Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Podsumowanie

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Streszczenie

Szybko rozwijające się dziedziny, takie jak biologia systemowa, wymagają opracowania i wdrożenia nowych technologii umożliwiających wysokoprzepustowe i precyzyjne pomiary dużych układów. Mikrofluidyka obiecuje spełnienie wielu z tych wymagań, takich jak przeprowadzanie wysokoprzepustowych eksperymentów przesiewowych na chipie, obejmujących testy biochemiczne, biofizyczne i komórkowe¹. Od początków urządzeń mikrofluidycznych dziedzina ta ewoluowała drastycznie, co doprowadziło do rozwoju mikrofluidycznej integracji wielkoskalowej^2,3. Technologia ta pozwala na zintegrowanie tysięcy mikromechanicznych zaworów na jednym urządzeniu o rozmiarach znaczka pocztowego (Rysunek 1). Opracowaliśmy wysokoprzepustową platformę mikrofluidyczną do generowania ekspresji macierzy białkowych in vitro (Rysunek 2) o nazwie PING (Protein Interaction Network Generator). Macierze te mogą służyć jako wzorzec dla wielu eksperymentów, takich jak oddziaływania białko-białko⁴, białko-RNA⁵ lub białko-DNA⁶.

Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych, które są programowane indywidualnie za pomocą mikroarrayera. Dopasowanie tych wydrukowanych mikroarrayów do urządzeń mikroprzepływowych programuje każdą komorę za pomocą pojedynczej plamki, co eliminuje potencjalne zanieczyszczenie lub reaktywność krzyżową. Ponadto generowanie mikroarrayów przy użyciu standardowych technik nanoszenia plamek jest bardzo modułowe, co umożliwia tworzenie macierzy białek⁷, DNA⁸, małych cząsteczek, a nawet zawiesin koloidalnych. Potencjalny wpływ mikroprzepływów na nauki biologiczne jest znaczący. Liczne testy oparte na mikroprzepływach dostarczyły już nowych informacji na temat struktury i funkcji systemów biologicznych, a dziedzina mikroprzepływów będzie nadal oddziaływać na biologię.

Protokół

1. Wytwarzanie urządzenia

1. Należy zakupić formę kontrolną DTPA-D SU-8 oraz formę przepływową SPR220-7 z Stanford Microfluidics Foundry (www.stanford.edu/group/foundry).
2. Formy silikonowe należy poddać działaniu oparów chlorotrimetylosilanu (TMCS) przez 10 min, aby ułatwić oddzielenie elastomeru po etapach wygrzewania⁹.
3. Należy przygotować mieszaninę elastomeru na bazie silikonu i utwardzacza (dokładnie wymieszać) w dwóch różnych proporcjach: 5:1 dla formy kontrolnej oraz 20:1 dla formy przepływowej. Różne proporcje są niezbędne do prawidłowego wiązania wielu warstw.
4. PDMS w proporcji 5:1 należy wlać na warstwę kontrolną (wysokość około 5 mm). Warstwę kontrolną należy odgazować, a następnie wygrzewać przez 30 min w temperaturze 80 °C. Mieszaninę PDMS w proporcji 20:1 należy nanieść metodą spin coatingu (Laurell, USA) na warstwę przepływową przy prędkości 2,600 rpm przez 60 sec, a następnie wygrzewać w temperaturze 80 °C przez 30 min. Prędkość wirówki została zoptymalizowana pod kątem aktywacji zaworu przy ciśnieniu 15 psi. Szybsze wirowanie spowoduje uzyskanie cieńszej warstwy z niższym ciśnieniem aktywacji i na odwrót. Stosowane przez nas urządzenia mają limit 25 psi w kanale kontrolnym i 10 psi w kanale przepływowym, powyżej których może dojść do odklejenia od podłoża.
5. Należy oddzielić warstwę kontrolną od formy. Czynność tę należy wykonywać powoli, uważając, aby nie oderwać wzoru SU8. Następnie należy wyciąć urządzenie wzdłuż jego obwodu i wykonać otwory umożliwiające dostęp do kanałów kontrolnych.
6. Warstwy przepływową i kontrolną należy wyrównać ręcznie pod stereomikroskopem. Należy zacząć od wyrównania górnego lewego rogu; zawór przyciskowy (warstwa kontrolna) musi znajdować się w środku komory reakcyjnej (warstwa przepływowa). Następnie należy wyrównać pierwszy rząd i delikatnie zwolnić warstwę kontrolną rząd po rzędzie. Należy upewnić się, że wszystkie zawory przyciskowe znajdują się w środku komór reakcyjnych, a zawory adresujące i wlotowe przecinają kanały przepływowe w odpowiednich miejscach. Proces ten można powtarzać lokalnie, aż wszystkie rzędy zostaną wyrównane. Na koniec należy zniwelować wszelkie napięcia w PDMS, ostrożnie podnosząc go od boków i narożników. Nie należy podnosić go zbyt wysoko, aby nie doprowadzić do rozregulowania.
7. Urządzenie należy wygrzewać przez 2 hr w temperaturze 80 °C.
8. Należy wyciąć urządzenie wzdłuż jego obwodu i oddzielić dwuwarstwowy układ (chip) od formy przepływowej. Następnie należy wykonać otwory umożliwiające dostęp do kanałów przepływowych (Rysunek 1).

