Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwierzęta badają otaczające je pachnące środowisko za pomocą systemów chemorecepcyjnych znajdujących się w jamie nosowej. Sygnały chemorecepcyjne wpływają na złożone zachowania, takie jak wybór pokarmu, rozpoznawanie drapieżników, przedstawicieli własnego gatunku oraz partnerów, a także inne istotne sygnały społeczne. Neurony receptorowe węchu (ORNs) znajdują się w grzbietowej części jamy nosowej, wbudowane w nabłonek węchowy. Te neurony dwubiegunowe wysyłają akson do opuszki węchowej (patrz Rys. 1, Reisert & Zhao1, pierwotnie opublikowano w Journal of General Physiology) i wysyłają pojedynczy dendryt do brzegu nabłonka, z którego rzęski promieniują do śluzu pokrywającego nabłonek węchowy. Rzęski zawierają mechanizm transdukcji sygnału, który ostatecznie prowadzi do napływu prądu pobudzającego przez ciliarne kanały transdukcyjne, kanał sterowany cyklicznymi nukleotydami (CNG) oraz kanał Cl- aktywowany jonami Ca2+ (Rys. 1). Następująca po tym depolaryzacja wyzwala generowanie potencjału czynnościowego w ciele komórki2-4.
W tym filmie opisujemy zastosowanie „techniki pipety ssącej” do rejestracji odpowiedzi wywołanych zapachami w neuronach receptorowych węchu (ORN). Metoda ta została pierwotnie opracowana do rejestracji z fotoreceptorów pręcikowych5, a jej wariant, zmodyfikowany do rejestracji z fotoreceptorów czopkowych myszy, dostępny jest na stronie jove.com6. Technika pipety ssącej została później zaadaptowana również do rejestracji z ORN7,8. W skrócie, po dysocjacji nabłonka węchowego i izolacji komórek, całe ciało komórkowe ORN jest wciągane do końcówki pipety rejestrującej. Dendryt i rzęski pozostają wystawione na roztwór kąpieli, a tym samym są dostępne na zmiany w roztworze, co umożliwia np. aplikację substancji zapachowych lub blokerów farmakologicznych. W tej konfiguracji nie uzyskuje się dostępu do środowiska wewnątrzkomórkowego (brak clampowania napięcia w całej komórce), a napięcie wewnątrzkomórkowe pozostaje zmienne. Pozwala to na jednoczesną rejestrację powolnego prądu receptorowego powstającego w rzęskach oraz szybkich potencjałów czynnościowych generowanych przez ciało komórkowe9. Różnica w kinetyce tych dwóch sygnałów pozwala na ich rozdzielenie przy użyciu różnych ustawień filtrów. Technikę tę można stosować u myszy typu dzikiego lub knockout, a także do selektywnej rejestracji z ORN wykazujących ekspresję GFP w celu oznaczenia specyficznych podgrup ORN, np. wykazujących ekspresję danego receptora zapachowego lub kanału jonowego.
Protokół
1. Konfiguracja rejestracji
Komora rejestracyjna jest zamontowana na odwróconym mikroskopie Nikon TE2000U Eclipse z optyką kontrastową fazową, który spoczywa na stole pneumatycznym i jest ekranowany elektrycznie za pomocą klatki Faradaya. Pleksiglasowa komora rejestracyjna składa się z dwóch sekcji częściowo oddzielonych barierą i przyklejonych do zylanyzowanego szkiełka przedmiotowego. Jedna sekcja komory służy do osadzania komórek, natomiast druga do ekspozycji na bodziec podczas rejestracji, aby zminimalizować przedwczesną ekspozycję osadzonych, ale jeszcze niewykorzystanych komórek na substancję zapachową. Układ rejestracyjny składa się z pipety ssącej (patrz poniżej) zamontowanej w uchwycie do pipet oraz elektrody uziemiającej. Pipeta ssąca jest pozycjonowana za pomocą mikromanipulatora. Roztwory bodźców są aplikowane za pomocą potrójnego szklanego kwadratowego kapilarnego układu rurek, gdzie każda rurka ma wymiary 0,7 mm x 0,7 mm. Potrójna szklana kapilara została podłączona do zmotoryzowanego systemu perfuzji szybkiego kroku zamontowanego na manipulatorze (Sutter SF-77B, Warner Instruments) i wprowadzona do komory rejestracyjnej pod kątem ~45°. Końcówka potrójnej szklanej kapilary została ścięta pod kątem 45°, tak aby końcowa powierzchnia (otwór) potrójnej kapilary była pionowa, co pozwala na bliskie pozycjonowanie pipety.
