Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)

25.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3875

⸱

18 czerwca 2012

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida Morsani College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Jest to szybka i kompleksowa metoda immunofenotypowania mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) oraz wzbogacania populacji leukocytów Gr-1+ z śledziony mysiej. Metoda ta wykorzystuje cytometrię przepływową oraz sortowanie komórek AutoMACS w celu wyizolowania żywych leukocytów Gr-1+ przed sortowaniem MDSC metodą FACS do późniejszych analiz in vivo oraz in vitro.

Streszczenie

MDSC stanowią heterogenną populację niedojrzałych makrofagów, komórek dendrytycznych i granulocytów, które gromadzą się w narządach limfatycznych w stanach patologicznych, takich jak zakażenia pasożytnicze, stany zapalne, stres urazowy, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi, cukrzyca i nowotwory1-7. U myszy MDSC wykazują ekspresję antygenów powierzchniowych Mac-1 (CD11b) oraz Gr-1 (Ly6G i Ly6C)7. Należy zauważyć, że MDSC są dobrze przebadane u różnych gospodarzy z nowotworami, u których ulegają one znacznej ekspansji i tłumią przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne w porównaniu z osobnikami naiwnymi7-10. Jednak w zależności od stanu patologicznego występują różne subpopulacje MDSC o odmiennych mechanizmach i celach supresji11,12. Dlatego skuteczne metody izolacji żywotnych populacji MDSC są istotne dla wyjaśnienia ich różnorodnych molekularnych mechanizmów supresji in vitro oraz in vivo.

Niedawno grupa Ghansaha zgłosiła ekspansję MDSC w mysim modelu raka trzustki. MDSC pobrane od myszy z nowotworem wykazują utratę homeostazy i zwiększoną funkcję supresyjną w porównaniu z naiwnymi MDSC 13. Procentowy udział MDSC jest znacznie mniejszy w przedziałach limfatycznych myszy naiwnych w porównaniu z myszami z nowotworem. Stanowi to istotne ograniczenie, które często utrudnia dokładne analizy porównawcze tych MDSC. Dlatego wzbogacenie leukocytów Gr-1+ z myszy naiwnych przed fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS) zwiększa czystość, żywotność i znacznie skraca czas sortowania. Jednak wzbogacenie leukocytów Gr-1+ z myszy z nowotworem jest opcjonalne, ponieważ występują one w obfitości, co pozwala na szybki sorting FACS. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy wysoce wydajną metodę immunofenotypowania MDSC oraz wzbogacania leukocytów Gr-1+ ze śledzion myszy naiwnych w celu sprawnego sortowania MDSC. Immunokompetentne myszy C57BL/6 są poddawane podskórnej inokulacji mysimi komórkami Panc02, natomiast myszy naiwne otrzymują 1X PBS. Około 30 dni po inokulacji śledziony są pobierane i przetwarzane na zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu sita do dysocjacji komórek. Następnie przeprowadzana jest liza erytrocytów (RBC) splenocytów, a aliczkwota tych leukocytów jest barwiona przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami przeciwko Mac-1 i Gr-1 w celu immunofenotypowania procentowego udziału MDSC za pomocą cytometrii przepływowej. W równoległym eksperymencie całe leukocyty z myszy naiwnych są barwione przeciwciałami Gr-1 sprzężonymi z fluorescencją, inkubowane z PE-MicroBeads i selekcjonowane pozytywnie przy użyciu automatycznego separatora do magnetycznego sortowania komórek (autoMACS) Pro Separator. Następnie aliczkwota leukocytów Gr-1+ jest barwiona przeciwciałami Mac-1 w celu zidentyfikowania wzrostu procentowego udziału MDSC za pomocą cytometrii przepływowej. Tak przygotowane leukocyty wzbogacone o Gr-1+ są gotowe do sortowania FACS dla MDSC, które zostaną wykorzystane w analizach porównawczych (naiwne vs. z nowotworem) w badaniach in vivo oraz in vitro.

