Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Podsumowanie

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Streszczenie

Sygnalizacja jest inicjowana poprzez receptor limfocytów T (TCR), gdy zostaje on zaangażowany przez fragmenty peptydów antygenowych związanych z białkami głównego układu zgodności tkankowej (pMHC) eksprymowanymi na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Kompleks TCR składa się z heterodimeru TCRαβ wiążącego ligand, który łączy się niekowalencyjnie z dimerami CD3 (heterodimerami εδ i εγ oraz homodimerem ζζ)¹. Po zaangażowaniu receptora łańcuchy CD3 ζ są fosforylowane przez kinazę z rodziny Src, Lck. Prowadzi to do rekrutacji kinazy z rodziny Syk, Zap70, która następnie jest fosforylowana i aktywowana przez Lck. Po tym etapie Zap70 fosforyluje białka adaptorowe LAT i SLP76, inicjując tworzenie proksymalnego kompleksu sygnałowego zawierającego dużą liczbę różnych cząsteczek sygnałowych².

Powstanie tego kompleksu prowadzi ostatecznie do aktywacji czynników transkrypcyjnych zależnych od wapnia i białka Ras, a w konsekwencji do uruchomienia złożonej serii programów ekspresji genów, które prowadzą do różnicowania limfocytów T². Sygnały TCR (i wynikający z nich stan różnicowania) są modulowane przez wiele innych czynników, w tym siłę antygenu oraz interakcje z receptorami kostymulującymi/koinhibicyjnymi, chemokinowymi i cytokinowymi ^3-4. Badanie organizacji przestrzennej i czasowej proksymalnego kompleksu sygnałowego w różnych warunkach stymulacji jest zatem kluczowe dla zrozumienia szlaku sygnałowego TCR, a także jego regulacji przez inne szlaki sygnałowe.

Bardzo użytecznym systemem modelowym do badania sygnalizacji inicjowanej przez TCR w błonie plazmatycznej limfocytów T są wspierane szklaną powierzchnią dwuwarstwy lipidowe, opisane wcześniej^5-6. Mogą one służyć do prezentacji kompleksów pMHC antygenowych, cząsteczek adhezyjnych oraz kostymulujących limfocytom T, pełniąc rolę sztucznych APC. Dzięki obrazowaniu limfocytów T oddziałujących z dwuwarstwą lipidową za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM), możemy ograniczyć wzbudzenie do obszaru 100 nm w przestrzeni między szkłem a powierzchnią komórki ^7-8. Pozwala to na obrazowanie przede wszystkim zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących w błonie plazmatycznej. Ponieważ interesuje nas obrazowanie rekrutacji białek sygnalizacyjnych do kompleksu TCR, opisujemy dwukamerowy system obrazowania TIRF, w którym TCR, znakowany fluorescencyjnymi fragmentami Fab (fragment antigen binding) przeciwciała H57 (oczyszczonego z hybridomy H57-597, ATCC, numer ATCC:HB-218) specyficznego dla TCRβ, oraz białka sygnalizacyjne, znakowane GFP, mogą być obrazowane jednocześnie i w czasie rzeczywistym. Strategia ta jest niezbędna ze względu na wysoką dynamikę zarówno limfocytów T, jak i zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących przy TCR. Ta metoda obrazowania pozwoliła badaczom na obrazowanie pojedynczych ligandów ^9-11, jak również rekrutację cząsteczek sygnalizacyjnych do aktywowanych receptorów i stanowi doskonały system do badania biochemii in-situ^12-16.

Protokół

Procedura eksperymentalna:

1. Transfekcja z użyciem zestawu Amaxa Mouse T Cell Nucleofector Kit

Opisujemy tutaj transfekcję naiwnych lub aktywowanych in vitro pierwotnych limfocytów T plazmidami ekspresyjnymi kodującymi cząsteczki sygnałowe znakowane GFP, z wykorzystaniem zestawu Amaxa Mouse T Cell Nucleofector Kit. Aktywacja limfocytów T in vitro przy użyciu obciążonych peptydem APC śledzionowych jest przeprowadzana zgodnie z wcześniejszym opisem⁷. Wszystkie limfocyty T wykorzystane w naszych badaniach wykazują ekspresję TCR AND, który rozpoznaje peptyd MCC (88-103) związany z cząsteczką MHC I-E^k. Transfekcję przeprowadzono w zasadzie zgodnie z zaleceniami producenta; przedstawiamy jednak kilka wskazówek, które zwiększają przeżywalność limfocytów T po transfekcji. Zarówno przeżywalność, jak i wydajność transfekcji są znacznie wyższe w przypadku aktywowanych in vitro limfocytów T niż w komórkach naiwnych.