2. Tworzenie matrycy DNA i wyrównanie urządzenia

1. Przygotuj syntetyczne geny za pomocą PCR montażowego. Syntetyczne geny składają się z promotora T7, miejsca wiązania rybosomów (RBS), ORF z dwoma znacznikami epitopowymi (po jednym na każdym końcu) oraz terminatora T7 ⁴. Długość genów może wynosić od 100 bp do co najmniej 5 000 bp.
2. Przygotuj syntetyczne geny do rozmieszczenia w matrycy: sporządź mieszaninę glikolu polietylenowego (1,25%) i trehalozy dwuwodnej (125 mg/ml) i odmierz 2 μl na reakcję do płytki 384-dołkowej. Roztwór ten ograniczy nieodwrącalne wiązanie DNA do szkła oraz ułatwi wizualizację podczas wyrównywania ¹⁰.
3. Przenieś syntetyczne geny do płytki 384-dołkowej. Zazwyczaj stężenia DNA mogą wynosić od 10 ng/μl do 100 ng/μl stężenia końcowego. Dodaj dH₂O do końcowej objętości 20 μl (zależnie od mikroarrayera i rodzaju pinów).
4. Nanieś serię syntetycznych genów na szklane podłoża powlekane epoksydem za pomocą mikroarrayera. Używamy urządzenia MicroGrid 610 (Bio Robotics) z silikonowymi pinami SMT-S75 (Parallel Synthesis, USA). Drukowanie kontaktowe DNA przy użyciu tych konkretnych pinów pozwala uzyskać plamki o średnicy około 100 μm na powierzchni szkła. Pojemność każdego pinu jest wystarczająca na około 100 plamek. Upewnij się, że skok kolumn i rzędów odpowiada konkretnemu używanemu urządzeniu. Urządzenie, którego używamy, posiada 16 kolumn i 40 rzędów o skoku odpowiednio 680 μm na 320 μm.
5. Ręcznie wyrównaj urządzenie mikrofluidyczne względem matrycy genowej pod stereomikroskopem. Plamka DNA powinna znajdować się w środku komór DNA. Rozpocznij wyrównywanie od zlokalizowania pierwszego rzędu plamek poniżej pierwszego rzędu komór DNA. Następnie ustaw w linii pozostałe rzędy, kończąc precyzyjnym dostrojeniem całego urządzenia. Po wyrównaniu matrycy należy zadbać o zniwelowanie wszelkich naprężeń w PDMS poprzez jego lokalne uniesienie. Jeśli w PDMS pozostanie naprężenie, może on nie połączyć się prawidłowo z mikroarrayem.
6. Na koniec przytwierdź urządzenie do szkiełka przedmiotowego poprzez inkubację przez noc na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C.

