Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybko rozwijające się dziedziny, takie jak biologia systemowa, wymagają opracowania i wdrożenia nowych technologii umożliwiających wysokoprzepustowe i precyzyjne pomiary dużych układów. Mikrofluidyka obiecuje spełnienie wielu z tych wymagań, takich jak przeprowadzanie wysokoprzepustowych eksperymentów przesiewowych na chipie, obejmujących testy biochemiczne, biofizyczne i komórkowe1. Od początków urządzeń mikrofluidycznych dziedzina ta ewoluowała drastycznie, co doprowadziło do rozwoju mikrofluidycznej integracji wielkoskalowej2,3. Technologia ta pozwala na zintegrowanie tysięcy mikromechanicznych zaworów na jednym urządzeniu o rozmiarach znaczka pocztowego (Rysunek 1). Opracowaliśmy wysokoprzepustową platformę mikrofluidyczną do generowania ekspresji macierzy białkowych in vitro (Rysunek 2) o nazwie PING (Protein Interaction Network Generator). Macierze te mogą służyć jako wzorzec dla wielu eksperymentów, takich jak oddziaływania białko-białko4, białko-RNA5 lub białko-DNA6.
Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych, które są programowane indywidualnie za pomocą mikroarrayera. Dopasowanie tych wydrukowanych mikroarrayów do urządzeń mikroprzepływowych programuje każdą komorę za pomocą pojedynczej plamki, co eliminuje potencjalne zanieczyszczenie lub reaktywność krzyżową. Ponadto generowanie mikroarrayów przy użyciu standardowych technik nanoszenia plamek jest bardzo modułowe, co umożliwia tworzenie macierzy białek7, DNA8, małych cząsteczek, a nawet zawiesin koloidalnych. Potencjalny wpływ mikroprzepływów na nauki biologiczne jest znaczący. Liczne testy oparte na mikroprzepływach dostarczyły już nowych informacji na temat struktury i funkcji systemów biologicznych, a dziedzina mikroprzepływów będzie nadal oddziaływać na biologię.
Protokół
1. Wytwarzanie urządzenia
- Należy zakupić formę kontrolną DTPA-D SU-8 oraz formę przepływową SPR220-7 z Stanford Microfluidics Foundry (www.stanford.edu/group/foundry).
- Formy silikonowe należy poddać działaniu oparów chlorotrimetylosilanu (TMCS) przez 10 min, aby ułatwić oddzielenie elastomeru po etapach wygrzewania9.
- Należy przygotować mieszaninę elastomeru na bazie silikonu i utwardzacza (dokładnie wymieszać) w dwóch różnych proporcjach: 5:1 dla formy kontrolnej oraz 20:1 dla formy przepływowej. Różne proporcje są niezbędne do prawidłowego wiązania wielu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wysokoprzepustowego generowania macierzy białkowych z wykorzystaniem platformy mikrofluidycznej. Tworzenie macierzy opiera się na drukowaniu matryc DNA w formie mikromacierzy oraz ekspresji białek in vitro z DNA bezpośrednio w urządzeniu mikrofluidycznym.
Nasza nowatorska platforma mikroprzepływowa posiada kilka istotnych zalet w porównaniu z obecnie stosowanymi metodami, co czyni ją obiecującym i uniwersalnym narzędziem dla proteomiki. Jedną z .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z międzynarodowego grantu reintegracyjnego programu Marie Curie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ESSEX-DC | |
| Chlorotrimetylosilan (TMCS) | Sigma-Aldrich | C72854 | |
| Podłoża szklane powlekane epoksydem | CEL Associates USA | VEPO-25C | |
| Glikol polietylenowy (PEG) | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| D-trehaloza dwuwodnian | Sigma-Aldrich | T9531 | |
| Biotynilowana BSA | Pierce, Thermo Scientific | PIR-29130 | |
| Neutravidyna | Pierce, Thermo Scientific | 31050 | |
| penta-His-biotyna | Qiagen | 34440 | |
| Hepes |  Biological Industries | 03-025-1B | |
| TNT-T7 | Promega Corp. | L5540 | |
| Przeciwciało C-myc Cy3 | Sigma-Aldrich | ||
| Sterownik | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Forma | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Pin | New England Small Tubes Corporation | ||
| Przewody Tygon microbore | Tygon | S-54-HL | |
| Microarrayer | Bio Robotics | MicroGrid 610 | |
| Piny silikonowe | Parallel Synthesis | SMT-S75 |
Bibliografia
- Maerkl, S. J. Integration column: Microfluidic high-throughput screening. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).
- Hong, J. W., Quake, S. R. Integrated nanoliter systems. Nature. 21, 1179-1183 (2003).
- Ung....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