1. Przed rozpoczęciem pracy przygotować 2 mL uzupełnionej pożywki dla limfocytów T, dodając 20 μL komponentów pożywki A i B oraz 100 μL płodowej surowicy bydlęcej (5%) dla każdej planowanej transfekcji. Pożywkę w płytce 12-dołkowej inkubować w celu wyrównania temperatury w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej godzinę. Alternatywnie można przygotować i przechowywać w zamrożeniu alikwoty pożywki uzupełnionej o 5% surowicy i komponent A. W takim przypadku rozmrozić wymaganą liczbę alikwotów, dodać komponent B i przeprowadzić wyrównanie temperatury.

- Bardzo ważne jest wstępne wyrównanie temperatury i pH pożywki, ponieważ resuspensja komórek po transfekcji w pożywce zimnej lub o pH innym niż 7.2 doprowadzi do ich śmierci.

2. Następnie przygotuj mieszaninę do transfekcji. Połącz 82 μL roztworu Mouse T Cell Nucleofector Solution z 18 μL Supplement 2 oraz 5μg plazmidowego DNA (stężenie nie niższe niż 0,5 μg/μl). Wymieszaj dokładnie, opukując probówkę lub za pomocą mikropipety.

- Ważne jest przeprowadzenie miareczkowania dawki plazmidu dla określonej liczby komórek dla każdego konstruktu używanego do transfekcji. W przypadku niektórych większych konstruktów może być wymagana większa ilość DNA. DNA powinno być wolne od endotoksyn.

3. Przenieś od 5 do 10 milionów komórek do probówki do wirówki o pojemności 15 mL. Wirować z prędkością 600 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać jak najwięcej supernatantu za pomocą aspiratora próżniowego.

- Producenci zalecają wirowanie komórek przy przyspieszeniu mniejszym niż 90x g; w naszym przypadku prędkość ta odpowiada 75x g. Wybrana względna siła odśrodkowa (RCF) służąca do uzyskania pelletu komórkowego jest prawdopodobnie najważniejszą zmienną, ponieważ wirowanie przy niskim RCF zapobiega uszkodzeniu błony komórkowej.

4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w mieszaninie do transfekcji, delikatnie i powoli pipetując osad do momentu całkowitego rozbicia dużych skupisk komórek. Zazwyczaj można to osiągnąć poprzez całkowite odessanie i wydmuchanie komórek przez końcówkę pipety nie więcej niż 3-4 razy.
5. Za pomocą pipety ostrożnie przenieść zawiesinę do certyfikowanej kuwety Amaxa, upewniając się, że wewnątrz nie ma pęcherzyków powietrza. Zamknąć kuwetę nakrętką.
6. Wybrać program Nucleofector X-001 w urządzeniu Nucleofector. Włożyć kuwetę do uchwytu na kuwety Nucleofector (Nucleofector Cuvette Holder) i uruchomić wybrany program.

- Po przeprowadzeniu elektroporacji komórek najlepiej niezwłocznie przenieść je do uprzednio wyrównanego pod względem temperatury medium hodowlanego. Producenci zalecają, aby komórki pozostawały w medium do nukleofektacji nie dłużej niż 15 minut.

7. Przenieść kuwetę oraz uprzednio wyrównane temperaturowo, w pełni uzupełnione pożywkę hodowlane pod dygestorium. Za pomocą dołączonej plastikowej pipety dodać około 500 μL pożywki do kuwety, a następnie kropla po kropli przenieść zawiesinę komórek do pożywki w płytce.
8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przed obrazowaniem. Komórki naiwne należy inkubować w temperaturze 30 °C zamiast 37 °C, co pomaga zachować ich reaktywność na antygen.

- Trzy do czterech godzin inkubacji są zazwyczaj wystarczające, aby limfocyty T wykazywały wykrywalną ekspresję białek znakowanych GFP. Wybrano obrazowanie komórek w tym punkcie czasowym, ponieważ poziom ekspresji jest niski, co pozwala zminimalizować artefakty wynikające z nadekspresji. Jeśli jednak pożądana jest nadekspresja konkretnego białka, limfocyty T należy usunąć z pożywki Amaxa po 4 godzinach. Osiąga się to poprzez ponowne wirowanie komórek przy niskiej RCF i resuspensję w uprzednio wyrównanym medium hodowlanym do limfocytów T, uzupełnionym o 50 U/mL Interleukiny 2 (IL-2), przy zagęszczeniu 2 milionów komórek/mL.

