Method Article

Wysokoprzepustowy generator ekspresji białek wykorzystujący platformę mikroprzepływową

DOI:

10.3791/3849

⸱

August 23rd, 2012

 ,  ,  , 
1The Mina & Everard Goodman Faculty of Life Sciences, The Nanotechnology Institute, Bar-Ilan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy mikroprzepływowe podejście do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych zaworami mikromechanicznymi. Urządzenie mikroprzepływowe jest połączone z biblioteką genów wydrukowaną w mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translowane na chipie, w wyniku czego powstaje matryca białkowa gotowa do użytku eksperymentalnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybko rozwijające się dziedziny, takie jak biologia systemowa, wymagają rozwoju i implementacji nowych technologii, umożliwiających wysoką przepustowość i wierność pomiarów dużych systemów. Mikrofluidyka obiecuje spełnić wiele z tych wymagań, takich jak przeprowadzanie wysokoprzepustowych eksperymentów przesiewowych na chipie, obejmujących testy biochemiczne, biofizyczne i komórkowe1. Od początków urządzeń mikroprzepływowych dziedzina ta drastycznie ewoluowała, co doprowadziło do rozwoju integracji mikroprzepływowej na dużą skalę2,3. Technologia ta pozwala na integrację tysięcy zaworów mikromechanicznych w jednym urządzeniu o powierzchni zabudowy pocztowej (ilustracja 1). Opracowaliśmy wysokoprzepustową platformę mikroprzepływową do generowania ekspresji in vitro macierzy białkowych (ryc. 2) o nazwie PING (Protein Interaction Network Generator). Tablice te mogą służyć jako matryca dla wielu eksperymentów, takich jak interakcje białko-białko 4, białko-RNA5 lub białko-DNA6.

Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych, które są indywidualnie programowane za pomocą mikroukładu. Dopasowanie tych drukowanych mikromacierzy do urządzeń mikroprzepływowych programuje każdą komorę z pojedynczym punktem, eliminując potencjalne zanieczyszczenie lub reaktywność krzyżową Co więcej, generowanie mikromacierzy przy użyciu standardowych technik wykrywania mikromacierzy jest również bardzo modułowe, co pozwala na układanie białek7, DNA8, małych cząsteczek, a nawet zawiesin koloidalnych. Potencjalny wpływ mikrofluidyki na nauki biologiczne jest znaczący. Szereg testów opartych na mikrofluidyce dostarczyło już nowych informacji na temat struktury i funkcji systemów biologicznych, a dziedzina mikrofluidyki będzie nadal wpływać na biologię.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń

  1. Zakupiono formę kontrolną DTPA-D SU-8 i formę przepływową SPR220-7 z odlewni Stanford Microfluidics (www.stanford.edu/group/foundry).
  2. Wystawiaj foremki silikonowe na działanie pary chlorotrimetylosilianu (TMCS) przez 10 minut, aby przyspieszyć uwalnianie elastomeru po etapach pieczenia9.
  3. Przygotuj mieszaninę elastomeru na bazie silikonu i utwardzacza (dobrze wymieszaj) w dwóch różnych proporcjach 5:1 i 20:1 odpowiednio dla form kontrolnych i przepływowych. Różne proporcje są niezbędne do prawidłowego łączenia wielu warstw.
    4. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metodę wysokoprzepustowego generowania macierzy białkowych z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej. Generowanie macierzy opiera się na drukowaniu matryc DNA w mikromacierzach i ekspresji białek in vitro z DNA w urządzeniu mikroprzepływowym.

Nasza nowatorska platforma mikroprzepływowa ma kilka ważnych zalet w porównaniu z obecnie stosowanymi metodami, co czyni ją obiecującym i ogólnym narzędziem dla proteomiki. Jedną z zalet są białka związane z błoną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez międzynarodowe stypendium reintegracyjne Marie Curie.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PDMS- SYLGARD 184Dow Corning USAESSEX-DC
Chlorotrimetylosilan (TMCS Sigma-AldrichC72854
Podłoża szklane powlekane epoksydem CEL Associates USAVEPO-25C
Glikol polietylenowy (PEG)Sigma-Aldrich81260
D-trehaloza dwuhydratSigma-AldrichT9531
Biotynylowany-BSAPierce, Thermo ScientificPIR-29130
Neutrawidyna Pierce, Thermo Scientific31050
penta-his-biotynaQiagen34440
Hepesfigure-materials-1 Przemysł biologiczny03-025-1B
TNT-T7Promega Corp.L5540
Przeciwciało C-myc Cy3Skrzynka kontrolna Sigma-Aldrich
Formaodlewnicza
Odlewnia
PinNew England Small Tubes Corporation
Rurki mikrootworowe TygonTygonS-54-HL
MicroarrayerBio RobotykaMicroGrid 610
Szpilki silikonoweSynteza równoległaSMT-S75
Stanford Microfluidics

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maerkl, S. J. Integration column: Microfluidic high-throughput screening. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).
  2. Hong, J. W., Quake, S. R. Integrated nanoliter systems. Nature. 21, 1179-1183 (2003).
  3. Ung....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic PlatformProtein ExpressionSynthetic GenesDNA ArrayPDMS DeviceMicroarray SpottingRabbit Reticulocyte LysateFluorescent Antibody LabelingLabVIEW ControlProtein Array

Related Articles