Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Podsumowanie

Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym do identyfikacji leków, które oddziałują z kanałami prostownika wewnętrznego K⁺ (GIRK) bramkowanym białkiem G. Test wykorzystuje barwniki fluorescencyjne wrażliwe na potencjał błony do pomiaru aktywności kanału GIRK. Technikę tę można dostosować do stosowania na wielu liniach komórkowych.

Streszczenie

G kanały, bramkowany wewnętrznym prostownikiem wewnętrznym K⁺ (GIRK), funkcjonują jako mediatory komórkowe szerokiego zakresu hormonów i neuroprzekaźników i są wyrażane w mózgu, sercu, mięśniach szkieletowych i tkance endokrynnej^1,2. Kanały GIRK aktywują się po związaniu ligandów (neuroprzekaźników, hormonów, leków itp.) z ich receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) związanymi z błoną plazmatyczną. To wiązanie powoduje stymulację białek G (G_{i i G o}), które następnie wiążą się z kanałem GIRK i aktywują go. Po otwarciu kanał GIRK umożliwia ruch K⁺ na zewnątrz komórki, powodując, że spoczynkowy potencjał błony staje się bardziej ujemny. W konsekwencji aktywacja kanału GIRK w neuronach zmniejsza spontaniczne tworzenie potencjału czynnościowego i hamuje uwalnianie neuroprzekaźników pobudzających. W sercu aktywacja kanału GIRK hamuje aktywność rozrusznika serca, spowalniając w ten sposób tętno.

Kanały GIRK stanowią nowe cele dla rozwoju nowych środków terapeutycznych do leczenia bólu neuropatycznego, uzależnienia od narkotyków, zaburzeń rytmu serca i innych zaburzeń³. Jednak farmakologia tych kanałów pozostaje w dużej mierze niezbadana. Chociaż wiele leków, w tym leki przeciwarytmiczne, leki przeciwpsychotyczne i przeciwdepresyjne, blokuje kanał GIRK, hamowanie to nie jest selektywne i występuje przy stosunkowo wysokich stężeniach leków³.

Tutaj opisujemy test przesiewowy w czasie rzeczywistym do identyfikacji nowych modulatorów kanałów GIRK. W tym teście neuronalne komórki AtT20, wyrażające kanały GIRK, są obciążone wrażliwymi na potencjał błonowy barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak bis-(kwas 1,3-dibutylobarbiturowy) trimetynooksonol [DiBAC₄ (3)] lub HLB 021-152 (Figura 1). Cząsteczki barwnika stają się silnie fluorescencyjne po wchłonięciu przez komórki (ryc. 1). Traktowanie komórek ligandami GPCR stymuluje kanały GIRK do otwarcia. Powstały wypływ K⁺ z komórki powoduje, że potencjał błony staje się bardziej ujemny, a sygnał fluorescencyjny zmniejsza się (ryc. 1). W ten sposób leki, które modulują wypływ K⁺ przez kanał GIRK, można oznaczyć za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. W przeciwieństwie do innych testów przesiewowych kanałów jonowych, takich jak atomowa spektrometria absorpcyjna⁴ lub analiza radioznacznikowa⁵, test fluorescencyjny kanału GIRK zapewnia szybką, niedrogą procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Hoduj przysadkowe komórki AtT20 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% surowicą końską i utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ .
2. Utrzymuj kulturę, podkulturując komórki co 5 do 7 dni przy użyciu standardowej procedury trypsynizacji.
3. Pokrywę studzienek z czarnej, przezroczystej, 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem 50 μl poli-l-lizyny. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na 30 minut w inkubatorze.
4. Umieść komórki w 96-dołkowych płytkach zawierających 200 μl pożywki o gęstości 30 000 komórek na studzienkę i przechowuj komórki w inkubatorze przez 3-4 dni.
5. Użyj zestawu do aspiracji, składającego się z zakorkowanego 4-litrowego słoika podłączonego do próżni na jednym końcu i końcówki pipety o pojemności 200 μl na drugim końcu, aby powoli zassać pożywkę hodowlaną z monowarstwy komórek.
6. Przemyć komórki 200 μl normalnego roztworu buforowego (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM dekstrozy, 5 mM HEPES, pH 7,4 z NaOH).
7. Dodać 200 μl roztworu buforowego zawierającego barwnik wrażliwy na potencjał błonowy (MPD) DiBAC₄(3) lub HLB 021-152 (5 μM) do każdego dołka i inkubować komórki przez 40 minut w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie badanych związków i leczenie komórkami