2. Mikroskopia TIRF

Opis mikroskopu TIRF:

1. Konfiguracja ogólna: Komponenty optyczne zbudowano wokół mikroskopu fluorescencyjnego Olympus IX71, który pierwotnie był wyposażony w moduł TIRF firmy Olympus. Szybko odkryliśmy efekty chromatyczne w tym module, gdy pojedynczy stan wyrównania nie pozwalał na osiągnięcie współbieżnej kolimacji dla linii laserowych o różnych długościach fal. Moduł ten nie umożliwiał zatem jednoczesnego obrazowania TIRF przy użyciu różnych długości fal wzbudzenia, dlatego przystąpiliśmy do budowy niestandardowej aparatury TIRF, która minimalizuje efekty chromatyczne w systemie, co omawiamy szczegółowo w następnych sekcjach. Metoda opisana tutaj została opracowana dla obiektywu TIRFM o powiększeniu 150 X i aperturze numerycznej (NA) 1.45 (Olympus), ale działa równie dobrze dla wersji o powiększeniu 60 X i NA 1.45. Do oświetlenia w polu szerokim mikroskop jest połączony z halogenowym źródłem światła Lambda-XL oraz kołem filtrów wzbudzenia (Sutter Instruments) wyposażonym w filtry wzbudzenia. Do zautomatyzowanego pozycjonowania stolika z próbką względem obiektywu mikroskop wyposażono w zmotoryzowany przesuw XY oraz sterowany piezoelektrycznie stolik Z (ASI). Obrazy są rejestrowane za pomocą dwóch identycznych kamer EM CCD z mnożeniem elektronów QuantEM (Photometrics). Rozmiar piksela tych kamer bardzo dobrze odpowiada powiększeniu oferowanemu przez obiektyw TIRF 150 X, co daje końcową rozdzielczość 0.1 μm na piksel. Kamery EMCCD zapewniają również czułość pozwalającą na wizualizację transfektantów GFP o niskim poziomie ekspresji.
2. Lasery: Do oświetlenia TIRF zastosowano system 5 laserów dostarczających łącznie 6 linii laserowych (405, 440, 488, 514, 561 i 640 nm), które są sprzęgane z włóknem jednomodowym (Solamere Technologies). Laser argonowy i laser DPSS pompowany diodowo 561 nm (linie 488, 514 i 561) są prowadzone przez akustooptyczny przestrajalny filtr włóknowy (AOTF) w celu kontroli intensywności, podczas gdy intensywność laserów diodowych (405, 440 i 640 nm) jest kontrolowana poprzez modulowanie napięcia ich zasilaczy. Napięcie na AOTF oraz zasilaczy laserów diodowych jest sterowane za pomocą karty akwizycji danych (DAC) (Measurement Computing) przy użyciu oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices). Sprawność sprzęgania dla laserów diodowych wynosi 30%, podczas gdy dla laserów argonowego i DPSS wynosi ona około 60% ze względu na mniejsze średnice wiązki.
3. Moduł TIRF: Aby jednocześnie obrazować TCR i powiązane z nim cząsteczki sygnałowe, jak opisano wcześniej, niezbędne było zastosowanie oświetlenia TIRF skorygowanego chromatycznie, które nie wymagałoby ponownego wyrównania lub ogniskowania podczas rejestracji emisji fluorescencji o różnych długościach fal. TIRFM osiągnięto stosując oświetlenie przez obiektyw, jak opisano wcześniej¹⁷. Kabel światłowodowy dostarczający światło laserowe do mikroskopu został zamocowany w uchwycie światłowodowym z uchwytem XY zamontowanym na szynie optycznej napędzanej mikrometrem do regulacji Z (Thorlabs). Aby uzyskać oświetlenie TIRF, wiązka laserowa jest ogniskowana w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu za pomocą systemu dwóch soczewek (L1 (soczewka kolimująca) i L2 (soczewka skupiająca) na Rysunku 1), tak aby wiązka opuszczała obiektyw w sposób skolimowany. Zapewnia to, że wszystkie promienie światła wychodzące z obiektywu będą miały ten sam kąt względem płaszczyzny próbki. Końcówka światłowodu jest ustawiona w ognisku soczewki kolimującej. Przesuwając mikrometr wzdłuż szyny optycznej względem soczewki kolimującej (kierunek Z), można dostosować ogniskową wiązki i przesuwać wiązkę w pozycji X i Y za pomocą pokręteł regulacyjnych XY. Ze względu na bardzo małą aperturę tylną obiektywu 150 X stwierdziliśmy, że aby osiągnąć TIRF, rozmiar plamki laserowej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej musi być mały. Aby uzyskać ogniskowanie niezbędne do wytworzenia małej plamki, konieczne były soczewki o krótkiej ogniskowej (Keir Neumann, komunikacja osobista); dlatego zastosowano soczewkę skupiającą o ogniskowej około 108 mm, która została umieszczona w kostce dichroicznej bezpośrednio przed obiektywem. Soczewka kolimująca została umieszczona bliżej dzielnika wiązki, który wprowadzał oświetlenie TIRF. Aby zminimalizować niepożądane efekty chromatyczne, w obu soczewkach (kolimującej i skupiającej) zastosowano dublety achromatyczne (soczewki skorygowane chromatycznie, wykonane poprzez stopienie dwóch elementów soczewkowych z materiałów o różnych współczynnikach załamania) z powłokami antyrefleksyjnymi (JML Optical). Ogniskowanie można zweryfikować, sprawdzając, czy wiązka opuszczająca obiektyw jest skolimowana, gdy znajduje się w centrum apertury tylnej, i czy tworzy ciasną plamkę na suficie pomieszczenia. Następnie pozycję ogniskowanej plamki przesuwa się w stronę krawędzi apertury (w kierunku Y), co powoduje zbieżność wiązki w płaszczyźnie obrazu pod dużymi kątami, aż w końcu zostanie osiągnięty kąt krytyczny dla całkowitego wewnętrznego odbicia. Dzięki zastosowaniu tych komponentów optycznych osiągnięto jednoczesną kolimację dla wszystkich długości fal od 442 do 640 nm przy tym samym wyrównaniu. Pojedyncze wyrównanie optyczne pozwoliło zatem na jednoczesne przeprowadzanie TIRFM w wielu długościach fal.
4. Aparatura z podwójną kamerą: Jednoczesną akwizycję odrębnych emisji fluorescencji pochodzących od dwóch różnych fluoroforów osiągnięto poprzez budowę systemu z dwiema kamerami, który rozdziela emisję na dwa zakresy długości fal za pomocą luster dichroicznych (Rysunek 2). Emitowane światło jest odbijane od obiektywu i wychodzi prawym portem mikroskopu. Ponieważ większość obiektywów jest skorygowana do nieskończoności (z obrazami tworzonymi w nieskończoności), do skupienia obrazu wymagana jest soczewka tubusowa. Aby manipulować dwiema długościami fal emisji jednocześnie, usunięto soczewkę tubusową z prawego portu. Przymocowano niestandardowy adapter z gwintami typu C (Sutter Instruments) i połączono go z uchwytem lustra dichroicznego (Edmund Optics). W uchwycie tym zainstalowano lustra dichroiczne oddzielające emisję GFP od emisji barwników organicznych użytych do znakowania TCR (Alexa546, Alexa647 itp.). Za tym modułem, w obu drogach optycznych, znajdował się uchwyt soczewki tubusowej, uchwyt filtra emisyjnego oraz tubusy przedłużające. Soczewki tubusowe (TL1 i TL2 (Rysunek 2)) mają ogniskową 180 mm. Szczeliny w tubusach przedłużających prowadzących do kamer EM CCD zostały zaklejone czarnym papierem, aby chronić kamery przed światłem rozproszonym. W celu umożliwienia wyrównania obu kanałów, kamery zamontowano na dwóch niestandardowych statywach przesuwnych XYZ (Holmarc Products).

