Niniejszy artykuł przedstawia technikę pobierania krwi z aorty grzbietowej Danio pręgowanego. Zawiera on również instrukcje pozyskiwania surowicy do zastosowania w analizach biochemicznych, takich jak testy określające poziom cholesterolu i tryglicerydów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie krwi do analizy biochemicznej u dorosłych danio-ostroskrzelnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zebrafish (danio pręgowany) jest wykorzystywany jako model zwierzęcy w badaniach nad wieloma chorobami ludzi. Może on służyć jako potężna platforma przedkliniczna do badania zdarzeń molekularnych i strategii terapeutycznych, a także do oceny mechanizmów fizjologicznych niektórych patologii1.
Istnieje stosunkowo niewiele publikacji dotyczących fizjologii organów i układów dorosłego danio pręgowanego2, co może prowadzić badaczy do wniosku, że brakuje podstawowych technik umożliwiających badanie układów tych ryb3. Wartości biochemiczne hematologiczne danio pręgowanego zostały po raz pierwszy opisane w 2003 roku przez Murthę i współpracowników4, którzy zastosowali technikę pobierania krwi opisaną wcześniej przez Jagadeeswarana i współpracowników w 1999 roku. W skrócie, krew pobierano za pomocą końcówki mikropipety poprzez nacięcie boczne o długości około 0,3 cm w okolicy aorty grzbietowej5. Ze względu na minimalne wymiary, jest to technika wysokoprecyzyjna, wymagająca wysokich umiejętności operatora. Ta sama technika została zastosowana przez tę samą grupę w kolejnej publikacji w tym samym roku6. W 2010 roku Eames i współpracownicy oceniali poziom glukozy w krwi pełnej danio pręgowanego7. Uzyskali dostęp do krwi poprzez odcięcie głowy nożyczkami, a następnie wprowadzenie heparynowej mikrokapilary do pobierania krwi do stawu barkowego. Wspomnieli o trudnościach z hemolizą, które rozwiązano poprzez zastosowanie odpowiedniej temperatury przechowywania w oparciu o prace Kilpatricka i wsp.8. Próbując zastosować technikę Jagadeeswarana w naszym laboratorium, stwierdziliśmy, że trudno jest wykonać nacięcie dokładnie w odpowiednim miejscu, aby uniknąć znacznej utraty krwi przed rozpoczęciem pobierania.
Niedawno Gupta i wsp.9 opisali sposób preparowania organów dorosłych rybek danio-ostrobramy, Kinkle i wsp.10 opisali metodę wykonywania wstrzyknięć doprzewnowych, a Pugach i wsp.11 opisali sposób wykonywania wstrzyknięć okołopodbitowych. Niemniej jednak konieczne są dalsze prace w celu pełniejszego zgłębienia podstawowych technik badawczych z wykorzystaniem rybek danio-ostrobramy.
Niewielki rozmiar danio przebrzuchłego stanowi wyzwanie dla badaczy wykorzystujących ten gatunek jako model eksperymentalny. Ponadto, ze względu na tę małą skalę, istotne jest opracowanie prostych technik, które umożliwią naukowcom wykorzystanie zalet modelu danio przebrzuchłego.
Protokół
1. Tekst protokołu
- Przed pobraniem krwi z danio pręgowanego należy przygotować wodę do znieczulenia. Nalać ~200 ml wody akwariowej do naczynia o pojemności 500 ml. Dodać ~200 g kruszonego lodu. Temperatura powinna wynosić około 4 °C. W miarę topnienia lodu konieczne będzie dodawanie kolejnych porcji kruszonego lodu, aby utrzymać stałą temperaturę w okolicy 4 °C.
- Po przygotowaniu wody do znieczulenia należy przygotować materiały niezbędne do pobrania krwi. Na pipetkę P20 założyć końcówkę low-retention i odłożyć pipetkę w łatwo dostępnym miejscu. Nie dopuszczać do kontaktu końcówki pipety z żadnym źródłem zanieczyszczeń.
- Przykryć płytkę Petriego kawałkiem suchej gazy. Stalowe ostrze oraz kolejny kawałek gazy należy umieścić w łatwo dostępnym miejscu.
- Konieczna będzie wirówka przystosowana do probówek plastikowych.
- Po przygotowaniu wyżej wymienionych materiałów, pierwszą rybę do znieczulenia należy wyłowić siatką i przenieść do przygotowanej wody do znieczulenia. Zależnie od osobnika, danio pręgowane wymagają od 3-6 s w schłodzonej wodzie, aby zostać znieczulonymi. Trzymać rybę w zimnej wodzie do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne.
- Za pomocą siatki umieścić znieczuloną rybę na przygotowanym kawałku gazy, pozostawiając ogon poza gazą. Złożyć gazę tak, aby przykryła głowę i ciało ryby, pozostawiając odsłonięty jedynie ogon. Rybę owiniętą w gazę położyć na płytce Petriego.
- Za pomocą stalowego ostrza wykonać ukośne nacięcie dokładnie pomiędzy płetwą odbytową a płetwą ogonową. Krew zacznie wypływać. Na tym etapie konieczne jest szybkie działanie.
- Delikatnie odessać wypływającą krew pipetką P20 (z wcześniej założoną końcówką low-retention). Ilość krwi, którą można zebrać, zależy od wielkości ryby oraz stopnia prawidłowości znieczulenia. Zazwyczaj wynosi ona od 5 do 20 μl. Gdy krew przestanie wypływać, delikatnie przenieść odessaną krew do probówki.
- Aby uniknąć hemolizy, krytyczne jest, aby probówką z krwią posługiwać się bardzo ostrożnie, bez gwałtownych ruchów, aż do momentu umieszczenia jej w wirówce.