1. Przygotować seryjne rozcieńczanie badanych związków (zapas = 10 mM w DMSO) z biblioteki związków (w formacie 96-dołkowym) przy użyciu zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy Versette (ThermoFisher).
2. Wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę zawierającą komórki AtT20 i odczekać, aż płytka powróci do temperatury pokojowej. Odessać stary bufor i nałożyć świeży roztwór buforowy zawierający MPD na komórki.
3. Korzystając z systemu obchodzenia się z cieczą, należy nanieść różne stężenia (od 10 nM do 10 μM) badanych związków (od 2 do 20 μl) i roztworów kontrolnych (0,1% DMSO) (w roztworze buforowym zawierającym MPD) na 96-dołkową płytkę zawierającą komórki.
4. Inkubować komórki przez 5 minut z badanymi związkami przed pomiarami fluorescencyjnymi.

3. Aktywacja kanałów GIRK, pomiar i analiza fluorescencji

1. Włóż 96-dołkową płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych Biotek Synergy2 i uzyskaj fluorescencyjny sygnał tła o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 520 i 560 nm.
2. Nanieść ligandy GPCR (somatostatyna = 200 nM lub karbachol = 10 μM) lub roztwór kontrolny (sam bufor) (20 μL) do studzienek (całkowita objętość = 220 μL) w celu aktywacji kanałów GIRK za pomocą systemu wtryskiwaczy Synergy2. Zbieraj punkty danych w odstępach 10 s przez 300-sekundowy okres próbkowania przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 520 i 560 nm.
3. Uzyskaj przebieg czasowy i amplitudę piku zmiany fluorescencji za pomocą oprogramowania Biotek Gen5 i wyeksportuj dane do programu Excel w celu dalszej analizy.
4. Obliczyć współczynnik Z', aby określić wiarygodność testu. Płytki używane do oznaczania współczynnika Z' zawierały po 2 rzędy dodatnich (ligand GPCR) i ujemnych (sam bufor) kontroli. Współczynnik Z' definiuje się jako: Z' = 1 - (3σ_P + 3σ_N) / | μ_P - μ_N |, gdzie_{μ P} & μ_N są średnimi sygnałów kontroli dodatniej i kontroli ujemnej, a_{σ P} & σ_N są odchyleniami standardowymi odpowiednio sygnałów kontroli dodatniej i kontroli ujemnej ⁶. Współczynniki Z' w zakresie od 0,5 do 1,0 wskazują, że jakość testu jest doskonała ⁶. Płytki o współczynnikach Z' poniżej 0,5 są wyłączone z analizy.
5. Związki, które modulują sygnał fluorescencyjny, są ponownie testowane w obecności Ba²⁺ lub tertiapiny-Q w celu potwierdzenia specyficzności kanału prostownika wewnętrznego K⁺.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład sygnału fluorescencji mierzonego za pomocą testu kanału GIRK pokazano na rysunku 2. Dodanie liganda liganda GPCR somatostatyny (200 nM) do komórek AtT20 spowodowało szybki, zależny od czasu spadek sygnału fluorescencyjnego HLB 021-152 (ryc. 2). Natomiast dodanie roztworu kontrolnego spowodowało niewielki chwilowy wzrost fluorescencji, który z czasem powrócił do wartości wyjściowej (ryc. 2). Porównanie szczytowych wartości fluorescencyjnych w 96-dołkowych płytkach wstrzykniętych roztworami kontrolnymi i somatostatyny dało współczynniki Z' w zakresie od 0,5 do 0,7. W celu dalszej kwantyfikacji zapis kontrolny odjęto od zapisu somatostatyny i przeanalizowano wynikowy sygnał wrażliwy na somatostatynę (ryc. 2).