Elektroda pipety ssącej wypełniona standardowym roztworem Ringera dla ssaków oraz elektroda uziemiająca są podłączone do przedwzmacniacza 1 GΩ wzmacniacza patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) pracującego w trybie voltage clamp. Sygnał analogowy z wzmacniacza (filtrowany dolnoprzepustowo przy 5 kHz) jest wyświetlany na cyfrowym oscyloskopie w celu monitorowania sygnału w czasie rzeczywistym, a także podłączony do 8-biegunowego filtra Bessela (Krohn-Hite), gdzie sygnał jest filtrowany dolnoprzepustowo przy 50 Hz. Oba sygnały (filtrowane dolnoprzepustowo przy 5 kHz i 50 Hz) są przesyłane do przetwornika A/D (Cambridge Electronic Design Micro 1401 mkII), który jest podłączony do komputera PC w celu akwizycji danych. Dane są rejestrowane przy użyciu oprogramowania do akwizycji Signal 3 (Cambridge Electronic Design) przy częstotliwości próbkowania 10 kHz. Sygnał jest rejestrowany w dwóch różnych szerokościach pasma, aby najpierw zarejestrować prąd receptorowy wraz z nałożonymi potencjałami czynnościowymi, a następnie sam prąd receptorowy (patrz. Rys. 2). System perfuzyjny jest wykorzystywany do szybkiego przełączania między roztworem Ringera (kontrolnym) a bodźcami zapachowymi lub dowolnym roztworem o pożądanym składzie i jest sterowany przez komputer PC oraz oprogramowanie Signal 3. Roztwory znajdują się w strzykawkach o pojemności 60 ml, a szybkość przepływu jest regulowana za pomocą medycznych regulatorów przepływu do infuzji dożylnych. Typowo szybkość przepływu jest ustawiona na 1 ml/min.
Ssanie w pipecie rejestrującej jest kontrolowane w następujący sposób: boczny otwór uchwytu pipety jest połączony z linią olejową, która z kolei jest podłączona do zbiornika olejowego o regulowanej wysokości. Podnoszenie lub opuszczanie zbiornika zapewnia, aby ciśnienie w pipecie, a tym samym przepływ płynu Ringera przez końcówkę pipety, był minimalny i lekko dodatni. Dodatkowe ssanie lub ciśnienie można przyłożyć za pomocą rurki podłączonej do przestrzeni powietrznej zbiornika z ustnikiem na drugim końcu, aby wciągnąć ciało komórkowe wyizolowanego ORN do końcówki pipety rejestrującej.
Doświadczenia przeprowadzane są w temperaturze 37 °C, aby dokładnie symulować naturalne warunki fizjologiczne komórki. Temperaturę kontroluje się poprzez przepuszczanie roztworów przez specjalnie wykonaną jednostkę grzejną, składającą się z rezystorów ceramicznych, przez które przechodzą stalowe rurki zawierające roztwory10. Temperaturę monitoruje się za pomocą termometru z termoparą (Fluke).
2. Roztwory
Roztwór Ringera dla ssaków (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 Glucose. pH skorygowano do 7,5 za pomocą NaOH. Do pomiaru prądu złączeniowego wykorzystano 10% rozcieńczony roztwór Ringera. Roztwory substancji zapachowych: Acetofenon i eugenol przygotowywano codziennie w roztworze Ringera z zapasów 20 mM DMSO.
3. Wykonywanie elektrod
- Umieść niefilamentowaną kapilarę borokrzemianową w wyciągarze do mikropipet Sutter P-97 i wyciągnij mikropipetę o długim zwężeniu.
- Przenieś pipetę do wykonanego na zamówienie uchwytu na mikropipety zamontowanego na mikroskopie Nikon E200 Eclipse, który jest wyposażony w siatkę pomiarową w okularze oraz ruchomy nóż diamentowy zamontowany na stoliku.
- Obserwując końcówkę pipety pod obiektywem 20x i korzystając z siatki pomiarowej jako prowadnicy, delikatnie nacinaj pipetę pod kątem 90° za pomocą wykonanego na zamówienie noża diamentowego w miejscu, gdzie szerokość (średnica zewnętrzna) pipety wynosi 10 μm.
- Przesuń nóż diamentowy dalej w stronę końcówki i stopniowo wywieraj nacisk na końcówkę nożem diamentowym. Końcówka pipety powinna czysto pęknąć w miejscu nacięcia.
Alternatywnie kroki od 3.1 do 3.4 można połączyć i wyciągnąć pipety o pożądanych wymiarach bezpośrednio, bez konieczności odcinania końcówki pipety, choć może to okazać się trudniejsze w przypadku niezawodnego wyciągania pipet o tak dużej średnicy końcówki i czysto odciętych krawędziach.
