Implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego

Podsumowanie

Opisano przydatne narzędzie do analizy wpływu leków, czynników wzrostu i/lub zmodyfikowanych komórek w modelu zwierzęcym gojenia ran. Technika ta wykorzystuje właściwości gąbki z alkoholu poliwinylowego (PVA) do dostarczania i utrzymywania pożądanego preparatu, a także stanowi platformę, którą można wyciąć i poddać analizie.

Streszczenie

Gojenie ran jest złożonym, wieloetapowym procesem angażującym wiele typów komórek, czynników wzrostu i związków chemicznych^1-3. Ze względu na tę złożoność, badania nad gojeniem ran są najbardziej kompleksowe, gdy są prowadzone in vivo. Dostępnych jest wiele modeli in vivo do badania gojenia ran ostrych, w tym modele nacięć, wycięcia, martwej przestrzeni oraz oparzeń. Modele martwej przestrzeni to sztuczne, porowate implanty wykorzystywane do badania tworzenia tkanek oraz wpływu substancji na ranę. Do najczęściej stosowanych modeli martwej przestrzeni należą gąbki z alkoholu poliwinylowego (PVA), stalowe cylindry z siatki drucianej, materiał z rozszerzonego politetrafluoroetylenu (ePTFE) oraz Cellstick^1,2.

Każdy model martwej przestrzeni ma swoje ograniczenia wynikające ze składu materiału oraz metod implantacji. Model z cylindra z stalowej siatki drucianej wykazuje fazę opóźnienia infiltracji po implantacji i wymaga długiego czasu przed rozpoczęciem formowania się tkanki ziarninowej¹. Późniejsze etapy gojenia ran najlepiej analizować przy użyciu modelu ePTFE^1,4. Cellstick to model z gąbki celulozowej wewnątrz rurki silikonowej, zazwyczaj stosowany do badania ran pooperacyjnych u ludzi oraz płynu z rany². Zastosowanie gąbki PVA ogranicza się do badań ostrych, ponieważ z czasem zaczyna ona wywoływać reakcję na ciało obce, co prowadzi do reakcji komórek olbrzymich u zwierzęcia⁵. W przeciwieństwie do innych materiałów, gąbki PVA są łatwe do wprowadzenia i usunięcia, wykonane z materiałów obojętnych i niebiodegradowalnych, a jednocześnie na tyle miękkie, że można je pociąć do analizy histologicznej^2,5.

W procesie gojenia ran gąbka z PVA jest bardzo użyteczna do analizy tworzenia się tkanki ziarnistej, odkładania kolagenu, składu wysięku z rany oraz wpływu substancji na proces gojenia^1,2,5. Poza zastosowaniem w badaniu szerokiego spektrum cech gojenia ran, gąbka z PVA była wykorzystywana w wielu innych rodzajach badań. Stosowano ją do badania angiogenezy nowotworowej, dostarczania leków oraz przeżywalności i engraftmentu komórek macierzystych^1,2,6,7. Dzięki swojej dużej modyfikowalności, wcześniejszemu szerokiemu zastosowaniu i powtarzalnym wynikom, gąbka z PVA stanowi idealny model dla wielu badań^1,2.

W niniejszej pracy przedstawimy przygotowanie, implantację oraz odzysk i analizę dysków z gąbki PVA (Rysunek 1) w mysim modelu gojenia ran.

Protokół

1. Przygotowanie gąbki

1. Nawilż gąbki, mieszając je przez noc w 0,9% (w/v) wodnym roztworze chlorku sodu.
2. Sterylizuj nawilżone gąbki w autoklawie. W przypadku objętości 75 mL autoklawuj przez 25 minut w temperaturze 121 °C.

Uwaga: Nasycanie gąbek preparatem zgodnie z poniższym opisem jest opcjonalne.

