Prezentacja szybkiego testu ilościowego hamowania krzepnięcia krwi przez enoksaparynę, będącą heparyną o niskiej masie cząsteczkowej. Wkład enoksaparyny jest oceniany poprzez usunięcie jej wpływu za pomocą trawienia heparynazą. Pełniejszy opis testu szczegółowo przedstawiono w naszej opublikowanej pracy.1 Test ten wymaga nadal potwierdzenia klinicznego.
Artykuł metodologiczny
Szybki test przy łóżku pacjenta (point-of-care) do oceny skuteczności przeciwkrzepliwej enoxaparyny w krwi pełnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje potrzeba opracowania testu klinicznego do określania stopnia, w jakim krew pacjenta jest skutecznie przeciwkrzepliwa dzięki zastosowaniu heparyny drobnocząsteczkowej (LMWH), enoksaparyny. Istnieją również pilne sytuacje kliniczne, w których istotne byłoby szybkie ustalenie tego parametru. Niniejszy test został zaprojektowany w celu osiągnięcia tego celu. Analizowano wyłącznie próbki ludzkiej krwi wzbogacone znanymi stężeniami enoksaparyny. Kluczową cechą niniejszego testu jest ilościowe określenie skuteczności enoksaparyny w próbce krwi pacjenta poprzez jej degradację do całkowitej nieaktywności za pomocą heparynazy. Dwie próbki krwi pobrano do probówek Vacutainer (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) wzbogaconych enoksaparyną; jedną próbkę trawiono heparynazą przez 5 min w 37 °C, natomiast druga próbka reprezentowała bazowy stan przeciwkrzepliwości pacjenta. Procentowe skrócenie czasu krzepnięcia w próbce traktowanej heparynazą, w porównaniu ze stanem bazowym, pozwoliło określić wkład przeciwkrzepliwy enoksaparyny. Do pomiarów czasu krzepnięcia wykorzystano przenośne, zasilane bateryjnie urządzenie Hemochron 801 (International Technidyne Corp., Edison, NJ). Urządzenie posiada dwa gniazda na probówki testowe z termostatyczną kontrolą temperatury (37 °C). Testy przeprowadzano przy użyciu dwóch typów wkładów testowych dostępnych u producenta urządzenia. Jeden wkład został zmodyfikowany w celu zwiększenia jego czułości. Usunięto kaolin z wkładu FTK-ACT poprzez intensywne płukanie wodą destylowaną, pozostawiając w charakterze aktywatorów jedynie szklaną powierzchnię probówki oraz prawdopodobnie magnes detekcyjny. Metodę tę określono jako test o minimalnej aktywacji (MAA). Zastosowanie testu o minimalnej aktywacji było badane przez nas i innych autorów. 2-4 Drugim badanym wkładem był test aktywowanego czasu częścicznego protrombiny (aPTT) (A104). Został on wykorzystany w formie dostarczonej przez producenta. Termostatowane gniazda urządzenia służyły zarówno do trawienia heparynazą, jak i do testów krzepliwości. Test można ukończyć w ciągu 10 min. Test MAA wykazał wyraźne zmiany czasu krzepnięcia po trawieniu enoksaparyny heparynazą w typowym klinicznym zakresie stężeń. Przy stężeniu 0,2 anti-Xa I.U. enoksaparyny na ml próbki krwi, trawienie heparynazą spowodowało średni spadek czasu krzepnięcia o 9,8% (20,4 sec); przy 1,0 I.U. na ml enoksaparyny spadek ten wyniósł 41,4% (148,8 sec). Niniejszy raport przedstawia jedynie eksperymentalne zastosowanie testu; jego wartość w warunkach klinicznych wymaga jeszcze ustalenia.
Protokół
1. Rekonstytucja heparynazy
- Liofilizowana heparynaza I jest pozyskiwana komercyjnie (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) w fiolkach zawierających 1 μg oczyszczonego białka. Białko rozpuszcza się w 0,25 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl).