Poniżej opisujemy, jak ustawić mikroskop do jednoczesnego obrazowania dwukanałowego. Kroki obejmują ustawienie oświetlenia TIRF, regulację mocy lasera oraz wyrównanie dwóch obrazów wyjściowych przy użyciu mikrokulek o rozmiarze poniżej rozdzielczości.

1. Przed rozpoczęciem należy włączyć wszystkie komponenty mikroskopu. Następnie uruchamia się komputer oraz oprogramowanie i upewnia się, że wszystkie komponenty sprzętowe zostały rozpoznane przez system.
2. W celu zastosowania jako standard kolokalizacji, 1 μL podrozdzielczych (0,2 μm) mikrosfer wielobarwnych Fluoresbrite należy rozcieńczyć w 2 mL PBS, a następnie dodać 0,25 mL zawiesiny mikrosfer do każdej studni systemu szkiełek podstawowych z 8 komorami Lab-Tek II (Nunc). System szkiełek z komorami należy umieścić na platformie nad obiektywem. Następnie należy ustawić ostrość na kulekach zaadsorbowanych do szkła.
3. Korzystając z wyrównania Y w funkcji wprowadzania włókna XYZ, pozycję wiązki lasera należy przesunąć do centrum tylnej apertury obiektywu. Ważne jest, aby wykonać to w momencie, gdy obiektyw znajduje się w pozycji, w której płaszczyzna szkła jest w ostrości. Jeśli wiązka nie jest skolimowana, należy wyregulować mikrometr Z, aby uzyskać pełną kolimację. Kolimację sprawdza się oddzielnie dla wszystkich linii laserowych, które będą wykorzystane w eksperymencie. Na tym etapie moc lasera dla każdej linii jest mierzona za pomocą miernika mocy lasera i regulowana do wartości 20-30 μW w każdym kanale.