3. W sterylnej komorze z wykorzystaniem sterylnych narzędzi, wyjmij jedną gąbkę z roztworu za pomocą pęsety. Ściśnij gąbkę pęsetą i użyj końcówki próżniowej, aby usunąć z niej jak najwięcej roztworu. Umieść odciśniętą gąbkę w naczyniu do hodowli tkankowej, dbając o zachowanie odstępów między gąbkami. Do rozdzielenia różnych wariantów traktowania można użyć wielu płytek wielodołkowych.
4. Pipetuj roztwór traktujący bezpośrednio na środek gąbki. Po naniesieniu roztworu delikatnie dociśnij gąbkę końcówką pipety; ułatwia to absorpcję roztworu przez gąbkę. Uwaga: stosowane przez nas gąbki o średnicy 6 mm i grubości 2,75 mm mogą pomieścić maksymalnie 25 μL.
5. Po nasyceniu wszystkich gąbek, płytkę można przechowywać w lodzie do momentu ich implantacji do myszy.

2. Procedura chirurgiczna

1. Odpowiednio znieczulić zwierzę i podać lek przeciwbólowy zapobiegawczo. Cała procedura trwa około 20 minut na jedno zwierzę. W przypadku myszy o masie 30 g do indukcji i podtrzymania znieczulenia stosuje się 1,5 litra tlenu na minutę z 1,5% izofluranem. Gdy zwierzę przestanie reagować na test odruchowy (uszczypnięcie), należy umieścić je w mascetlenowej w pozycji grzbietowej. Za pomocą golarki elektrycznej ogolić obszar o wymiarach 1 in. na 1 in. na dolnej stronie brzusznej poniżej klatki piersiowej. Przetrzeć, aby usunąć odcięte włosy.
2. Zdezynfekować ogolony obszar, oczyszczając go betadyną, a następnie 70% alkoholem. Powtórzyć to oczyszczanie betadyną i alkoholem trzy razy.
3. Napiętej skórze wykonać skalpelem nacięcie pionowe o długości od 1,5 do 2 razy większej niż średnica gąbek do wprowadzenia, uważając, aby nie przeciąć jamy ciała.
4. Za pomocą pęsety przytrzymać brzeg skóry i powoli zacząć oddzielać skórę od mięśni po obu stronach nacięcia, używając nożyczek Metzenbauma. Powstała kieszeń powinna obejmować szerokość ciała myszy oraz obszar od klatki piersiowej do tylnych kończyn.
5. Użyć pęsety, aby podnieść pierwszą gąbkę przeznaczoną do umieszczenia w organizmie zwierzęcia, ściskając ją z boków. Przenieść gąbkę na pęsetę prostą tak, aby była trzymana od góry i od dołu.
6. Użyć pęsety do przytrzymania brzegu skóry i uniesienia go, aby umożliwić wprowadzenie gąbki. Powoli wprowadzić gąbkę, starając się nie dotykać skóry ani znajdujących się pod nią mięśni, ponieważ gąbkę będzie trudno przesunąć po zetknięciu z tkankami. Powtórzyć procedurę dla wszystkich gąbek.
7. Po wprowadzeniu wszystkich gąbek założyć dwa lub trzy szwy w celu zamknięcia nacięcia. Za pomocą pęsety zbliżyć obie strony nacięcia i przeciągnąć nić szwu przez obie warstwy skóry. Zaciągnąć pierwszy węzeł tylko na tyle, aby zamknąć brzegi skóry. Zakończyć węzeł kwadratowy kolejnym przeplotem z przeciwnego kierunku, tym razem mocno zaciągając węzeł. Następnie zawiązać dwa kolejne węzły kwadratowe, aby zakończyć szew (Rycina 2). Założyć dodatkowe szwy, aby zamknąć całe nacięcie. Można zastosować inne metody zamykania ran, takie jak klej dermabond, klipsy ranowe lub zszywki.
8. Wyjąć zwierzę z systemu znieczulającego i monitorować je do czasu odzyskania przytomności. Zwierzę powinno szybko zacząć się poruszać i wrócić do sprawności sprzed operacji. Upewnić się, że ma ono wystarczający dostęp do pokarmu i wody. Na dnie klatki można umieścić nieco nawilżonego pokarmu, aby wspomóc rekonwalescencję. Kontynuować codzienne monitorowanie zwierzęcia pod kątem oznak stresu lub dyskomfortu oraz sprawdzać miejsce nacięcia pod kątem infekcji, stanu zapalnego i rozszczepienia rany. Podjąć odpowiednie działania w przypadku wystąpienia jakichkolwiek powikłań w procesie rekonwalescencji.

