Opisano przydatne narzędzie do analizy wpływu leków, czynników wzrostu i/lub zmodyfikowanych komórek w modelu zwierzęcym gojenia ran. Technika ta wykorzystuje właściwości gąbki z alkoholu poliwinylowego (PVA) do dostarczania i utrzymywania pożądanego preparatu, a także stanowi platformę, którą można wyciąć i poddać analizie.
Artykuł metodologiczny
Implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Gojenie ran jest złożonym, wieloetapowym procesem angażującym wiele typów komórek, czynników wzrostu i związków chemicznych1-3. Ze względu na tę złożoność, badania nad gojeniem ran są najbardziej kompleksowe, gdy są prowadzone in vivo. Dostępnych jest wiele modeli in vivo do badania gojenia ran ostrych, w tym modele nacięć, wycięcia, martwej przestrzeni oraz oparzeń. Modele martwej przestrzeni to sztuczne, porowate implanty wykorzystywane do badania tworzenia tkanek oraz wpływu substancji na ranę. Do najczęściej stosowanych modeli martwej przestrzeni należą gąbki z alkoholu poliwinylowego (PVA), stalowe cylindry z siatki drucianej, materiał z rozszerzonego politetrafluoroetylenu (ePTFE) oraz Cellstick1,2.
Każdy model martwej przestrzeni ma swoje ograniczenia wynikające ze składu materiału oraz metod implantacji. Model z cylindra z stalowej siatki drucianej wykazuje fazę opóźnienia infiltracji po implantacji i wymaga długiego czasu przed rozpoczęciem formowania się tkanki ziarninowej1. Późniejsze etapy gojenia ran najlepiej analizować przy użyciu modelu ePTFE1,4. Cellstick to model z gąbki celulozowej wewnątrz rurki silikonowej, zazwyczaj stosowany do badania ran pooperacyjnych u ludzi oraz płynu z rany2. Zastosowanie gąbki PVA ogranicza się do badań ostrych, ponieważ z czasem zaczyna ona wywoływać reakcję na ciało obce, co prowadzi do reakcji komórek olbrzymich u zwierzęcia5. W przeciwieństwie do innych materiałów, gąbki PVA są łatwe do wprowadzenia i usunięcia, wykonane z materiałów obojętnych i niebiodegradowalnych, a jednocześnie na tyle miękkie, że można je pociąć do analizy histologicznej2,5.
W procesie gojenia ran gąbka z PVA jest bardzo użyteczna do analizy tworzenia się tkanki ziarnistej, odkładania kolagenu, składu wysięku z rany oraz wpływu substancji na proces gojenia1,2,5. Poza zastosowaniem w badaniu szerokiego spektrum cech gojenia ran, gąbka z PVA była wykorzystywana w wielu innych rodzajach badań. Stosowano ją do badania angiogenezy nowotworowej, dostarczania leków oraz przeżywalności i engraftmentu komórek macierzystych1,2,6,7. Dzięki swojej dużej modyfikowalności, wcześniejszemu szerokiemu zastosowaniu i powtarzalnym wynikom, gąbka z PVA stanowi idealny model dla wielu badań1,2.
W niniejszej pracy przedstawimy przygotowanie, implantację oraz odzysk i analizę dysków z gąbki PVA (Rysunek 1) w mysim modelu gojenia ran.
Protokół
1. Przygotowanie gąbki
- Nawilż gąbki, mieszając je przez noc w 0.9% (w/v) wodnym roztworze chlorku sodu.
- Sterylizuj nawilżone gąbki w autoklawie. W przypadku objętości 75 mL autoklawuj przez 25 minut w temperaturze 121 °C.
Uwaga: Nasączanie gąbek preparatem zgodnie z opisem poniżej jest opcjonalne.
- W sterylnej komorze z użyciem sterylnych narzędzi, wyjmij jedną gąbkę z roztworu za pomocą pęsety. Ściśnij gąbkę pęsetą i użyj końcówki do odsysania, aby usunąć z niej jak najwięcej roztworu. Umieść wyciśniętą gąbkę w naczyniu do hodowli tkankowej, dbając o zachowanie odstępów między gąbkami. Do rozdzielenia różnych grup badawczych można użyć wielodołkowych płytek.