- Komórki T są niezwykle wrażliwe na promieniowanie laserowe, dlatego całkowita moc oświetlenia jest ograniczona do 50 μW.

4. Obrazy kuleczek pozyskuje się przy użyciu oświetlenia TIRF w trybie na żywo. Obracać mikrometr wyrównania Y w module wprowadzania światłowodowego tak, aby wiązka zaczęła oddalać się od sufitu, aż jej kąt względem osi optycznej obiektywu zbliży się do 90 stopni. W momencie osiągnięcia kąta krytycznego dla całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR), światło lasera przestanie opuszczać obiektyw. Wyrównanie TIRF ocenia się następnie poprzez ustawianie ostrości w górę i w dół przez płaszczyznę szkiełka zakryjącego. Jeśli widoczne są kuleczki pływające w roztworze, należy dalej zwiększyć kąt wiązki względem normalnej obiektywu. Przy prawidłowym wyrównaniu TIRF w ostrości będzie znajdować się tylko jedna płaszczyzna optyczna (tj. tylko kuleczki zaadsorbowane na szkiełku zakrywającym). Bardziej precyzyjny test wyrównania TIRF można przeprowadzić podczas obrazowania komórek T barwionych barwnikiem powierzchniowym, które rozprzestrzeniły się na powierzchni. (Patrz punkt 3.4).
5. Po uzyskaniu oświetlenia TIRF można wyrównać oba kanały względem siebie. Ustawić ostrość na kuleczkach i porównać położenie charakterystycznych cech na obrazach uzyskanych w obu kanałach. Za pomocą śrub mikrometrycznych X i Y na jednym statywie kamery maksymalnie zbliżyć do siebie względne położenia kuleczek. Zapisać obrazy z obu kanałów. Obrazy te posłużą jako standard kolokalizacji do wyrównania obu kanałów.
6. Kamerę należy również wyrównać tak, aby były one parfokalne względem siebie. Osiąga się to poprzez pozyskanie zestawu obrazów kuleczek o rozmiarze poniżej rozdzielczości, które są oddzielone od siebie w kierunku Z o 100 nm. Jeśli piksel o maksymalnej intensywności dla kuleczek znajduje się w tej samej płaszczyźnie dla obu kamer, oznacza to, że są one parfokalne.

3. Obrazowanie

Po przygotowaniu mikroskopu kolejnym zadaniem jest przygotowanie komór przepływowych zawierających szklane podłoża z dwuwarstwami lipidowymi prezentującymi antygen i cząsteczki adhezyjne, zgodnie z wcześniejszym opisem ⁶, a następnie przeprowadzenie TIRFM transmitowanych limfocytów T oddziałujących z podłożem. Postępowano zgodnie z opublikowanym protokołem tworzenia dwuwarstw^5-6, z wyjątkiem tego, że liposomów nie inkubowano przez 20 minut na szkiełku podstawowym po złożeniu komory przepływowej. Zamiast tego, bezpośrednio po montażu do komory przepływowej wprowadzono bufor HBS-BSA.

1. Zmontować komorę przepływową z płaskimi dwuwarstwami lipidowymi utworzonymi na szklanym szkiełku podstawowym zawierającym lipidy Ni-NTA. Cząsteczki adhezyjne, ICAM-1 (100 cząsteczek/μm²), oraz kompleksy peptyd-MHC, I-E^k obciążone MCC (5-10 cząsteczek/μm²), są włączone w dwuwarstwę za pomocą ich znaczników histydynowych. Kostymulująca cząsteczka CD80 jest dodawana przy użyciu kotwicy GPI (100 cząsteczek/μm²).
2. Umieścić celę przepływową na stoliku mikroskopu i ustabilizować ją. Przymocować dostarczony przez producenta element grzejny do celi przepływowej w celu kontrolowania jej temperatury. Ustawić obiektyw nad dwuwarstwą i ustawić płaszczyznę dwuwarstwy w ostrości. Włączyć podgrzewanie obiektywu i celi przepływowej, aby ustabilizować temperaturę komory na poziomie 37 °C.
3. Ztransfekowane limfocyty T są wirowane po 4 godzinach inkubacji z prędkością 80x g i resuspenderowane w buforze HBS-BSA uzupełnionym o 10 μg/mL fragmentu Fab H57 lub 20 μg/mL jednoczynnościowego fragmentu zmiennego (scFv) H57 w celu znakowania TCR. Następnie komórki są wstrzykiwane do cel przepływowych. Obrazowanie jest przeprowadzane w stałej obecności Fab lub scFv ze względu na ich wysoką stałą dysocjacji. Ich obecność w medium nie zwiększa znacząco tła, ponieważ pole TIRF jest bardzo cienkie.
4. Warunki obrazowania są ustawione tak, aby dwukanałowa akwizycja na żywo wyświetlała podgląd kanałów TCR i GFP, co ułatwia wyszukiwanie ztransfekowanych komórek. Oświetlenie TIRF jest potwierdzane poprzez ustawienie ostrości na płaszczyznę szklaną w celu wykrycia ewentualnego bocznego barwienia błon. Jeśli błony boczne nie wchodzą w ostrość, oznacza to, że wyrównanie TIRF jest prawidłowe. Następnie ztransfekowane komórki są obrazowane pojedynczo lub w sekwencji obrazów w celu utworzenia filmów.

4. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

Oprogramowanie generuje obrazy z dwóch kamer w jednej ramce. Wyjście z każdej kamery ma rozdzielczość 512 x 512 pikseli; w związku z tym rozmiar obrazu wyjściowego wynosi 1024 x 512 pikseli. Obrazy muszą zostać najpierw podzielone na pojedyncze ramki odpowiadające obu kamerom. Obrazy kulek o rozdzielczości subpikselowej z dwóch kanałów są nakładane na siebie, a następnie wyznacza się parametry dopasowania. Cechą charakterystyczną dla naszego systemu jest obrót jednego kanału o 1 stopień względem drugiego (patrz Rysunek 3). Najbardziej prawdopodobną przyczyną tego obrotu są statywy kamer. Po wykonaniu tego obrotu należy przeprowadzić dalsze relatywne transformacje liniowe w osiach X i Y, aby idealnie dopasować kulek względem siebie. W każdym eksperymencie pobierane są obrazy kulek w celu określenia dokładnych parametrów dopasowania obu kanałów. Następnie transformacje liniowe i rotacyjne są stosowane do wszystkich obrazów, które następnie poddawane są algorytmom segmentacji i analizie ko-lokalizacji.

5. Reprezentatywne wyniki

Opisany tutaj system można dostosować do badania sygnalizacji w dół każdego receptora błony plazmatycznej. Jest on szczególnie pomocny w badaniu sygnalizacji TCR, ponieważ sygnalizacja zachodzi w optycznie rozdzielnych skupiskach nazywanych mikroskupiskami TCR lub w endosomach, jak opisano niedawno¹⁸. Gdyby sygnalizacja zachodziła w skupiskach receptorów poniżej rozdzielczości lub w receptorach nieskupionych, interpretacja danych wymagałaby przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów. Jak wspomniano wcześniej, łańcuchy CD3 kompleksu TCR ulegają fosforylacji przez kinazę Lck z rodziny Src po zaangażowaniu TCR przez kompleksy peptyd-MHC. Fosforylowany łańcuch CD3ζ rekrutuje następnie kinazę Zap70 z rodziny Syk. Wizualizacja rekrutacji Zap70 informuje zatem o stanie fosforylacji łańcucha CD3ζ. Siłę stymulacji TCR można zmieniać, stosując peptydy zmutowane w obrębie reszt kontaktowych TCR. Takie peptydy nazywa się zmodyfikowanymi ligandami peptydowymi (APLs). Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rysunku 4, gdzie peptydy agonistyczne silnie rekrutują Zap70 do mikroskupisk TCR, podczas gdy peptyd T102L o niższej sile działania nie rekrutuje Zap70 do mikroskupisk TCR, co dowodzi, że w tym przypadku łańcuch CD3ζ nie jest fosforylowany. Mogliśmy wyciągnąć taki wniosek, ponieważ musieliśmy jedynie zaobserwować rekrutację Zap70 do skupisk TCR, które były łatwo wykrywalne za pomocą TIRFM. Do policzenia liczby mikroskupisk Zap70 na komórkę zastosowano zautomatyzowany algorytm segmentacji. W filmie uzupełniającym przedstawiono również jednoczesny obraz fluorescencji związanej z TCR i Zap70. Zwróć uwagę na dynamiczny charakter lamellipodium.

Rycina 1. Zdjęcie i schemat autorskiego modułu wprowadzania wiązki TIRF. Panel A przedstawia fotografię modułu TIRF zainstalowanego na mikroskopie, a Panel B stanowi schemat modułu TIRF obrazujący drogę światła. Schemat i zdjęcie pokazują położenie soczewki zbierającej, dzielnika wiązki, wprowadzenia światłowodowego z regulacją w osiach X, Y i Z, soczewki kolimującej L1 oraz soczewki skupiającej L2 zainstalowanej w kostce dichroicznej i obiektywie TIRF. Wstawka przedstawia soczewkę skupiającą zainstalowaną w kostce dichroicznej.