- Pod obiektywem 40x wypoleruj końcówkę pipety za pomocą elektrycznie podgrzewanego włókna, aż do uzyskania średnicy wewnętrznej 5 μm. Po zakończeniu mikropipeta jest gotowa do rejestracji prądów z neuronów węchowych (ORN) myszy. Oporność otwartej pipety wypełnionej roztworem Ringera powinna wynosić około 1 MΩ.
4. Izolacja neuronów receptorowych węchu
- Uśmierć mysz zgodnie z wytycznymi i regulacjami instytucjonalnymi. Odetnij głowę, zdejmij skórę pokrywającą czaszkę i przetnij głowę wzdłuż linii środkowej na dwie połowy.
- Umieść obie połowy głowy pod stereomikroskopem sekcyjnym, usuń przegrodę nosową oraz turbinaty węchowe. Wszystkie tkanki umieść w szalce Petriego z roztworem Ringera dla ssaków zawierającym glukozę.
- Oddziel nabłonek węchowy od leżącej pod nim chrząstki w dwóch turbinatach i przenieś tkankę do probówki Eppendorfa zawierającej 250 μl roztworu Ringera. Używamy tkanki z 2 turbinatów, aby uzyskać odpowiednią gęstość komórek dla rozmiaru naszej komory rejestracyjnej. Pozostałą tkankę przechowuj w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
- Dwie razy krótko wymieszaj probówkę Eppendorfa z nabłonkiem węchowym w wirówce typu vortex przez 1 s przy średniej prędkości. Krok ten prowadzi do mechanicznej dysocjacji ORN z nabłonka.
- Przenieś roztwór Ringera z dysocjowanymi ORN do komory rejestracyjnej. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń duże fragmenty tkanki obecne w zawiesinie.
- Pozostaw ORN do osadzenia na 20 min przed rozpoczęciem ciągłej superfuzyjności roztworem Ringera, a następnie przystąp do rejestracji.
5. Rejestracja
- Obniż elektrodę ssącą podłączoną do linii olejowej do komory rejestracyjnej i wyreguluj wysokość zbiornika z olejem, aby wytworzyć lekko dodatnie ciśnienie na końcówce pipety. Można to zrobić, obserwując np. przemieszczanie się szczątków komórkowych od (ciśnienie dodatnie) lub w stronę (ciśnienie ujemne) pipety. Staraj się nie zanieczyszczać końcówki pipety szczątkami komórkowymi.
- Przeskanuj komorę rejestracyjną w poszukiwaniu izolowanego ORN, który można rozpoznać po typowej morfologii bipolarnej, używając powiększenia 20-40x. Przesuń elektrodę rejestracyjną w bezpośrednie sąsiedztwo ciała komórki ORN. Delikatnie rozpocznij ssanie tak, aby ciało komórki weszło do końcówki pipety. Ostrożnie i powoli kontynuuj ssanie, aż całe ciało komórki zostanie wciągnięte do końcówki pipety ssącej, pozostawiając dendryt i rzęski wystawione na działanie roztworu w kąpieli. Obrazy zassanych ORN oraz kształty pipet przedstawiono w publikacjach7,11. Upewnij się, że po zaprzestaniu ssania ORN nie przesuwa się w głąb pipety ani z niej nie wysuwa. W przeciwnym razie odpowiednio dostosuj wysokość zbiornika z olejem.
- Za pomocą mikromanipulatorów przesuń pipetę ssącą z sekcji zawierającej osiadłe ORN do sekcji rejestracyjnej komory. Ostrożnie umieść pipetę ssącą przed 3-kanałową rurką do wymiany roztworów. Pipeta ssąca powinna być umieszczona wystarczająco blisko otworu 3-kanałowej rurki, aby ORN był wystawiony na przepływ laminarny, co pozwoli uniknąć turbulencji mieszania i zapewni szybką wymianę roztworów. Wymiana roztworów odbywa się poprzez przesuwanie granicy między równoległymi strumieniami płynącego roztworu przez końcówkę pipety ssącej. Czas trwania wymiany roztworu wynosi zazwyczaj około 20 ms, mierząc od prądu złącza wywołanego przejściem komórki między roztworami o różnym składzie jonowym (patrz Rys. 2). Roztwory są podawane grawitacyjnie.
6. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. A) Bipolarne neurony receptorowe w opuszce węchowej. B) Aparat transdukcji sygnału w rzęskach prowadzi w ostateczności do napływu prądu pobudzającego. Następująca po tym depolaryzacja wyzwala generowanie potencjału czynnościowego w ciele komórki.