3. Przygotowanie i aktywacja urządzenia

1. Zawory w warstwie sterującej są uruchamiane z komputera za pomocą programu LabVIEW. Skrypt LabVIEW steruje serią mikrozaworów elektromagnetycznych poprzez elektroniczną skrzynkę sterującą (zakupioną w Stanford Microfluidics Foundry). Kolektor zaworów elektromagnetycznych jest podłączony do sprężonego powietrza, które kontroluje przepływ i ciśnienie powietrza w zaworach sterujących urządzenia.
2. Podłącz urządzenie do kolektora zaworów elektromagnetycznych, używając elastycznych rurek plastikowych o średnicy wewnętrznej 0.02" (Tygon) oraz stalowych pinów (New England Small Tubes Corporation).
3. Wypełnij rurki wodą DDW i włóż piny do otworów dostępowych warstwy sterującej. Upewnij się, że każda rurka jest podłączona do odpowiadającego jej kanału sterującego.
4. Uruchom aplikację LabVIEW na komputerze, aby aktywować kanały sterujące. Poprzez aktywację zaworu ze skryptu LabVIEW przyłożone zostaje ciśnienie powietrza, które z kolei wtłoczy wodę do kanałów sterujących PDMS. Ustaw ciśnienie powietrza na 5 psi. Zaleca się najpierw wypełnienie tzw. „kanapki” (sandwich) i zaworów adresowych, aby zidentyfikować zakłócenia (cross-talks) między kanałami sterującymi w wadliwych urządzeniach. W przypadku wystąpienia zakłóceń, aktywacja linii sterującej „kanapki” doprowadzi do aktywacji linii sterujących szyjki (neck) lub przycisku (button). Jest to analogiczne do zwarcia w obwodzie elektrycznym. Urządzenie z zakłóceniami jest wadliwe i nie może być użyte.
5. Po wypełnieniu wszystkich kanałów sterujących i zaworów wodą DDW, zawory są przygotowane i gotowe do blokowania kanałów przepływowych znajdujących się pod nimi. Zwiększ ciśnienie powietrza do 15 psi. Aktywacja zaworów jest sterowana z programu LabVIEW poprzez zestaw przełączników włącz/wyłącz podłączonych do poszczególnych zaworów elektromagnetycznych. Każdy przełącznik steruje konkretną linią sterującą poprzez odpowiadający jej zawór elektromagnetyczny. Włączenie przycisku przełącznika (w skrypcie) spowoduje przyłożenie ciśnienia powietrza w odpowiedniej rurce. Ciśnienie powietrza przesunie wodę DDW w linii sterującej, co spowoduje rozszerzenie zaworów mikrofluidycznych i zablokowanie kanału pod nimi. Wyłączenie zaworu sterującego zwolni ciśnienie powietrza, a w konsekwencji odblokuje odpowiedni kanał przepływowy.
6. Aby upewnić się, że wszystkie zawory są otwarte, podłącz rurkę do jednego z wlotów przepływowych i wprowadź powietrze do urządzenia pod ciśnieniem 4-5 psi. Pozwoli to odkleić ewentualne przylegające zawory od szkiełka przedmiotowego.
7. W końcowym etapie urządzenie jest przygotowane i gotowe. Zamknij wszystkie zawory wlotowe oraz zawory „szyjki”, aby rozpocząć chemię powierzchniową.