- Pipetuj roztwór do badania bezpośrednio na środek gąbki. Po naniesieniu roztworu delikatnie dociśnij gąbkę końcówką pipety, co ułatwi jej wchłanianie płynu. Uwaga: stosowane przez nas gąbki o średnicy 6 mm i grubości 2,75 mm mogą pomieścić maksymalnie 25 μL.
- Po nasączeniu wszystkich gąbek, płytkę można przechowywać w lodzie do momentu ich implantacji u myszy.
2. Procedura chirurgiczna
- Odpowiednio znieczulić zwierzę i podać lek przeciwbólowy profilaktycznie. Cała procedura trwa około 20 minut na jedno zwierzę. W przypadku myszy o masie 30 g do indukcji i utrzymania znieczulenia stosuje się 1,5 litra tlenu na minutę z 1,5% izofluranem. Gdy zwierzę przestanie reagować na test odruchowy (uszczypnięcie), umieść je w pozycji grzbietnej w masce nosowej. Za pomocą maszynki elektrycznej ogolić obszar o wymiarach 1 cal na 1 cal w dolnej części brzucha, poniżej klatki piersiowej. Przetrzeć skórę, aby usunąć odcięte włosy.
- Zdezynfekować ogolony obszar, oczyszczając go betadyną, a następnie 70% alkoholem. Powtórzyć to oczyszczanie betadyną i alkoholem trzykrotnie.
- Naciągając skórę, wykonać skalpelem nacięcie pionowe o długości 1,5-2 razy większej od średnicy gąbek przeznaczonych do implantacji, uważając, aby nie przeciąć jamy ciała.
- Za pomocą pęsety przytrzymać krawędź skóry i powoli rozpocząć oddzielanie skóry od mięśni po obu stronach nacięcia, używając nożyczek Metzenbauma. Kieszeń powinna obejmować całą szerokość myszy, od klatki piersiowej aż do tylnych kończyn.
- Za pomocą pęsety chwycić pierwszą gąbkę do implantacji, ściskając ją z boków. Przenieść gąbkę na pęsetę prostą w taki sposób, aby była trzymana od góry i od dołu.
- Używając pęsety, unieść krawędź skóry, aby umożliwić wprowadzenie gąbki. Powoli wprowadzić gąbkę, starając się nie dotykać skóry ani znajdujących się pod nią mięśni, ponieważ gąbka będzie trudna do przesunięcia po zetknięciu z tkanką. Powtórzyć czynność dla wszystkich gąbek.
- Po wprowadzeniu wszystkich gąbek nałożyć dwa lub trzy szwy w celu zamknięcia nacięcia. Użyć pęsety, aby złączyć obie strony nacięcia, i przeciągnąć nić szwu przez obie warstwy skóry. Pierwszy splot zacisnąć tylko na tyle, aby zbliżyć brzegi skóry. Zakończyć węzeł kwadratowy kolejnym splotem z przeciwnej strony, tym razem mocno zaciągając węzeł. Następnie zawiązać dwa kolejne węzły kwadratowe, aby sfinalizować szew (Rycina 2). Nałożyć dodatkowe szwy, aby zamknąć całe nacięcie. Można zastosować inne metody zamykania rany, takie jak klej skórny (dermabond), klipsy chirurgiczne lub zszywki.
- Wyjąć zwierzę z systemu znieczulającego i monitorować je do czasu odzyskania przytomności. Zwierzę powinno szybko zacząć się poruszać i odzyskać sprawność sprzed operacji. Upewnić się, że zwierzę ma swobodny dostęp do pokarmu i wody. Na dnie klatki można umieścić nieco nawilżonego pokarmu, aby wspomóc rekonwalescencję. Kontynuować codzienne monitorowanie zwierzęcia pod kątem oznak stresu lub dyskomfortu oraz sprawdzać miejsce nacięcia pod kątem infekcji, stanu zapalnego i rozstępu rany. Podjąć odpowiednie działania w przypadku wystąpienia jakichkolwiek powikłań w procesie powrotu do zdrowia.
