Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami K+ wewnątrzstymulowanymi, bramkowanymi przez białka G (GIRK). Test wykorzystuje fluorescencyjne barwniki czułe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK. Technika ta może być dostosowana do zastosowania w wielu liniach komórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
K potasowy wewnątrzprostujący sterowany białkiem G+ Kanały (GIRK) pełnią funkcję komórkowych mediatorów szerokiego spektrum hormonów i neurotransmiterów oraz są eksprimowane w mózgu, sercu, mięśniach szkieletowych i tkance endokrynnej1,2Kanały GIRK ulegają aktywacji po związaniu ligandów (neuroprzekaźników, hormonów, leków itp.) z ich receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR), które są związane z błoną plazmatyczną. Wiązanie to powoduje stymulację białek G (Gi oraz Go), które następnie wiążą się z kanałem GIRK i aktywują go. Po otwarciu kanał GIRK umożliwia ruch K+ z komórki, co powoduje, że potencjał spoczynkowy błony staje się bardziej ujemny. W konsekwencji aktywacja kanałów GIRK w neuronach zmniejsza częstotliwość spontanicznego powstawania potencjałów czynnościowych i hamuje uwalnianie pobudzających neuroprzekaźników. W sercu aktywacja kanałów GIRK hamuje aktywność rozrusznikową, spowalniając tym samym częstotliwość akcji serca.
Kanały GIRK stanowią nowe cele dla opracowania nowych środków terapeutycznych w leczeniu bólu neuropatycznego, uzależnień od leków, arytmii serca i innych zaburzeń3. Jednak farmakologia tych kanałów pozostaje w dużej mierze nieznana. Chociaż szereg leków, w tym środki przeciwarytmiczne, leki przeciwpsychotyczne i przeciwdepresyjne, blokuje kanał GIRK, hamowanie to nie jest selektywne i występuje przy stosunkowo wysokich stężeniach leków3.
W niniejszej pracy opisujemy test przesiewowy w czasie rzeczywistym służący do identyfikacji nowych modulatorów kanałów GIRK. W tym teście neuronalne komórki AtT20, wykazujące ekspresję kanałów GIRK, są obciążane fluorescencyjnymi barwnikami wrażliwymi na potencjał błonowy, takimi jak bis-(1,3-dibutylobarbiturowy kwas) trimetynowy oksonol [DiBAC4(3)] lub HLB 021-152 (Rysunek 1). Cząsteczki barwnika stają się silnie fluorescencyjne po wniknięciu do wnętrza komórek (Rysunek 1). Traktowanie komórek ligandami GPCR stymuluje otwarcie kanałów GIRK. Wynikający z tego odpływ jonów K+ z komórki powoduje, że potencjał błonowy staje się bardziej ujemny, a sygnał fluorescencji ulega zmniejszeniu (Rysunek 1). W ten sposób leki modulujące odpływ K+ przez kanał GIRK mogą być analizowane przy użyciu płytkowego czytnika fluorescencji. W przeciwieństwie do innych testów przesiewowych kanałów jonowych, takich jak spektrometria absorpcyjna z atomizacji4 czy analiza z użyciem znaczników radioaktywnych5, fluorescencyjny test kanałów GIRK zapewnia szybką, niedrogą procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
- Hodować komórki przysadki AtT20 w podłożu Eagle'a zmodyfikowanym przez Dulbecco (DMEM) uzupełnionym o 10% surowicy konia; kultury utrzymywać w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2.
- Utrzymywać kulturę poprzez pasażowanie komórek co 5 do 7 dni przy użyciu standardowej procedury trypsynizacji.
- Pokryć dołki czarnych płytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem 50 μL poli-l-lizyny. Pozostawić dołki do wyschnięcia na 30 min w inkubatorze.
- Wysiać komórki na płytki 96-dołkowe zawierające 200 μL podłoża w gęstości 30 000 komórek na dołek i przechowywać komórki w inkubatorze przez 3-4 dni.
- Użyć zestawu do aspiracji, składającego się z zamkniętego słoika o pojemności 4 litrów podłączonego z jednej strony do pompy próżniowej, a z drugiej do końcówki pipety 200 μL, aby powoli odessać podłoże hodowlane z monowarstwy komórek.