4. Chemia powierzchni

1. W celu ułatwienia samoorganizacji macierzy białkowej na powierzchni oraz zapobiegania niespecyficznej adsorpcji wewnątrz urządzenia mikrofluidycznego, powierzchnię modyfikuje się chemicznie:
2. Aby wprowadzić składnik do urządzenia, należy podłączyć nową probówkę z wymaganym roztworem do jednego z kanałów przepływowych w urządzeniu. Wolny koniec probówki należy podłączyć do manifoldu ręcznego i otworzyć przepływ ciśnienia powietrza (5 psi).
3. Należy nanieść 40 μl biotynylowanego BSA (1 μg/μl) do nowej probówki i przeprowadzić przepływ około połowy tej objętości przez 20 min przez urządzenie; BSA zwiąże się z powierzchnią epoksydową.
4. Do wypłukiwania niezwiązanego substratu pomiędzy poszczególnymi etapami modyfikacji chemicznej powierzchni należy stosować bufor Hepes (50 mM).
5. Przepływ 25 μl streptawidyny (0.5 μg/μl) należy prowadzić przez 20 min na warstwę biotynylowanego BSA.
6. Wypłukać buforem Hepes przez 5 min.
7. Zamknąć zawór „button” i wprowadzić pozostałą część biotynylowanego BSA (zgodnie z opisem powyżej), aby spasywować powierzchnię wokół przycisku.
8. Wypłukać buforem Hepes przez 5 min.
9. Otworzyć zawór „button” i przeprowadzić przepływ 30 μl penta-His-biotyny (0.16 μg/μl) przez 20 min. Przeciwciało zwiąże się z odsłoniętą streptawidyną, konkretnie w obszarze pod „buttonem”, tworząc macierz anty-His-tag.

5. Ekspresja białka

1. Exprymuj białka na urządzeniu, wykorzystując szybką, sprzężoną reakcję transkrypcji i translacji z retikulocytów królika. Ekspresja białek z naniesionych na urządzenie syntetycznych genów tworzy matrycę białek gotowych do użycia. Przykładem takiego zastosowania jest screening wiązania białek.
2. Otwórz zawory „szyjki” (neck) i przepuść szybką, sprzężoną reakcję transkrypcji i translacji z retikulocytów królika przez urządzenie do komory DNA. Następnie zamknij zawory „kanapkowe” (sandwich), aby odizolować każdy gen od jego otoczenia. Inkubuj urządzenie na płycie grzejnej przez 2,5 hr w temperaturze 30 °C. Wyexprymowane białka będą spontanicznie dyfundować z komory DNA do komory reakcyjnej (zawór szyjki jest otwarty) i wiązać się z przeciwciałem anty-His pod zaworem „przycisku” (button), co unieruchomi białko za pomocą znacznika C-końca.
3. Oznakuj białka przeciwciałem C-myc Cy3. Przeciwciało zwiąże się z odpowiadającym mu epitopem znajdującym się na N-końcu białka.
4. Wyznacz poziomy ekspresji białek za pomocą skanera mikromacierzy (LS Reloaded, Tecan), używając lasera 532 nm i filtra emisji 575 nm.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Wykonanie urządzenia

Projekt graficzny urządzenia został stworzony w programie AutoCAD na podstawie naszych potrzeb eksperymentalnych. Projekt został wydrukowany na folii przezroczystej za pomocą wysokorozdzielczego rasteryzatora. Przezroczystość ta służy jako fotomaska w fotolitografii kontaktowej. Do stworzenia trójwymiarowych szablonów na waflu krzemowym, zgodnie ze wzorami naniesionymi na użyte maski, zastosowano technikę mikrobobierania powierzchniowego.

Urządzenie mikroprzepływowe zostało wykonane metodą odlewania elastomeru silikonowego polidimetylosiloksanu (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) na formie silikonowej (Rysunek 1). Każde urządzenie składa się z dwóch wyrównanych warstw PDMS: warstwy przepływowej oraz warstwy sterującej. Formę poddano najpierw działaniu oparów chlorotrimetylosilanu (TMCS, Aldrich) przez 10 min, aby ułatwić oddzielenie elastomeru po etapach wygrzewania. Mieszaninę elastomeru silikonowego i utwardzacza przygotowano w dwóch różnych proporcjach: 5:1 dla formy warstwy sterującej i 20:1 dla formy warstwy przepływowej. Warstwę sterującą odgazowano i wygrzewano przez 30 min w temperaturze 80 °C. Warstwę przepływową początkowo naniesiono metodą spin-coatingu (Laurell, USA) przy 2 600 rpm przez 60 s, a następnie wygrzewano w 80 °C przez 30 min. Warstwę sterującą oddzielono od formy i wykonano otwory dostępu do kanałów sterujących. Następnie warstwę przepływową i sterującą wyrównano ręcznie pod stereomikroskopem i wygrzewano przez 2 h w 80 °C. Dwuwarstwowe urządzenie oddzielono od formy przepływowej i wykonano otwory dostępu do kanałów przepływowych.