3. Opcjonalna iniekcja
Uwaga: Po zaimplantowaniu gąbek do organizmu zwierzęcia można wstrzyknąć do nich roztwór komórek, leków, czynników wzrostu itp. Pozwala to na analizę efektów wstrzykniętej substancji przy różnych czasach dostarczania i schematach podawania. W przypadku wykonywania iniekcji należy zawsze zastosować grupę kontrolną.
- Aby wstrzyknąć do gąbki pożądany roztwór, należy najpierw określić ilość substancji do podania myszy. Substancja musi być skoncentrowana w taki sposób, aby objętość iniekcji stanowiła mniej niż połowę całkowitej objętości, jaką może pomieścić gąbka.
- Przygotować strzykawkę do iniekcji (dla myszy stosuje się igłę 28 G).
- Zznieczulić zwierzę, któremu mają być wykonane iniekcje.
- Iniekcję można podać, gdy zwierzę przestanie reagować na test uszczypnięcia.
- Aby wykonać iniekcję, należy wprowadzić igłę pod kątem 45° przez skórę w centrum gąbki. Następnie należy wprowadzić igłę w gąbkę tylko do połowy jej grubości. Celem jest wykonanie wstrzyknięcia dokładnie w centrum gąbki.
- Aby upewnić się, że igła znajduje się w gąbce, należy powoli unieść igłę pionowo. Jeśli igła jest w gąbce, gąbka powinna unieść się wraz z nią.
- Powoli wstrzyknąć roztwór do gąbki i wyjąć igłę. W przypadku wielu gąbek wymagających iniekcji możliwe jest, że część wstrzykniętego płynu zostanie wypchnięta przez poprzednie miejsca wkłucia.
4. Usuwanie gąbki
Uwaga: Podczas usuwania gąbki należy obchodzić się z nią z nadzwyczajną ostrożnością. Należy unikać przebijania gąbki instrumentami chirurgicznymi oraz zapobiegać nadmiernemu krwawieniu do gąbki poprzez omijanie głównych tętnic w tkankach otaczających.
- Po eutanazji zwierzęcia należy usunąć gąbkę, odchylając skórę pęsetą i wykonując nacięcie w bezpośrednim sąsiedztwie gąbki.
- Należy ostrożnie oddzielić gąbki od otaczającej je torebki, unikając pobierania nadmiaru tkanki wokół gąbki. W przypadku analiz takich jak dostarczanie leków czy morfometria, wycięcie nie musi być tak precyzyjne.
5. Reprezentatywne wyniki
Usunięte gąbczaki można przechowywać w różnych warunkach, w zależności od rodzaju planowanej analizy. W celu wykonania skrawków, pobrane gąbczaki można zatopić w medium do mrożenia, takim jak związek Optimal Cutting Temperature (O.C.T.), lub umieścić w 10% formalinie w celu zatopienia i cięcia w blokach parafinowych (Rysunek 3A i B). Najlepsze wyniki przy przygotowywaniu skrawków uzyskuje się, gdy gąbczak zostanie przecięty na pół wzdłuż średnicy i zatopiony powierzchnią cięcia skierowaną w dół (Rysunek 4A i B). Skrawki gąbczaka należy pobierać w taki sposób, aby objęły one całą szerokość tkanki. Na Rysunku 3A przedstawiono dwa gąbczaki; gąbczak po lewej został zatopiony/pocięty nieprawidłowo, natomiast gąbczak po prawej został przetworzony prawidłowo.