- Aby uniknąć hemolizy, ważne jest również, aby próbkę krwi umieścić w wirówce w ciągu 10 minut od momentu pobrania.
- W razie potrzeby można połączyć krew z więcej niż jednego zwierzęcia, tworząc tzw. pool. Próbki połączone będą odpowiednie pod warunkiem, że czas między pobraniem krwi z pierwszej ryby a wirowaniem nie przekroczy 10 minut.
- Po zakończeniu pobierania krwi, wirować krew przez 10 minut przy 0.5 g (wirówka Eppendorf 5415D).
- Po wirowaniu surowica znajduje się w górnej warstwie probówki. Za pomocą pipety odessać surowicę, upewniając się, że pobierana jest tylko surowica, przy jednoczesnym zachowaniu wyraźnego podziału i stabilności obu warstw.
- Przenieść surowicę do nowej mikroprobówki; jest ona teraz gotowa do wykorzystania w analizach biochemicznych. Surowicę można przechowywać na lodzie do czasu rozpoczęcia analiz biochemicznych.
- Jeśli surowica nie zostanie wykorzystana natychmiast, można ją zamrozić w temperaturze -18 °C na okres do około 3 miesięcy.
2. Reprezentatywne wyniki
Możliwe było pobranie od 5 do 20 μl krwi pełnej od każdej ryby, co stanowi nawet 4-krotnie więcej krwi niż w technikach opisanych wcześniej (Tabela 2). Po pobraniu krwi tą metodą przeprowadzono analizę biochemiczną cholesterolu całkowitego, cholesterolu HDL, cholesterolu LDL oraz tryglicerydów. Dwie grupy ryb obu płci były głodzone przez 24 godziny przed pobraniem krwi, aby uniknąć wpływu przyjęcia pokarmu. Analizy wykonano za pomocą małoscale'owych testów kolorymetrycznych (Labtest Diagnóstica S.A., Brazylia). Do analizy cholesterolu całkowitego i tryglicerydów wykorzystano 3 μl surowicy. Do analizy cholesterolu LDL i cholesterolu HDL wykorzystano odpowiednio 4 μl i 10 μl surowicy. Analizy te przeprowadzono na próbkach połączonych z 10 osobników zebrafish na jedną próbkę.
Porównano poziomy lipidów w surowicy krwi ryb, które miały dostęp do własnych ikry, oraz ryb, które w akwarium z zakrytym dnem nie miały dostępu do własnej ikry przez 2 tygodnie trwania eksperymentu. Analiza surowicy wykazała, że poziomy całkowitego cholesterolu (z ikrą 362 ± 42 mg/dL i bez ikry 357 ± 13 mg/dL), cholesterolu HDL (z ikrą 91,22 ± 1,79 mg/dL i bez ikry 72,14 ± 2,89 mg/dL) oraz cholesterolu LDL (z ikrą 55,68 ± 10,88 mg/dL i bez ikry 44,18 ± 9,84 mg/dL) nie różniły się istotnie między grupami. Jednakże poziomy triglicerydów były istotnie niższe w grupie eksperymentalnej (bez ikry 292 ± 64 mg/dL) niż w grupie kontrolnej (z ikrą 457 ± 25 mg/dL; P = 0,03).
| Z dostępem do jaj | Bez dostępu do jaj | |
| Cholesterol całkowity (mg/dL) | 362.82 ± 73.11 | 357.69 ± 23.08 |
| LDL – cholesterol (mg/dL) | 55.69 ± 18.84 | 44.19 ± 17.05 |
| HDL – cholesterol (mg/dL) | 91.23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| Triglicerydy (mg/dL) | 457.64 ± 43.78* | 292.36 ± 111.28 |
Tabela 1. Poziomy cholesterolu i trójglicerydów w surowicy dla obu badanych grup (z dostępem do jaj i bez dostępu do jaj) przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe.
*Statystycznie istotne (P=0,03). Student t test.
| Autorzy | Miejsce nacięcia | Metoda pobierania | Znieczulenie | Ilość pobranej krwi |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | Mikrodissekcja za płetwą grzbietową | Mikropipeta | Nie określono
MS222 3% w zimnej wodzie | 1 a 5 μl
5 a 10 μl |
| Eames et al., 2010 | Dekapitacja | Mikrokapilary | MS222 0,02% woda 28 °C | 5 a 10 μl |
| Niniejsze badanie | Nacięcie między płetwą odbytniczą a płetwą ogonową | Mikropipeta i końcówki o niskiej retencji | Woda i kruszona lodowa | 5 a 20 μl |
Tabela 2. Porównanie wcześniej opisanych technik pobierania krwi z techniką opisaną w niniejszym badaniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsza praca przedstawia prostą technikę umożliwiającą dalszą analizę krwi i surowicy w eksperymentach na rybach zebrafish. Technika ta ma potencjał, aby przyczynić się do przyszłych badań hematologicznych zebrafish wymagających danych dotyczących parametrów krwi. Powinna ona również umożliwić szersze zastosowanie zebrafish jako modelu eksperymentalnego.
Technika ta nie wymaga specjalistycznych umiejętności ani wdrożenia precyzyjnej metody. Ponadto umożliwia ona pobranie nawet dwukrotnie wi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
FIPE/HCPA - Fundusz Wspierania Badań i Wydarzeń
CAPES - Koordynacja Doskonalenia Personelu na Poziomie Wyższym
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Napiski o niskiej retencji | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Wirówka Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Wycofany z produkcji |
Bibliografia
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol. Dis. 25, 239-249 (1999).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717(2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