3. Opcjonalna iniekcja

Uwaga: Po wszczepieniu gąbek do organizmu zwierzęcia można wstrzyknąć w nie roztwór komórek, leków, czynników wzrostu itp. Pozwala to na analizę efektów działania wstrzykniętej substancji w zależności od czasu podania i schematu dawkowania. W przypadku wykonywania wstrzyknięć należy zawsze zastosować grupę kontrolną.

1. Aby wstrzyknąć do gąbki pożądaną substancję, należy najpierw określić ilość substancji do podania myszy. Substancja musi być stężona w taki sposób, aby objętość wstrzykniętej dawki stanowiła mniej niż połowę całkowitej objętości, jaką może pomieścić gąbka.
2. Przygotować strzykawkę do iniekcji (w przypadku myszy stosuje się igłę 28 G).
3. Zpodać zwierzę, któremu mają być wykonane wstrzyknięcia, pod narkozę.
4. Wstrzyknięcie można wykonać, gdy zwierzę nie reaguje już na test uszczypnięcia.
5. Aby wykonać iniekcję, należy wprowadzić igłę pod kątem 45° przez skórę w centrum gąbki. Następnie wprowadzić igłę do gąbki tylko do połowy jej grubości. Celem jest wstrzyknięcie preparatu dokładnie w środek gąbki.
6. Aby upewnić się, że igła znajduje się w gąbce, należy powoli unosić ją pionowo w górę. Jeśli igła jest w gąbce, gąbka powinna unosić się wraz z igłą.
7. Powoli wstrzyknąć substancję do gąbki, a następnie wyciągnąć igłę. W przypadku wielu gąbek wymagających iniekcji możliwe jest, że część wstrzykniętego płynu zostanie wypchnięta przez wcześniejsze miejsca wstrzyknięcia.

4. Usunięcie gąbki

Uwaga: Podczas usuwania gąbki należy obchodzić się z nią ze szczególną ostrożnością. Należy unikać przebijania gąbki instrumentami chirurgicznymi oraz zapobiegać nadmiernemu krwawieniu do gąbki poprzez unikanie głównych tętnic w otaczających tkankach.

1. Po eutanazji zwierzęcia usuń gąbkę, trzymając skórę pęsetą i wykonując nacięcie w pobliżu gąbki.
2. Ostrożnie oddziel gąbki od otaczającej je torebki, unikając pobierania nadmiaru tkanki wokół gąbki. W przypadku analiz takich jak dostarczanie leków czy morfometria, wycięcie nie musi być tak precyzyjne.

5. Reprezentatywne wyniki

Usunięte gąbczaki można przechowywać w różnych warunkach, w zależności od rodzaju planowanej analizy. W celu wykonania seryjnych cięć, pobrane gąbczaki można zatopić w medium do mrożenia, takim jak związek Optimal Cutting Temperature (O.C.T.), lub umieścić w 10% formalinie w celu zatopienia i cięcia w blokach parafinowych (Rysunek 3A i B). Najlepsze wyniki cięcia uzyskuje się, gdy gąbczaka przetnie się na pół w poprzek średnicy i zatopi cięciem do dołu (Rysunek 4A i B). Przekroje gąbczaka powinny być pobierane w taki sposób, aby objąć całą szerokość gąbczaka. Na Rysunku 3A przedstawiono dwa gąbczaki; gąbczaka po lewej zatopiono/przecięto nieprawidłowo, natomiast gąbczaka po prawej przetworzono prawidłowo.