Rysunek 2. Zdjęcie i schemat systemu dwóch kamer. Panel A przedstawia zdjęcie systemu dwóch kamer przymocowanego do mikroskopu, a Panel B jest schematem tego samego układu. Schemat i zdjęcie pokazują położenie obiektywu, lustra, filtra dichroicznego, soczewek tubusowych TL1 i TL2, filtrów emisyjnych F1 i F2 oraz dwóch kamer C1 i C2 na statywach z odpowiednimi regulacjami w osiach X, Y i Z.

Rycina 3. Wykorzystanie kulek o rozmiarze poniżej rozdzielczości do wyrównania dwóch kanałów. Panele A i B przedstawiają nałożenie obrazów kulek o rozmiarze poniżej rozdzielczości przed (Panel A) i po (Panel B) wyrównaniu. Panel A pokazuje, że jeden z kanałów jest obrócony względem drugiego. Panele C i D stanowią fragmenty obrazów z paneli A i B. Panel E przedstawia obraz nałożenia dwóch kanałów komórek bez przetwarzania. Parametry wyrównania użyte w panelu D zastosowano do obrazu przedstawionego w panelu F. Zwróć uwagę, że lamelipodium z dwóch kanałów jest idealnie wyrównane w panelu F, a nie w panelu E. Pasek skali 4 μm dla wszystkich paneli.

Rysunek 4. Rekrutacja Zap70 do mikroskupisk TCR w odpowiedzi na różne APL. Aktywowane in vitro limfocyty T były transfektowane plazmidem kodującym Zap70 połączone z GFP i inkubowane na szklanych podłożach z dwuwarstwami lipidowymi Ni-NTA zawierającymi 6 cząsteczek/μm² peptydowo-obciążonego His-tagged-I-E^k, 100 cząsteczek/μm² koniugatu Alexa647 z His-tagged ICAM-1 oraz 100 cząsteczek/μm² zakotwiczonego przez GPI CD80. Obciążone peptydy wskazano na wstawce. ICAM-1 odnosi się do komórek na dwuwarstwach zawierających 100 cząsteczek/μm² koniugatu Alexa-647 z His-tagged ICAM-1. Mikroskopię TIRF z jednoczesną akwizycją dwukanałową przeprowadzono w obecności koniugatu Alexa546 z fragmentem Fab H57 (nieblokującym) w celu barwienia TCR. Obrazowanie komórek trwało do jednej godziny po początkowym kontakcie z dwuwarstwą. Liczbę skupisk Zap70 na komórkę analizowano za pomocą oprogramowania do automatycznego liczenia skupisk. W każdym przypadku przeanalizowano co najmniej 40 komórek. Pasek skali 2 μm dla wszystkich obrazów.

Rysunek 5. Dopasowanie systemu dwóch kamer z wykorzystaniem dwóch różnych typów kamer. Ten panel przedstawia dopasowaną nakładkę kulek poniżej rozdzielczości obrazowania, wykonaną za pomocą systemu dwóch kamer o różnych rozmiarach pikseli (zielony: rozmiar piksela 6,45 μm obrazowany przy binningu 2x2 oraz czerwony: rozmiar piksela 16 μm obrazowany bez binningu). Wstawka przedstawia powiększony widok kwadratowej ramki w centrum pola widzenia. Pasek skali 5 μm.

Film uzupełniający. Rekrutacja Zap70 do mikoskupisk TCR w odpowiedzi na peptyd agonistyczny. Aktywowane in vitro limfocyty T typu AND zostały przetransfekowane plazmidem kodującym Zap70 połączone z GFP i inkubowane na szklanych dwuwarstwach Ni-NTA zawierających 6 cząsteczek/μm² peptydowo-obciążonego His-tagged-I-E^k, 100 cząsteczek/μm² sprzężonego z Alexa647 His-tagged ICAM-1 oraz 100 cząsteczek/μm² zakotwiczonego przez GPI CD80. Mikroskopia TIRF z jednoczesną akwizycją dwukanałową była przeprowadzana w stałej obecności sprzężonego z Alexa546 fragmentu Fab H57 (nieblokującego) w celu barwienia TCR. Pole z przetransfekowanymi komórkami obrazowano wielokrotnie, 40 razy, z rozdzielczością czasową 10 sekund na klatkę. Pasek skali 2 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film uzupełniający.