- Przemyć komórki 200 μL normalnego roztworu buforowego (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM dekstrozy, 5 mM HEPES, pH 7.4 dostrojone NaOH).
- Do każdego dołka dodać 200 μL roztworu buforowego zawierającego barwnik wrażliwy na potencjał błonowy (MPD) DiBAC4(3) lub HLB 021-152 (5 μM) i inkubować komórki przez 40 min w temperaturze 37 °C.
2. Przygotowanie związków testowych i traktowanie komórek
- Przygotować rozcieńczenia szeregowe związków testowych (stężenie zapasu = 10 mM w DMSO) z biblioteki związków (w formacie 96-dołkowym) przy użyciu zautomatyzowanego systemu do obsługi cieczy Versette (ThermoFisher).
- Wyjąć płytkę 96-dołkową zawierającą komórki AtT20 z inkubatora i odczekać, aż płytka osiągnie temperaturę pokojową. Odessać stary bufor i nanieść na komórki świeży roztwór buforowy zawierający MPD.
- Przy użyciu systemu do obsługi cieczy nanieść na płytkę 96-dołkową z komórkami różne stężenia (od 10 nM do 10 μM) związków testowych (od 2 do 20 μL) oraz roztwory kontrolne (0,1% DMSO) (w roztworze buforowym zawierającym MPD).
- Inkubować komórki z związkami testowymi przez 5 min przed wykonaniem pomiarów fluorescencji.
3. Aktywacja kanałów GIRK, pomiar fluorescencyjny i analiza
- Włóż płytkę 96-dołkową do fluorescencyjnego czytnika płytek Biotek Synergy2 i zmierz fluorescencyjny sygnał tła przy długościach fali wzbudzenia 520 nm i emisji 560 nm.
- Za pomocą systemu wtryskiwania Synergy2 dodaj do dołków (objętość całkowita = 220 μL) ligandy GPCR (somatostatyna = 200 nM lub karbachol = 10 μM) lub roztwór kontrolny (sam bufor) (20 μL), aby aktywować kanały GIRK. Rejestruj punkty danych w odstępach 10 s przez 300 s przy długościach fali wzbudzenia 520 nm i emisji 560 nm.
- Wyznacz przebieg czasowy i amplitudę szczytową zmiany fluorescencji przy użyciu oprogramowania Biotek Gen5, a następnie wyeksportuj dane do programu Excel w celu dalszej analizy.
- Oblicz czynnik Z', aby określić wiarygodność testu. Płytki użyte do wyznaczenia czynnika Z' zawierały po 2 rzędy kontroli pozytywnych (ligand GPCR) i negatywnych (sam bufor). Czynnik Z' definiuje się jako: Z' = 1 - (3σP + 3σN) / | μP - μN |, gdzie μP i μN to średnie sygnałów kontroli pozytywnej i negatywnej, a σP i σN to odpowiednio odchylenia standardowe sygnałów kontroli pozytywnej i negatywnej 6. Wartości czynnika Z' w zakresie od 0,5 do 1,0 wskazują na doskonałą jakość testu 6. Płytki z czynnikami Z' poniżej 0,5 są wykluczane z analizy.
- Związki modulujące sygnał fluorescencyjny są poddawane ponownym testom w obecności Ba2+ lub tertiapiny-Q w celu potwierdzenia specyficzności wobec kanałów K+ prostownika do wewnątrz.
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład sygnału fluorescencji zmierzonego przy użyciu testu kanałów GIRK przedstawiono na Rysunku 2. Dodanie liganda GPCR, somatostatyny (200 nM), do komórek AtT20 spowodowało szybki, zależny od czasu spadek sygnału fluorescencji HLB 021-152 (Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego, dodanie roztworu kontrolnego spowodowało niewielki, chwilowy wzrost fluorescencji, która z czasem powróciła do poziomu bazowego (Rysunek 2). Porównanie szczytowych wartości fluorescencji w płytkach 96-dołkowych po iniekcji roztworów kontrolnych i somatostatyny dało wartości czynnika Z' w zakresie od 0,5 do 0,7. W celu dalszej kwantyfikacji, zapis kontrolny odjęto od zapisu dla somatostatyny, a następnie przeanalizowano wynikający z tego sygnał wrażliwy na somatostatynę (Rysunek 2).