Do analizy gąbki można umieścić w probówce typu Eppendorf i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia przetwarzania. W przypadku analizy RNA i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym gąbki należy umieścić w probówce typu Eppendorf, szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C. Dodatkowo, w celu stabilizacji RNA do bezpiecznego przechowywania w wyższych temperaturach, można zastosować konserwant RNA, taki jak RNAlater firmy QIAGEN. Płyn z rany można zebrać, wyciskając gąbki nad probówką i łącząc płyn z kilku gąbek, aby uzyskać reprezentatywną próbkę. Z gąbek można również wyizolować żywe komórki, takie jak fibroblasty, makrofagi i limfocyty. Po wyjęciu z organizmu zwierzęcia gąbki można umieścić w odpowiedniej pożywce dla pożądanego typu komórek. Gąbki można przetworzyć w celu uwolnienia komórek metodami fizycznymi (np. poprzez siekanie) lub enzymatycznymi (np. przy użyciu kolagenazy).

Rycina 1. Odwodnione dyski z gąbki PVA w trzech różnych rozmiarach.

Rycina 2. Obraz modelu gojenia rany u myszy pokazujący położenie rany bocznej oraz czterech gąbek z PVA.

Rycina 3. (A) Barwienie H & E przy powiększeniu 4x oraz (B) barwienie trychromowe przy powiększeniu 10x w przekrojach gąbek zatopionych w parafinie.

Rysunek 4. (A) Obraz gąbki przeciętej na pół wzdłuż średnicy. (B) Połowa gąbki PVA, zatopiona stroną przecięcia w OCT.

Dyskusja

Model gojenia ran z użyciem gąbki posiada wiele wariantów; można go przeprowadzić u wielu różnych gatunków, w tym u ludzi, a gąbki mogą być również implantowane grzbietowo ^1,2,8. W badaniach na ludziach i niektórych innych gatunkach gąbki mogą wymagać umieszczenia w porowatej rurce silikonowej, aby zapobiec ich enkapsulacji oraz ułatwić późniejsze usunięcie ^4,8. Miejsce implantacji gąbki można zmieniać w zależności od pożądanych wyników i umiejętności technika. Implantacja grzbietowa dopuszcza przemieszczanie się gąbek pod skórą, podczas gdy implanty brzuszne są trudniejsze do wykonania ze względu na ryzyko przecięcia powłok i dostania się do jamy brzusznej. Gąbki można połączyć z cewnikiem, aby podawanie leku było stałe i kontrolowane, co eliminuje konieczność wielokrotnych iniekcji⁹. Mniejsze, rurkowate gąbki można nawet podać za pomocą igły⁸. Skład gąbek nie ogranicza się wyłącznie do alkoholu poliwinylowego. Mogą być one przygotowane z wielu materiałów, stosowanych pojedynczo lub w kombinacjach⁷.

Kluczowe jest, aby przygotowanie gąbek i ich umieszczenie w organizmie zwierzęcia były spójne i odpowiednio zrozumiane. Jeśli gąbki są wycinane z arkuszy, muszą mieć zbliżoną masę w celu zapewnienia porównywalności. W przypadku ładowania gąbek komórkami lub preparatem terapeutycznym, ilość umieszczona w każdej gąbce musi być dokładna. Proces gojenia może różnić się w zależności od miejsca umieszczenia gąbki w organizmie zwierzęcia, a tempo gojenia spada wraz ze wzrostem odległości od głowy ^1,10.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gąbka PVA	Medtronic Inc.	CF120	Rozmiar i porowatość gąbki zależą od eksperymentu
Ostrze skalpela rozmiar 15	BD Biosciences	371115
Nożyce Metzenbauma	Thermo Fisher Scientific, Inc.	79-211
Kleszczyki hemostatyczne	Fine Science Tools	13004-14
Kleszczyki do igieł	Fine Science Tools	12004-16
Nylonowa nić chirurgiczna 5-0	Ethicon Inc.	698
Preparat O.C.T.	Tissue-Tek	4583