2. Pobieranie próbek krwi
- Pobiera się dwie próbki krwi próżniowo do probówek Vacutainer (Becton-Dickinson; Franklin Lakes, NJ) z buforem cytrynianu sodu (0,3 ml 0,109M; 3,2%); obie probówki są uprzednio wzbogacone znanym stężeniem enoksaparyny; pobierana objętość krwi wynosi 2,7 ml. Całkowita objętość zawartości wynosi wówczas 3,0 ml.
3. Trawienie heparynazą
- Całą zawartość fiolki z heparynazą, którą można pobrać do strzykawki (około 0.2 ml; 80% zawartości fiolki; 0.8 μg białka), przenosi się do jednej probówki Vacutainer; do drugiej probówki dodaje się 0.2 ml soli fizjologicznej (0.9% NaCl), która służy jako stan bazowy przed zniesieniem efektu enoksaparyny.
- Obie probówki Vacutainer umieszcza się w termostatowanych gniazdach aparatu Hemochron na 5 min. (Odpowiedniość 5 min czasu trawienia heparynazą została potwierdzona w naszej wcześniej opublikowanej pracy.1)
4. Testy krzepliwości
- Po zakończeniu inkubacji z heparynazą 2,0 ml krwi przenosi się do kartridża pomiarowego. W przypadku probówki MAA jest ona uprzednio wypełniona 0,1 ml 250 mM CaCl2 w celu zainicjowania krzepnięcia. Komercyjny kartridż do oznaczeń aPTT (A104) jest zaprojektowany tak, aby inicjować krzepnięcie w pełnej krwi pobranej do probówek Vacutainer zawierających cytrynian sodu jako antykoagulant.
- Aparat Hemochron sygnalizuje zakończenie krzepnięcia krwi i zapisuje czas krzepnięcia w sekundach. Różnica w czasie krzepnięcia między próbką traktowaną heparynazą a próbką wyjściową, podzielona przez czas krzepnięcia próbki wyjściowej, pozwala obliczyć procentowy spadek wynikający z eliminacji enoksaparyny. Jak omówiono poniżej, uzyskano silne korelacje liniowe dla zależności między procentowym spadkiem czasu krzepnięcia a stężeniem enoksaparyny w próbkach pełnej krwi z dodatkiem analitytu, a także korelację z pomiarami stężeń enoksaparyny wykonanymi za pomocą chromogennego testu aktywności anty-Xa. Oznaczanie stężenia enoksaparyny testami anty-Xa przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu do dwuetapowego testu chromogennego (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH).
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia wyniki zależności między procentowym spadkiem czasu krzepnięcia po usunięciu enoksaparyny za pomocą heparynazy dla szeregu stężeń enoksaparyny z dodatkiem (0,2, 0,4 i 1,0 anti-Xa IU per ml). Wyniki przedstawiono dla kartridży do analiz MAA oraz aPTT. Na osi odciętych każdego wykresu uwzględniono również zmierzone stężenia enoksaparyny z chromogennego testu aktywności anti-Xa.
Rysunek 2 przedstawia wykresy tych samych danych jako procentowy spadek czasu krzepnięcia w funkcji chromogennego pomiaru aktywności anty-Xa.
W przypadku wszystkich czterech zależności stwierdzono silne korelacje liniowe o wysokiej istotności statystycznej.
