycina 4). Przykład przedstawiony w tym artykule jest szczególnie wymagający, ponieważ do amplifikacji dwóch fragmentów o znacznej różnicy w wielkości użyto tylko jednego zestawu starterów. Pomimo wrodzonej trudności protokołu, zastosowanie podejścia Direct PCR w połączeniu z prostym protokołem rozcieńczania pozwoliło na uzyskanie wysokich wydajności dwóch produktów PCR (Rycina 4).

Wykrywanie docelowego DNA w oparciu o metodę PCR znajduje wiele zastosowań w badaniach, w tym w analizie genotypu w celu zidentyfikowania roli genów w rozwoju, fizjologii i chorobach. Dzięki tolerancji wyspecjalizowanych polimeraz DNA na inhibitory, protokoły te można zrealizować w minimalnym czasie bez konieczności wcześniejszego oczyszczania DNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Phire Plant Direct PCR	Thermo Fisher Scientific	F-130	200 reakcji (po 50 μl każda)
Zestaw Phire Animal Tissue Direct PCR	Thermo Fisher Scientific	F-140	200 reakcji (po 50 μl każda)
Harris Uni-Core 0,35 mm (różowy)	Thermo Fisher Scientific	F-180S/L	Ilość: 5/25
Harris Uni-Core 0,50 mm (niebieski)	Thermo Fisher Scientific	F-185S/L	Ilość: 5/25
Mata do cięcia Harris 6,4 × 7,6 cm	Thermo Fisher Scientific	F-190	Ilość: 5
SspI	Thermo Fisher Scientific	ER0771	100 μl (100 reakcji)
Termocykler Piko 24-dołkowy	Thermo Fisher Scientific	TCP0024
Płytki PCR Piko 24-dołkowe	Thermo Fisher Scientific	SLP0241
Zestaw do oczyszczania produktów PCR GeneJET Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	K0701 K0702	50 preparacji 250 preparacji