Analiza ta zapewnia metodę szybkiej identyfikacji leków modulujących kanały GIRK. Na przykład leki hamujące kanał GIRK powinny zmniejszać indukowany przez ligand GPCR spadek fluorescencji poprzez zapobieganie odpływowi K+ z komórek. Jak pokazano na Rysunku 3, traktowanie komórek tertiapiną-Q, toksyną blokującą kanały GIRK7, spowodowało zahamowanie indukowanej somatostatyną zmiany fluorescencji. Propafenon, lek przeciwarytmiczny blokujący kanały GIRK w sercu8, również zahamował zmianę fluorescencji (Rysunek 4). Analiza ta może być również przydatna do identyfikacji aktywatorów kanału GIRK. Jednakże zastosowanie etanolu (100 & 200 mM), aktywatora kanału GIRK2,3, nie wywołało istotnej zmiany sygnału fluorescencyjnego w porównaniu z roztworem kontrolnym (p > 0,5).
Rycina 1. Schemat eksperymentalny fluorescencyjnego testu kanałów GIRK. Komórki AtT20 inkubuje się w buforze zawierającym barwnik fluorescencyjny wrażliwy na potencjał błonowy (D). Cząsteczki barwnika wnikają do komórek i stają się fluorescencyjne po związaniu się z białkami wewnątrzkomórkowymi (panel górny). Wiązanie somatostatyny (Som) do jej receptora GPCR stymuluje inhibicyjne białko G (Gi), co powoduje aktywację kanału GIRK (panel dolny). Następujący po tym odpływ K+ z komórek powoduje, że potencjał błonowy staje się bardziej ujemny, a cząsteczki barwnika opuszczają komórki. W rezultacie sygnał fluorescencyjny maleje (panel dolny).
Rycina 2. Reprezentatywny sygnał fluorescencyjny HLB 021-152 mierzony w czasie w komórkach AtT20 podczas dodawania somatostatyny lub roztworu kontrolnego. Stosunek intensywności fluorescencji (F/FO) obliczono poprzez podzielenie sygnału w obecności (F) somatostatyny (lub roztworu kontrolnego) przez sygnał bazowy zmierzony przed (FO) dodaniem somatostatyny (lub roztworu kontrolnego). Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną z 5-6 studni. Somatostatynę lub roztwór kontrolny dodano w czasie zero (↓). Dodanie roztworu kontrolnego spowodowało niewielki, przejściowy wzrost sygnału fluorescencyjnego. Wynikało to ze zmiany temperatury spowodowanej wstrzyknięciem roztworu.
Rycina 3. Leczenie komórek AtT20 tertiapiną-Q (500 nM) hamuje indukowany somatostatyną spadek sygnału fluorescencyjnego poprzez wiązanie i blokowanie kanałów GIRK. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną w 4-6 studzienkach. Somatostatynę dodano w czasie zero (↓).
Rysunek 4. Leczenie komórek AtT20 propafenonem (20 μM) również hamuje zależny od somatostatyny spadek sygnału fluorescencyjnego. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną z 5-6 studni. Somatostatynę dodano w czasie zero (↓).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Choć barwniki fluorescencyjne wrażliwe na potencjał błony były stosowane do identyfikacji leków modulujących kanały jonowe9,10, niniejsza praca jest pierwszym doniesieniem o ich zastosowaniu w poszukiwaniu leków wpływających na neuronalne kanały GIRK. Przedstawiony tutaj fluorescencyjny test kanałów GIRK zapewnia szybką, niezawodną i monitorowaną w czasie rzeczywistym metodę przesiewową dla kanałów K+ sterowanych ligandami. Test ten można modyfikować w celu zastosowania go w szerokim zakresie komóre...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant US Public Health Service nr NS-071530.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Surowica końska | Invitrogen | 16050-114 | |
| Płytki 96-dołkowe | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatyna | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Karbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Automatyczny system pipetujący Versette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Fluorescencyjny czytnik płytek Synergy2 | BioTek | ||
| Oprogramowanie analityczne Gen5 | BioTek | ||
| Tabela 1. Wykaz specyficznych odczynników i sprzętu. |
Bibliografia
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