Protokół

Przed rozpoczęciem przygotuj następujące roztwory:

3% pożywka do barwienia (SM):

3% płodowa surowica bydlęca (FBS) w 1X soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS)

Bufor MACS (MB):

- 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1XPBS

1. Pobranie śledzion z myszy

  1. Myszy C57BL/6 (Harlan) w wieku 6-8 tygodni poddać podskórnej iniekcji 1,5 x 105 mysich komórek Panc02 zawieszonych w 100 μl 1x PBS (grupa z nowotworem; TB). Myszy kontrolne (Naïve) otrzymują 100 μl 1XPBS.
  2. Około 4 tygodnie po iniekcji uśmiercić myszy poprzez duszenie dwutlenkiem węgla.
  3. Pobrać śledziony z myszy poprzez rozcięcie tępą metodą z użyciem pęsety i nożyczek, a następnie zważyć je na wadze. Umieścić śledziony w osobnych, oznakowanych stożkowych probówkach 50 ml zawierających 1 x PBS.

2. Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny leukocytów ze śledzion

Wszystkie procedury należy przeprowadzać w środowisku sterylnym, pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza (Biological Safety Hood), a komórki i przeciwciała przechowywać w lodzie.

  1. Złożyć sito do dysocjacji komórek, wkładając siatkę do otworu w kubku w kierunku dna. Następnie włożyć pierścień mocujący do obszaru z gwintem stroną z nacięciem do góry i za pomocą klucza do pierścienia dokręcić pierścień mocujący, aby unieruchomić siatkę. Umieścić złożone sito w szalce Petri zawierającej 10 ml 1 x PBS.
  2. Połączyć śledziony i za pomocą szklanego tłuczka rozetrzeć je o siatkę sita do dysocjacji komórek bezpośrednio do szalki Petri. Powtórzyć czynność dla każdej grupy myszy poddanych badaniu.
  3. Przefiltrować zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, używając sita komórkowego 70 μm oraz pipety serologicznej 5 ml. Centryfugować przy 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.
  4. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 5 ml 1 x buforu do lizy RBC na każdą śledzionę. Intensywnie pipetować w górę i w dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Przerwać reakcję, dodając 20 ml 1 x PBS. Intensywnie pipetować w górę i w dół. Centryfugować przy 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.
  5. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 20 ml sterylnego 1 x PBS. Intensywnie pipetować w górę i w dół.
  6. Policzyć komórki przy użyciu błękitu trypanu i hemocytometru, a następnie resuspendować do pożądanego stężenia w 3% SM tak, aby 50 μl odpowiadało 5x105-1x106 komórkom (1x107 cells/ml - 2x107 cells/ml).