Do analizy gąbki można umieścić w probówce Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia obróbki. Do analizy RNA oraz ilościowego PCR w czasie rzeczywistym gąbki należy umieścić w probówce Eppendorfa, zamrozić szokowo i przechowywać w temperaturze -80 °C. Dodatkowo, w celu stabilizacji RNA dla bezpiecznego przechowywania w wyższych temperaturach, można zastosować konserwant RNA, taki jak RNAlater firmy QIAGEN. Płyn z rany można zebrać poprzez wyciskanie gąbek nad probówką i łączenie płynów z wielu gąbek w celu uzyskania reprezentatywnej próbki. Z gąbek można również wyizolować żywe komórki, takie jak fibroblasty, makrofagi i limfocyty. Po wyjęciu z organizmu zwierzęcia gąbki można umieścić w odpowiednim medium dla pożądanego typu komórek. Gąbki można poddać obróbce w celu uwolnienia komórek metodami fizycznymi (np. poprzez rozdrabnianie) lub enzymatycznymi (np. przy użyciu kolagenazy).
Rysunek 1. Odwodnione dyski z gąbki PVA w trzech różnych rozmiarach.
Rysunek 2. Obraz modelu gojenia ran u myszy pokazujący położenie rany bocznej oraz czterech gąbek PVA.
Rysunek 3. (A) Barwienie H & E przy powiększeniu 4x oraz (B) barwienie trychromowe przy powiększeniu 10x przekrojów gąbek zatopionych w parafinie.
Rysunek 4. (A) Obraz gąbki przekrojonej na pół wzdłuż średnicy. (B) Połowa gąbki PVA, zatopiona stroną przekroju do dołu w OCT.
Dyskusja
Model gojenia ran z użyciem gąbki posiada wiele wariantów; można go przeprowadzić u wielu różnych gatunków, w tym u ludzi, a gąbki mogą być również implantowane grzbietowo 1,2,8. W badaniach na ludziach i niektórych innych gatunkach gąbki mogą wymagać umieszczenia w porowatej rurce silikonowej, aby zapobiec ich enkapsulacji oraz ułatwić późniejsze usunięcie 4,8. Miejsce implantacji gąbki można zmieniać w zależności od pożądanych wyników i umiejętności technika. Implantacja grzbietowa dopuszcza przemieszczanie się gąbek pod skórą, podczas gdy implanty brzuszne są trudniejsze do wykonania ze względu na ryzyko przecięcia powłok i dostania się do jamy brzusznej. Gąbki można połączyć z cewnikiem, aby podawanie leku było stałe i kontrolowane, co eliminuje konieczność wielokrotnych iniekcji9. Mniejsze, rurkowate gąbki można nawet podać za pomocą igły8. Skład gąbek nie ogranicza się wyłącznie do alkoholu poliwinylowego. Mogą być one przygotowane z wielu materiałów, stosowanych pojedynczo lub w kombinacjach7.
Kluczowe jest, aby przygotowanie gąbek i ich umieszczenie w organizmie zwierzęcia były spójne i odpowiednio zrozumiane. Jeśli gąbki są wycinane z arkuszy, muszą mieć zbliżoną masę w celu zapewnienia porównywalności. W przypadku ładowania gąbek komórkami lub preparatem terapeutycznym, ilość umieszczona w każdej gąbce musi być dokładna. Proces gojenia może różnić się w zależności od miejsca umieszczenia gąbki w organizmie zwierzęcia, a tempo gojenia spada wraz ze wzrostem odległości od głowy 1,10.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie zapewnione przez grant R01-HL088424 z National Institutes of Health (NIH); nagroda merytoryczna Veterans Affairs dla PPY.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Gąbka PVA | Medtronic Inc. | CF120 | Rozmiar i porowatość gąbki zależą od eksperymentu |
| Ostrze skalpela rozmiar 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Nożyce Metzenbauma | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Kleszczyki hemostatyczne | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Kleszczyki do igieł | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Nylonowa nić chirurgiczna 5-0 | Ethicon Inc. | 698 | |
| Preparat O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 |
Bibliografia
- Efron, D. T., Barbul, A. Subcutaneous sponge models. Methods Mol. Med. 78, 83-93 (2003).
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
Przedruki i uprawnienia