Rycina 2 przedstawia szybkość i niezawodność wymiany roztworów. Pipetę przełączono z roztworu normalnego na 10 % rozcieńczony roztwór Ringera na 100 ms i zarejestrowano prąd złącza wynikający z różnicy stężeń jonów. Czarna linia to średnia z 5 prób, czerwona linia to ich SD. Niewielka zmiana SD podczas wymiany roztworów świadczy o powtarzalności wymiany między próbami oraz braku nadmiernego szumu w obu strumieniach roztworów.
Rysunek 3 przedstawia odpowiedź indukowaną eugenolem w neuronie receptorowym węchowym (ORN) z wykorzystaniem techniki pipety ssącej. ORN wystawiono na działanie 100 μM eugenolu przez 1 sekundę, co zaznaczono paskiem nad zapisem. Na Rys. 3A (ślad czarny) prąd receptorowy przefiltrowano w pasmie 0 - 50 Hz, aby wyświetlić wyłącznie prąd receptorowy. Rys. 3B pokazuje ten sam zapis, przefiltrowany w szerokim pasmie 0 - 5000 Hz (ślad czerwony), aby wyświetlić również potencjały czynnościowe (APs, wskazane strzałkami). Wstawka przedstawia ten sam ślad w powiększonej skali czasowej, aby wyraźniej zobrazować APs w momencie rozpoczęcia odpowiedzi.
Rycina 4. Rodzina odpowiedzi dawka-reakcja dla ORN reagującego na eugenol (A). Eugenol stosowano w stężeniach od 0,3 μM do 100 μM, czas trwania bodźca wynosił 1 s, a sygnały filtrowano w zakresie 0 - 50 Hz. Stopniowe zwiększanie stężenia substancji zapachowej prowadziło do silniejszej i szybszej odpowiedzi, która również wolniej wygasała po zakończeniu ekspozycji na odorant.
ORN mogą wykazywać oscylacyjny wzorzec odpowiedzi podczas długotrwałych stymulacji przy pośrednich stężeniach substancji zapachowej (Ryc. 4B). Tutaj ORN reagujący na acetofenon (3 μM) był stymulowany przez 8 sekund. Po szybkim i przejściowym szczycie odpowiedzi na początku stymulacji obserwuje się serię mniejszych, powracających odpowiedzi. Pasmo przenoszenia rejestracji wynosiło 0 - 50 Hz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Technika pipety ssącej jest metodą elektrofizjologiczną wykorzystywaną do jednoczesnej rejestracji indukowanego zapachem powolnego prądu receptorowego oraz szybkich dwufazowych potencjałów czynnościowych z ORN. Ponieważ błona plazmatyczna komórki nie zostaje przerwana, metoda ta pozostawia środowisko wewnątrzkomórkowe niezakłócone, co gwarantuje, że odpowiedzi na odoranty nie ulegną zmianie w wyniku zmian stężeń jonów w cytoplazmie lub rozcieńczenia czynników wewnątrzkomórkowych. Rejestracja z komórek może być prowadzon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty NIH DC009613, Human Frontiers Science Program oraz stypendium Morley Care Fellowship (dla JR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Stół pneumatyczny | sprzęt | Newport Corp. | ||
| Pompa powietrzna | sprzęt | Newport Corp. | ACGP | |
| Wytciągacz pipet | sprzęt | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Szkło borokrzemowe | sprzęt | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Odwrócony mikroskop Nikon Eclipse | sprzęt | Nikon Instruments | TE2000U | Wyposażony w lampę Hg, filtr GFP oraz obiektywy co najmniej 20X i 5X |
| Wzmacniacz PC-501A | sprzęt | Warner Instruments | 64-0008 | Przedwzmacniacz (headstage) 1 GΩ |
| Nóż diamentowy | Sprzęt | Custom Made | ||
| Digitalizator Mikro1401 A/D | sprzęt | Cambridge Electronic Design | ||
| Jednostka filtracyjna 3382 | sprzęt | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | oprogramowanie | Cambridge Electronic Design | ||
| Formowany pelet Ag/AgCl | sprzęt | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Uchwyt do pipet | sprzęt | Warner Instruments | 64-0997 | Zmodyfikowany specjalnie, aby pasował do przedwzmacniacza (headstage) |
| Komora rejestracyjna | Sprzęt | Custom Made | ||
| Mikromanipulator MP85-1028 | sprzęt | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Olej mineralny | roztwór | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscyloskop TDS 1001 | sprzęt | Tektronix, Inc. | ||
| Trzykanałowa kwadratowa rurka szklana | Sprzęt | Warner Instruments | 64-0119 | ID 0,6 mm, długość 5 cm |
| Zawór | sprzęt | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | sprzęt | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Szybki krok perfuzyjny | sprzęt | Warner Instruments |
Bibliografia
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681(2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13(1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