3. Barwienie powierzchni komórek / immunofenotypowanie MDSC z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

  1. Oznakuj dołki płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dla próbek kontrolnych i doświadczalnych oraz dla pojedynczych barwień do kontroli kompensacji (brak barwienia, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC oraz DAPI).
  2. Do odpowiednich dołków w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dodaj od 5x105 do 1x106 komórek splenocytów, co odpowiada 50 μl/dołek. Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.
  3. W probówce mikrocentryfużowej 1,5 ml na lodzie przygotuj „Master Mix” (MM) z Mouse BD Fc Block (monoklonalne przeciwciało szczura przeciw mysiemu CD16/32) rozcieńczonego w 3% SM. Jako punkt wyjścia zastosuj 1 μg Fc Block w 3% SM do uzyskania objętości końcowej 50 μl na dołek.
  4. Ostrożnie usuń nadsącz z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V, szybko odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady lub zlewem, tak aby nie naruszyć osadów komórkowych.
  5. Wymieszaj na wirówce Vortex, krótko wiruj Fc Block MM przez 5 sekund i dodaj 50 μl do wszystkich osadów w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół, pozostawiając próbki w dołkach. Inkubuj płytkę przez 15 min w ciemności na lodzie. Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.
  6. Podczas inkubacji próbek z Fc Block, przygotuj w probówce mikrocentryfużowej 1,5 ml na lodzie „Master Mix” (MM) z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami rozcieńczonymi w 3% SM. Przeciwciała powinny zostać tytrowane w celu ustalenia optymalnych rozcieńczeń do procedur barwienia. Jako punkt wyjścia połącz rozcieńczenie 1:25 Mac-1-FITC oraz rozcieńczenie 1:20 Gr-1-APC w 3% SM do uzyskania objętości końcowej 50 μl na dołek z próbką.
  7. Ostrożnie usuń nadsącz z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V w sposób opisany wcześniej.
  8. Wymieszaj na wirówce Vortex, krótko wiruj MM przeciwciał barwiących sprzężonych z fluorochromami przez 5 sekund i dodaj 50 μl do osadów kontrolnych i doświadczalnych. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół. Dla kompensacji pojedynczych barwień do odpowiednich dołków dodaj rozcieńczenie 1:25 Mac-1-FITC, rozcieńczenie 1:20 Gr-1-APC oraz 75 ng/ml DAPI w 3% SM do uzyskania objętości końcowej 50 μl na dołek. Do dołka niebarwionego (No Stain) dodaj 50 μl 3% SM. Wymieszaj dokładnie i inkubuj komórki w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V przez 30 min w ciemności na lodzie.
  9. Oznakuj probówki do FACS (5 ml, 12 mm x 75 mm, polistyrenowe z dnem okrągłym) zgodnie z każdym dołkiem w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Do każdej probówki FACS dodaj 200 μl 3% SM.
  10. Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min i usuń nadsącz. Przemyj osady, dodając 100 μl 3% SM do każdego osadu i mieszając dokładnie przez delikatne pipetowanie w górę i w dół. Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min. Powtórz etap płukania jeszcze raz.
  11. Ostrożnie usuń nadsącz z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V w sposób opisany wcześniej. Resuspenduj każdy osad w 100 μl 3% SM i wymieszaj dokładnie.
  12. Przenieś 100 μl resuspendowanego osadu z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V do odpowiednio oznakowanej probówki FACS.
  13. Przed analizą cytometryczną dodaj 75 ng/ml DAPI do próbek kontrolnych i doświadczalnych oraz do kontroli kompensacji dla pojedynczego barwienia DAPI.
  14. Przeprowadź akwizycję danych cytometrycznych dla procentowej zawartości MDSC. Wykonaj kompensację, korzystając z kontroli negatywnej (kontrola bez barwienia) oraz kontroli pojedynczo dodatnich. Ustaw wykres kropkowy (dot plot) wyświetlający rozproszenie przednie (FSC) względem bocznego (SSC) w skali logarytmicznej, aby można było zidentyfikować interesujące populacje leukocytów. Wyznacz szeroki bramkę (gate) na wszystkie leukocyty, wykluczając debris i agregaty o najniższym rozproszeniu przednim i bocznym. Z tej bramki nadrzędnej utwórz nowy wykres kropkowy wyświetlający SSC względem DAPI i wyznacz bramkę dla komórek DAPI- (żywych). Wybierz tę nowo wyznaczoną populację i utwórz wykres kropkowy wyświetlający Mac-1 względem Gr-1, a następnie wyznacz bramkę dla podwójnie dodatnich (Mac-1+ Gr-1+) MDSC.

4. Magnetyczne wzbogacanie leukocytów Gr-1+

  1. Rozdziel pozostałe niebarwione leukocyty w ilości 1x107 do odpowiednio oznakowanych probówek FACS i wiruj przy 12 000 obr./min (250-300 x g) przez 5 min.
  2. Przygotuj MM przeciwciała Gr-1-PE w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dla liczby komórek do 107 zastosuj rozcieńczenie przeciwciała Gr-1-PE 1:10 w 50 μl MB na próbkę. W przypadku większej liczby komórek zwiększ objętości proporcjonalnie. Krótko wiruj przez 5 sekund, dodaj do leukocytów w probówkach FACS i inkubuj przez 15 min w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. Dodaj 2 ml MB do probówek FACS, wiruj przy 12 000 obr./min (250-300 x g) przez 5 min i odlej nadsącz.
  4. Przygotuj MM Anti-PE MicroBeads w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dla liczby komórek do 107 zastosuj rozcieńczenie anti-PE MicroBeads 1:4 w 200 μl MB na próbkę. W przypadku większej liczby komórek zwiększ objętości proporcjonalnie. Krótko wiruj przez 5 sekund, dodaj do leukocytów w probówkach FACS i inkubuj przez 15 min w temperaturze 4 °C w ciemności.
  5. Dodaj 2 ml MB do probówek FACS, wiruj przy 12 000 obr./min (250-300 x g) przez 5 min i odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 3 ml SB. Przefiltruj przez sito 70 μm do nowej, oznakowanej probówki stożkowej 50 ml.
  6. Przygotuj i zapraw urządzenie Auto MACS Pro Separator. Napełnij wszystkie butelki odpowiednimi roztworami i w razie potrzeby opróżnij butelkę na odpady. Włącz instrument i sprawdź stan pojemników z cieczami oraz kolumny po inicjalizacji. Wszystkie symbole powinny być zielone. W menu wybierz „Separation” z górnego paska menu, a następnie „Wash Now” z dolnego paska menu. Z opcji wyskakującego okienka wybierz „Rinse”, a następnie „Run”, aby rozpocząć proces zaprawiania. Po pomyślnym zakończeniu procesu zaprawiania instrument wyświetli komunikat „Ready for Separation” w menu Status.
  7. Wybierz odpowiedni chłodzony statyw na probówki dopasowany do ich rozmiarów i umieść probówkę stożkową 50 ml z magnetycznie znakowanymi komórkami w rzędzie A, probówkę stożkową 50 ml do zbierania frakcji negatywnej w rzędzie B oraz probówkę stożkową 15 ml do zbierania frakcji pozytywnej w rzędzie C.
  8. Wybierz program separacji komórek „POSSEL_S” dla pozytywnej selekcji znakowanych komórek docelowych w trybie czułym dla próbek. Magnetycznie znakowane komórki docelowe są zatrzymywane na kolumnie automatu; komórki nieznakowane są uwalniane do probówki zbierającej frakcję negatywną w rzędzie B. Po automatycznym cofnięciu magnesu znakowane komórki docelowe zostaną uwolnione do probówki zbierającej frakcję pozytywną w rzędzie C statywu.