Test dostarcza metody szybkiej identyfikacji leków, które modulują kanały GIRK. Na przykład leki, które hamują kanał GIRK, powinny zmniejszać spadek fluorescencji za pośrednictwem ligandu GPCR, zapobiegając wypływowi K⁺ z komórek. Jak pokazano na rycinie 3, traktowanie komórek tertiapiną-Q, toksyną, która blokuje kanały^{GIRK 7}, spowodowało zahamowanie zmiany fluorescencyjnej za pośrednictwem somatostatyny. Propafenon, lek przeciwarytmiczny, który blokuje kanały GIRK w sercu⁸, również hamował zmianę fluorescencyjną (ryc. 4). Test może być również przydatny do identyfikacji aktywatorów kanału GIRK. Jednak zastosowanie etanolu (100 i 200 mM), aktywatora kanału^2,3 GIRK, nie spowodowało istotnej zmiany sygnału fluorescencyjnego w porównaniu z roztworem kontrolnym (p > 0,5).

Rysunek 1. Projekt eksperymentalny testu fluorescencyjnego kanału GIRK. Komórki AtT20 są inkubowane w buforze zawierającym wrażliwy na potencjał błonowy barwnik fluorescencyjny (D). Cząsteczki barwnika dostają się do komórek i stają się fluorescencyjne po związaniu się z białkami wewnątrzkomórkowymi (górny panel). Wiązanie somatostatyny (Som) z jej GPCR stymuluje białko hamujące G (G_i), powodując aktywację kanału GIRK (dolny panel). Późniejszy wypływ K⁺ z komórek powoduje, że potencjał błonowy staje się bardziej ujemny, a cząsteczki barwnika opuszczają komórki. W rezultacie sygnał fluorescencyjny maleje (dolny panel).

Rysunek 2. Reprezentatywny sygnał fluorescencyjny HLB 021-152 mierzony w czasie w komórkach AtT20 podczas dodawania somatostatyny lub roztworu kontrolnego. Stosunek intensywności fluorescencji (F/F_O) obliczono, dzieląc sygnał w obecności (F) somatostatyny (lub roztworu kontrolnego) przez sygnał podstawowy mierzony przed dodaniem_(FO) somatostatyny (lub roztworu kontrolnego). Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną w 5-6 dołkach. Somatostatynę lub roztwór kontrolny dodano w czasie zero (↓). Dodanie roztworu kontrolnego spowodowało niewielki przejściowy wzrost sygnału fluorescencyjnego. Wynikało to ze zmiany temperatury spowodowanej wstrzyknięciem roztworu.

Rysunek 3. Traktowanie komórek AtT20 tertiapiną-Q (500 nM) hamuje spadek sygnału fluorescencyjnego za pośrednictwem somatostatyny poprzez wiązanie się z kanałami GIRK i ich blokowanie. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną w 4-6 dołkach. Somatostatynę dodano w czasie zero (↓).

Rysunek 4. Traktowanie komórek AtT20 propafenonem (20 μM) hamuje również spadek sygnału fluorescencyjnego za pośrednictwem somatostatyny. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną w 5-6 dołkach. Somatostatynę dodano w czasie zero (↓).

Dyskusja

Podczas gdy barwniki fluorescencyjne wrażliwe na potencjał błonowy zostały wykorzystane do identyfikacji leków, które modulują kanały jonowe^9,10, jest to pierwsze doniesienie o ich zastosowaniu do odkrywania leków w neuronalnym kanale GIRK. Przedstawiony tutaj test fluorescencyjny kanału GIRK zapewnia szybką, niezawodną metodę badań przesiewowych kanałów K⁺ bramkowanych ligandem. Test można zmodyfikować do stosowania z szeroką gamą komórek, w tym unieśmiertelnionymi liniami komórek (HEK293, CHO itp...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Cellgro	10-013
Surowica dla koni	Invitrogen	16050-114
96-dołkowe płytki	Corning	3603
Poli-l-lizyna	Sigma-Aldrich	P4707
Somatostatyna	Sigma-Aldrich	S9129
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382
HLB 021-152	AnaSpec	89300
Automatyczna ładowarka do cieczy Versette	Thermo Fisher Scientific, Inc.	650-01
Czytnik płytek fluorescencyjnych Synergy2	BioTek
Gen5	BioTek
Tabela 1. Tabela konkretnych odczynników i sprzętu.