2. Opis urządzenia

Pojemność urządzenia może wynosić od 500 do 10 000 komórek jednostkowych (Rycyna 2). Urządzenie składa się z dwóch warstw: warstwy przepływowej (szarej) oraz warstwy sterującej (kolorowej). Warstwa sterująca zawiera szereg zaworów o różnych funkcjach. Każda komórka jednostkowa w warstwie przepływowej składa się z jednej komory DNA i jednej komory reakcyjnej; jest ona kontrolowana przez trzy typy mikromechanicznych zaworów: „neck” (szyjkowy), „button” (przyciskowy) oraz „sandwich” (kanapkowy) (Rycina 2A). Naniesiony „gen syntetyczny” wewnątrz komory DNA jest oddzielony od komory reakcyjnej za pomocą zaworu „neck” (zielony). Chwytanie i mechaniczne płukanie białek związanych z powierzchnią w komorze reakcyjnej odbywa się za pomocą zaworu „button” (niebieski). Zawór „sandwich” umożliwia przeprowadzenie każdej reakcji w oddzielnej komórce jednostkowej (czerwony). Zawory adresowe pozwalają podzielić urządzenie na maksymalnie 8 niezależnych sekcji, co umożliwia analizę różnych warunków. Dodatkowo warstwa sterująca zawiera zawory wlotowe, które umożliwiają przepływ wybranych cieczy do warstwy przepływowej. Kanały sterujące z PDMS są wypełnione DDW. Po aktywacji zaworu wzrost ciśnienia (15 psi) powoduje rozszerzenie PDMS. W miejscach, gdzie membrana jest wystarczająco cienka (np. na przecięciu linii sterującej i przepływowej), jest to wystarczające do całkowitego zablokowania linii przepływu. Średnia wysokość komórki jednostkowej wynosi 10 μm, a średnia objętość komórki jednostkowej jest mniejsza niż 1 nl.

3. Ekspresja i detekcja białek

Białka wyekspresjonowano w urządzeniu z wykorzystaniem szybkiego sprzężonego układu transkrypcji i translacji z retikulocytów królika (Promega). Ekspresja białek pozwoliła na stworzenie macierzy białek gotowych do użycia w badaniu wiązania (Rysunek 3). Mieszaninę do ekspresji (12,5 μl) wprowadzono do urządzenia, a następnie wpuszczono do komór z DNA poprzez otwarcie zaworów „szyjnych”. Następnie zamknięto zawory „kanapkowe”, oddzielając każdą komórkę jednostkową od komórek sąsiednich, i inkubowano urządzenie na płycie grzejnej przez 2,5 h w temperaturze 30 °C. Wyekspresjonowane białka dyfundowały z komory genów do komory reakcyjnej, gdzie ich znacznik His na C-końcu mógł związać się z przeciwciałem anty-His (Qiagen) zlokalizowanym pod zaworem „przyciskowym”, co doprowadziło do unieruchomienia białka na powierzchni. Białka znakowano C-myc Cy3 (Sigma), który wiązał się z odpowiadającym mu epitopem znajdującym się na N-końcu białka i znakował go. Poziomy ekspresji białek określono za pomocą skanera mikrotablic (LS Reloaded, Tecan), używając lasera 532 nm i filtra 575 nm. Powstała macierz białek składa się z różnych poziomów ekspresji białek. Zazwyczaj około 20% biblioteki genów nie wykazuje ekspresji na poziomach wykrywalnych. Nie zaobserwowano korelacji z wielkością białka ³. Poziomy tła określono przy użyciu komór, w których nie naniesiono DNA. Zatem sygnały z odpowiadających im komór białkowych wynikają albo z szumu, albo z nieswoistej adsorpcji przeciwciał znakujących.