5. Analiza leukocytów wzbogaconych w Gr-1+ po sortowaniu

  1. Ponownie policz frakcje Gr-1+ i Gr-1-, wykorzystując błękit trypanu oraz hemacytometr. Resuspenduj komórki do pożądanego stężenia w 3% medium barwiącym w taki sposób, aby 50 μl odpowiadało 5x105-1x106 komórkom (1x107 cells/ml - 2x107 cells/ml), a następnie przenieś 50 μl do odpowiednio oznakowanych probówek FACS.
  2. Przygotuj MM zawierający tylko Mac-1, w rozcieńczeniu 1:25 w 3% SM, aby uzyskać objętość końcową 50 μl na próbkę. Obarw komórki i przygotuj próbki do kompensacji pojedynczego barwienia dla Gr-PE, Mac-1 FITC oraz DAPI do analizy cytometrycznej. Dodaj 200 μl 3% SM oraz barwnik żywotności DAPI zgodnie z wcześniejszym opisem.
  3. Przeprowadź akwizycję danych w cytometrii przepływowej, aby określić procentowy udział frakcji Gr-1+ i Gr-1-, a także porównać procentowy udział MDSC przed i po wzbogaceniu metodą autoMACS.

6. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki wzbogacania leukocytów Gr-1+ z połączonych śledzion z osobników naiwnych przy użyciu systemu autoMACS w celu późniejszego sortowania MDSC metodą FACS (Rysunek 1). Przed sortowaniem autoMACS 1x106 naiwnych leukocytów barwiono przeciwciałami Mac-1-FITC oraz Gr-1-APC, aby określić procentowy udział MDSC za pomocą urządzenia BD LSRII. Następnie 1x107 naiwnych leukocytów barwiono przeciwciałami anty-Gr-1-PE oraz PE-MicroBeads w celu wzbogacenia frakcji leukocytów Gr-1+ przy użyciu separatora autoMACS Pro. Po wzbogaceniu metodą autoMACS oceniano procentowy udział Gr-1 w zebranych frakcjach Gr-1+ i Gr-1- za pomocą cytometrii przepływowej. Odizolowano 1x106 leukocytów Gr-1+ i barwiono je przeciwciałem Mac-1-FITC, aby za pomocą cytometrii przepływowej przeanalizować i porównać procentowy udział MDSC we wzbogaconych, połączonych leukocytach naiwnych z niewzbogaconymi, połączonymi leukocytami z osobników z nowotworem.