Dyskusja

Opisujemy tutaj system do badania sygnalizacji w antygenowo specyficznych pierwotnych limfocytach T myszy z wykorzystaniem TIRFM oraz szklanych wspieranych dwuwarstw lipidowych jako sztucznych APC. Technika ta opiera się na pomyślnej ekspresji białek znakowanych GFP w tych komórkach. Transfekcja limfocytów T jest zawsze trudnym zadaniem. Zazwyczaj stosuje się elektroporację lub dostarczanie genów za pomocą retrowirusów lub lentiwirusów. Żadna z tych technik nie jest lepsza od pozostałych; każda z nich ma swoje ograniczenia i zalety. Stwierdzamy, że elektroporacja posiada następujące zalety: 1) komórki nie muszą aktywnie się dzielić, co jest wymagane w przypadku retrowirusów, ale nie lentiwirusów, oraz 2) poziom ekspresji można kontrolować poprzez zmianę czasu inkubacji komórek przed obrazowaniem. Największą wadą jest to, że ekspresja białek o dużym rozmiarze w komórkach pierwotnych jest bardzo trudna. Przedstawiliśmy metodę, która zapewnia bardzo dobrą żywotność komórek po elektroporacji. W rezultacie można ją zastosować do wyciszania genów za pomocą siRNA.

Opisujemy tutaj również dostosowany mikroskop TIRF z dwukanałową symultaniczną akwizycją, który jest skorygowany chromatycznie i nie wymaga osobnego ustawiania dla różnych długości fal. Możliwości te są jednak dostępne w rozwiązaniach komercyjnych. Nasz system opiera się na zasadach mikroskopii TIRF opublikowanych przez ekspertów w tej dziedzinie i jest tańszy niż alternatywy komercyjne. Jedną z możliwych krytyk naszej konstrukcji może być fakt, że stosujemy ten sam kąt padania dla różnych długości fal wzbudzenia. Wynikowałoby to z różnej głębokości penetracji TIRF dla różnych długości fal wzbudzenia. Uważamy, że efekty te są niewielkie, ponieważ fala ewanescentna jest polem zanikającym wykładniczo, a głębokość pola TIRF jest funkcją liniową długości fali. Fluorofory znajdujące się blisko powierzchni szkła nie odczują różnicy w intensywności lasera między dwiema długościami fal. Dla fluoroforów znajdujących się w pobliżu głębokości penetracji, różnica intensywności wyniesie 1,3-krotność dla długości fal 488 i 640 nm oraz 1,15-krotność dla długości fal 488 i 561 nm. Ten sam system może być stosowany w połączeniu z technikami superrozdzielczości, które wykorzystują oświetlenie TIRF.

Opisaliśmy również system dwukamerowy wykonany na specjalne zamówienie. Podobnie jak w przypadku systemu TIRF, analogiczne urządzenia są dostępne w sprzedaży. Nasz system oferuje elastyczność w kwestii wymiany filtrów i luster dichroicznych, co umożliwia jego zastosowanie z różnymi kombinacjami długości fal. Wadą naszego systemu jest konieczność rotacji w jednej osi w celu wyrównania dwóch obrazów. Problem ten można rozwiązać, stosując statywy kamer sterowane piezoelektrycznie, które oferują możliwość regulacji kąta obrotu. Z sukcesem zaimplementowaliśmy w tym mikroskopie system dwukamerowy, w którym zastosowano różne kamery o odmiennych rozmiarach pikseli. Taki system byłby przydatny w sytuacjach, gdy wymagana jest wysoka czułość w jednym kanale i szeroki zakres dynamiczny w drugim, co rzadko zdarza się w przypadku jednej kamery. Użyliśmy kamery Photometrics HQ-2 z binningiem 2x2, co dało efektywny rozmiar piksela 12,9 μm, oraz kamery Photometrics Quant-EM, która posiada rozmiar piksela 16 μm. Dla kamery Quant-EM zastosowano soczewkę tubusową o ogniskowej 180 mm, a dla kamery HQ-2 soczewkę tubusową o ogniskowej 145 mm. Kamera HQ-2 była sterowana za pomocą oprogramowania Metamorph, natomiast Quant-EM była sterowana poprzez oprogramowanie micro-manager na osobnym komputerze w trybie wyzwalania zewnętrznego. Sygnał wyzwalający dla kamery Quant-EM był dostarczany przez wyjście cyfrowe karty DAC systemu measurement computing, co zostało zaimplementowane jako dodatkowa migawka w ustawieniach konfiguracji oświetlenia programu Metamorph. Stosunek ogniskowych soczewek tubusowych odpowiada stosunkowi efektywnych rozmiarów pikseli. Reprezentatywne wyrównanie przedstawiono na Rysunku 5.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Amaxa Nucleofector do limfocytów T mysich	Lonza Inc.	VPA-1006
Zestaw PureLink HiPure Plasmid Midiprep	Life Technologies	K2100-05	Do preparatyki DNA wolnego od endotoksyn
Urządzenie Amaxa Nucleofector	Lonza Inc.	AAD-1001
Rekombinowana mysia IL-2	PeproTech Inc	212-12
Wielobarwne fluorescencyjne mikrosfery Fluoresbrite 0,20μm	Polysciences, Inc.	24050-5
Szkiełka nakrywki z 8 komorami Lab-Tek II	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155409