Rycina 1. Wyznaczenia w punkcie opieki (point-of-care) wpływu enoksaparyny na czasy krzepnięcia wzbogaconej krwi pełnej w oparciu o procentową zmianę (skrócenie) czasu krzepnięcia po inkubacji z heparynazą. Na osi odpcinnych każdego wykresu naniesiono stężenia enoksaparyny dodane do krwi pełnej oraz zmierzone stężenia przeciw-Xa w osoczu (średnia ± S.E., w nawiasach). Wszystkie procentowe zmiany czasów krzepnięcia przedstawiono jako średnie i S.E., wraz ze średnim skróceniem czasu krzepnięcia w sekundach. Dane pochodzące od tego samego pacjenta połączono liniami przerywanymi. Dane dla czterech pacjentów oznaczonych gwiazdkami na wykresie A (wyniki MAA) są tożsame z danymi czterech pacjentów na wykresie B (testy aPTT). Wszystkie wyniki reprezentują pojedyncze wyznaczenia. Współczynniki korelacji Pearsona wyniosły odpowiednio r = 0.869 (p = 1.9 x 10-5) dla zależności w MAA oraz r = 0.916 (p = 2.8 x 10-5) dla testu aPTT. Reprodukowano za zgodą Inchiosa et al.1
Rysunek 2. Wyniki procentowych zmian czasu krzepnięcia w testach przy łóżku pacjenta (point-of-care) przedstawionych na Rysunkach 1A i B naniesiono w funkcji stężeń anty-czynnika Xa w osoczu. A, wyniki MAA; B, testy aPTT. Wszystkie wyniki pochodzą z pojedynczych pomiarów czasu krzepnięcia i pojedynczych oznaczeń stężeń anty-czynnika Xa. Współczynniki korelacji Pearsona wyniosły odpowiednio r = 0.910 (p = 2.5 x 10-6) dla zależności w teście MAA oraz r = 0.922 (p = 2.0 x 10-5) dla testu aPTT. Reprodukowano za zgodą Inchiosa et al.1
Dyskusja
Niniejszy test skuteczności enoksaparyny może stanowić istotną opcję w ocenie względnego bezpieczeństwa wykonania procedury inwazyjnej, która wiąże się z ryzykiem krwawienia lub powstania krwiaka. Ma to szczególne znaczenie w przypadku rozważania znieczulenia zewnątrzoponniczego. Większość wytycznych zaleca okres oczekiwania wynoszący 12 godzin między podaniem enoksaparyny a rozpoczęciem procedury inwazyjnej.5 Zaburzenia czynności nerek, otyłość oraz ciąża mogą wpływać na wymagania dotyczące dawkowania enoksaparyny.6,7 Ponieważ badanie można przeprowadzić w ciągu 10 min, może ono być stosowane w klinikach lub gabinetach lekarskich, dostarczając informacji o stopniu przeciwkrzepliwości u pacjentów zagrożonych zakrzepicą żył głębokich i zatorowości płucnej. W razie potrzeby można wówczas niezwłocznie wprowadzić korekty dawkowania.
Stężenie enoxaparyny w osoczu można zmierzyć za pomocą testu chromogennego określającego stopień hamowania czynnika krzepnięcia Xa. Pozwala to jednak na oznaczenie jedynie jej stężenia, a nie konkretnie przeciwzakrzepowej skuteczności, która znacznie różni się u poszczególnych pacjentów.6-8
Nasze badania przeprowadzono wyłącznie z użyciem enoksaparyny. Można jednak przypuszczać, że analizę tę można zastosować do każdej LMWH ulegającej degradacji przez heparynazę I. Wiadomo już, że dotyczy to dalteparyny, nadroparyny i tinzaparyny.9-11 Analizę zaprojektowano w odniesieniu do funkcji urządzenia Hemochron do pomiaru czasu krzepnięcia. Urządzenie jest stosunkowo tanie; ponadto koszt jednorazowych probówek do pobierania krwi, ampułki z heparynazą oraz kartridży analitycznych niezbędnych do przeprowadzenia analizy jednego pacjenta wynosi około 15 USD. W związku z tym można oczekiwać, że metoda ta będzie odpowiednia do monitorowania stanu przeciwkrzepliwego w różnych warunkach klinicznych.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania zostały przeprowadzone wyłącznie przy wsparciu zasobów wydziałowych i instytucjonalnych. Aparatura do badania krzepliwości (Hemochron 801) została udostępniona przez producenta w formie nieodpłatnej wypożyczalni. Kasety testowe zostały zakupione w cenach detalicznych. Rysunek wprowadzający w filmie został zmodyfikowany na podstawie pracy Sanderink, et al.12 Drugi rysunek w filmie (harmonogram trawienia heparynazą) został odtworzony za zgodą Inchiosa et al.1
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparynaza I |
| "MAA" wkład | Technidyne | FTK-ACT | zmodyfikowany poprzez usunięcie kaolinu |
| wkład aPTT | Technidyne | A104 |
Bibliografia
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39(2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10(2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
Przedruki i uprawnienia