Analiza cytometrii przepływowej, ekspresja Gr-1 i Mac-1 w komórkach naiwnych i nowotworowych, wykresy konturowe.
Rycina 1. Wzbogacanie leukocytów Gr-1+ od myszy naiwnych za pomocą systemu AutoMACS w celu sortowania MDSC metodą FACS. Śledziony pobrano od myszy z nowotworem trzustki oraz myszy naiwnych, a następnie przygotowano z nich zawiesiny pojedynczych komórek. Analiza cytometrii przepływowej leukocytów naiwnych barwionych powierzchniowo przeciwciałami sprzężonymi z fluoresceincją przeciwko Mac-1 i Gr-1 przed wzbogaceniem systemem autoMACS (A). Analiza cytometrii przepływowej frakcji Gr-1+ (B) oraz Gr-1- (C) po wzbogaceniu komórek Gr-1+ systemem autoMACS z połączonych leukocytów naiwnych barwionych przeciwciałami Gr-1-PE i mikro kuleczkami anti-PE. Analiza cytometrii przepływowej procentowego udziału MDSC i Gr-1+ po wzbogaceniu komórek Gr-1+ systemem autoMACS z połączonych leukocytów naiwnych (D) w porównaniu do niewzbogaconych połączonych leukocytów od myszy z nowotworem (E) (myszy naiwne, n=5; myszy z nowotworem, n=3). Procentowy udział MDSC i Gr-1 wyznaczono na reprezentatywnych wykresach konturowych i histogramach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jest to szczegółowa metoda przetwarzania i immunofenotypowania populacji MDSC, która ma zastosowanie do różnych tkanek limfatycznych pochodzących z różnorodnych modeli zwierzęcych. W szczególności wzbogacanie autoMACS może być wykorzystane do izolacji różnych populacji leukocytów, w tym do usuwania Gr-1 ze splenocytów 4, oczyszczania podgrup mieloidalnych ze splenocytów i węzłów chłonnych 5, izolacji neutrofili z szpiku kostnego 14 oraz oczyszczania limfocytów T CD8+ ze śledzio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wyrażamy wdzięczność dla USF Flow Cytometry Core Facility. Dziękujemy dr Denise Cooper za udostępnienie zasobów. Dziękujemy również Mai Cohen, Laurze Pendleton i Dianie Latour za pomoc w przygotowaniu i nagraniu tego filmu. NN otrzymał wsparcie z funduszu NSF FG-LSAMP Bridge to the Doctorate Fellowship HRD #0929435. Praca ta została sfinansowana z grantu American Cancer Society Institutional Research Grant# 93-032-13/Moffitt Cancer Center przyznanego TG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X fosforanowy bufor solny (PBS)Thermo Scientific HycloneSH30028.02Bez Ca2+/Mg2+/bez czerwieni fenolowej
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7906Pozostawić BSA do całkowitego rozpuszczenia w PBS; środowisko sterylne
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Scientific HycloneSV3001403HIInaktywowana ciepłem; środowisko sterylne
Szczurze przeciwmysie monoklonalne przeciwciało anty-CD16/32 (Fc Block)BD Biosciences553142Środowisko sterylne
Przeciwciało anty-mysie CD11b (Mac-1) FITCeBioscience11-0112Środowisko sterylne
Przeciwciało anty-mysie Ly6G (Gr-1) APCeBioscience17-5931Środowisko sterylne
Przeciwciało anty-mysie Ly6G (Gr-1) PEeBioscience12-5931Środowisko sterylne
DAPIInvitrogenD1306Rozcieńczenie seryjne w środowisku sterylnym
Sito do dysocjacji komórekSigma-AldrichCD1-1KTAutoklawować przed użyciem
Sito 70-μmBD Biosciences352350Środowisko sterylne
1X bufor do lizy erytrocytów (RBC)eBioscience00-4333-57Przegrzać do temperatury pokojowej przed użyciem; środowisko sterylne
Szalki PetriegoFisher Scientific08-757-12Środowisko sterylne
Probówki stożkowe 50 mlThermo Fisher Scientific, Inc.339652Środowisko sterylne
Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem 5 ml 12X75 mmBD Biosciences352054Znane jako probówki FACS; środowisko sterylne
Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery VCorning3897Środowisko sterylne
Błękit TrypanuCellgro25-900-CIŚrodowisko sterylne
Mikrokulki PE (PE MicroBeads)Miltenyi Biotec130-048-801Środowisko sterylne
Separator AutoMACS ProMiltenyi Biotec130-092-545
Kolumny AutoMACSMiltenyi Biotec130-021-101
Bufor roboczy AutoMACSMiltenyi Biotec130-091-221

Bibliografia

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Separacja AutoMACSleukocyty Gr 1 dodatniebarwienie Mac 1 Gr 1zawiesina kom rek ledzionyliza czerwonych krwinekfluorescencyjna aktywacyjna segregacja kom rek
Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.