Rycina 1. Fabrykacja chipa. (A) Formy poddano działaniu oparów TMCS przez 10 min. (B) PDMS został odlany na kontrolnych i przepływowych formach krzemowych. (C) Zarówno formy kontrolne, jak i przepływowe, wypiekano w 80 °C przez 30 min. (D) Warstwę kontrolną oddzielono od formy, docięto do odpowiedniego rozmiaru i wykonano otwory wlotowe dla kontroli. (E) Warstwę kontrolną wyrównano względem warstwy przepływowej pod stereomikroskopem, a następnie wypiekano w 80 °C przez 2 hr. Równolegle do fabrykacji urządzenia z PDMS, szereg syntetycznych genów naniesiono metodą mikroarray na szklane podłoża pokryte epoksydem (CEL Associates). (F) Następnie urządzenie wyrównano względem mikroarray DNA, zamykając „syntetyczne geny” w komorach DNA.

Rysunek 2. Zdjęcie urządzenia PING. (A) Urządzenie składa się z dwóch wyrównanych warstw PDMS (kontrolnej i przepływowej). Warstwa przepływowa zawiera równoległe komory DNA i komory reakcyjne (szare), sterowane za pomocą zaworów mikromechanicznych (typu „button”, „sandwich” i „neck”) znajdujących się w warstwie kontrolnej. (B) Warstwy są wyrównane względem wydrukowanego mikrociałcza, co pozwala na zaprogramowanie każdej komory DNA za pomocą pojedynczego punktu. Eliminuje to wszelkie potencjalne zanieczyszczenia.

Rycina 3. Obrazy fluorescencyjne macierzy białek stworzonej za pomocą chipa mikrofluidycznego. Naniesione geny w plamkach zostały wyekspresowane do postaci białek wewnątrz urządzenia (w komorze DNA) i zostały przyciągnięte do powierzchni (poniżej zaworu typu „przycisk” w komorze reakcyjnej) za pomocą znaczników His na koniec C. Ekspresję białek wykryto za pomocą znaczników C-myc na koniec N oraz specyficznego przeciwciała fluorescencyjnego. Różne natężenia sygnału wskazują na różne poziomy ekspresji białek. Komory bez naniesionych genów służyły jako kontrole poziomu tła.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wysokoprzepustowego generowania macierzy białkowych z wykorzystaniem platformy mikrofluidycznej. Tworzenie macierzy opiera się na drukowaniu matryc DNA w formie mikromacierzy oraz ekspresji białek in vitro z DNA bezpośrednio w urządzeniu mikrofluidycznym.

Nasza nowatorska platforma mikroprzepływowa posiada kilka istotnych zalet w porównaniu z obecnie stosowanymi metodami, co czyni ją obiecującym i uniwersalnym narzędziem dla proteomiki. Jedną z ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS- SYLGARD 184	Dow Corning USA	ESSEX-DC
Chlorotrimetylosilan (TMCS)	Sigma-Aldrich	C72854
Podłoża szklane powlekane epoksydem	CEL Associates USA	VEPO-25C
Glikol polietylenowy (PEG)	Sigma-Aldrich	81260
D-trehaloza dwuwodnian	Sigma-Aldrich	T9531
Biotynilowana BSA	Pierce, Thermo Scientific	PIR-29130
Neutravidyna	Pierce, Thermo Scientific	31050
penta-His-biotyna	Qiagen	34440
Hepes	Biological Industries	03-025-1B
TNT-T7	Promega Corp.	L5540
Przeciwciało C-myc Cy3	Sigma-Aldrich
Sterownik	Stanford Microfluidics Foundry
Forma	Stanford Microfluidics Foundry
Pin	New England Small Tubes Corporation
Przewody Tygon microbore	Tygon	S-54-HL
Microarrayer	Bio Robotics	MicroGrid 610
Piny silikonowe	Parallel Synthesis	SMT-S75