Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Podsumowanie

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Streszczenie

Sygnalizacja jest inicjowana poprzez receptor limfocytów T (TCR), gdy zostaje on zaangażowany przez fragmenty peptydów antygenowych związanych z białkami głównego układu zgodności tkankowej (pMHC) eksprymowanymi na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Kompleks TCR składa się z heterodimeru TCRαβ wiążącego ligand, który łączy się niekowalencyjnie z dimerami CD3 (heterodimerami εδ i εγ oraz homodimerem ζζ)¹. Po zaangażowaniu receptora łańcuchy CD3 ζ są fosforylowane przez kinazę z rodziny Src, Lck. Prowadzi to do rekrutacji kinazy z rodziny Syk, Zap70, która następnie jest fosforylowana i aktywowana przez Lck. Po tym etapie Zap70 fosforyluje białka adaptorowe LAT i SLP76, inicjując tworzenie proksymalnego kompleksu sygnałowego zawierającego dużą liczbę różnych cząsteczek sygnałowych².

Powstanie tego kompleksu prowadzi ostatecznie do aktywacji czynników transkrypcyjnych zależnych od wapnia i białka Ras, a w konsekwencji do uruchomienia złożonej serii programów ekspresji genów, które prowadzą do różnicowania limfocytów T². Sygnały TCR (i wynikający z nich stan różnicowania) są modulowane przez wiele innych czynników, w tym siłę antygenu oraz interakcje z receptorami kostymulującymi/koinhibicyjnymi, chemokinowymi i cytokinowymi ^3-4. Badanie organizacji przestrzennej i czasowej proksymalnego kompleksu sygnałowego w różnych warunkach stymulacji jest zatem kluczowe dla zrozumienia szlaku sygnałowego TCR, a także jego regulacji przez inne szlaki sygnałowe.

Bardzo użytecznym systemem modelowym do badania sygnalizacji inicjowanej przez TCR w błonie plazmatycznej limfocytów T są wspierane szklaną powierzchnią dwuwarstwy lipidowe, opisane wcześniej^5-6. Mogą one służyć do prezentacji kompleksów pMHC antygenowych, cząsteczek adhezyjnych oraz kostymulujących limfocytom T, pełniąc rolę sztucznych APC. Dzięki obrazowaniu limfocytów T oddziałujących z dwuwarstwą lipidową za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM), możemy ograniczyć wzbudzenie do obszaru 100 nm w przestrzeni między szkłem a powierzchnią komórki ^7-8. Pozwala to na obrazowanie przede wszystkim zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących w błonie plazmatycznej. Ponieważ interesuje nas obrazowanie rekrutacji białek sygnalizacyjnych do kompleksu TCR, opisujemy dwukamerowy system obrazowania TIRF, w którym TCR, znakowany fluorescencyjnymi fragmentami Fab (fragment antigen binding) przeciwciała H57 (oczyszczonego z hybridomy H57-597, ATCC, numer ATCC:HB-218) specyficznego dla TCRβ, oraz białka sygnalizacyjne, znakowane GFP, mogą być obrazowane jednocześnie i w czasie rzeczywistym. Strategia ta jest niezbędna ze względu na wysoką dynamikę zarówno limfocytów T, jak i zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących przy TCR. Ta metoda obrazowania pozwoliła badaczom na obrazowanie pojedynczych ligandów ^9-11, jak również rekrutację cząsteczek sygnalizacyjnych do aktywowanych receptorów i stanowi doskonały system do badania biochemii in-situ^12-16.

Protokół

Procedura eksperymentalna:

1. Transfekcja z użyciem zestawu Amaxa Mouse T Cell Nucleofector Kit

Opisujemy tutaj transfekcję naiwnych lub aktywowanych in vitro pierwotnych limfocytów T plazmidami ekspresyjnymi kodującymi cząsteczki sygnałowe znakowane GFP, z wykorzystaniem zestawu Amaxa Mouse T Cell Nucleofector Kit. Aktywacja limfocytów T in vitro przy użyciu obciążonych peptydami śledzionowych APC jest przeprowadzana zgodnie z wcześniejszym opisem⁷. Wszystkie limfocyty T wykorzystane w naszych badaniach wykazują ekspresję TCR AND, który rozpoznaje peptyd MCC (88-103) związany z cząsteczką MHC I-E^k. Transfekcję przeprowadza się w zasadzie zgodnie z zaleceniami producenta; przedstawiamy jednak kilka wskazówek zwiększających przeżywalność limfocytów T po transfekcji. Zarówno przeżywalność, jak i wydajność transfekcji są znacznie wyższe w przypadku limfocytów T aktywowanych in vitro niż w komórkach naiwnych.

1. Przed rozpoczęciem przygotuj 2 mL uzupełnionego pożywki dla limfocytów T, dodając 20 μL obu komponentów pożywki A i B oraz 100 μL płodowej surowicy bydlęcej (5%) na każdą planowaną transfekcję. Równoważ pożywkę w płytce 12-dołkowej w inkubatorze z nawilżoną atmosferą w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej godzinę. Alternatywnie można przygotować i przechowywać w zamrożeniu alikwoty pożywki uzupełnionej o 5% surowicy oraz komponent A. W takim przypadku rozmroź wymaganą liczbę alikwotów, dodaj komponent B i przeprowadź proces równoważenia.

- Wstępne równoważenie pożywki jest bardzo ważne, ponieważ resuspensja komórek po transfekcji w pożywce zimnej lub o pH innym niż 7.2 doprowadzi do śmierci komórek.

2. Następnie przygotuj mieszaninę do transfekcji. Połącz 82 μL roztworu Nucleofector Solution dla limfocytów T myszy z 18 μL Suplementu 2 i 5 μg plazmidowego DNA (stężenie nie niższe niż 0,5 μg/μl). Wymieszaj dokładnie, delikatnie opukując probówkę lub za pomocą mikropipety.

- Ważne jest przeprowadzenie miareczkowania dawki plazmidu dla stałej liczby komórek dla każdego konstruktu używanego do transfekcji. W przypadku niektórych większych konstruktów może być wymagana większa ilość DNA. DNA powinno być wolne od endotoksyn.

3. Przenieś od 5 do 10 milionów komórek do probówki do wirowania o pojemności 15 mL. Wiruj przy 600 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń jak największą ilość supernatantu za pomocą aspiratora próżniowego.

- Producenci zalecają wirowanie komórek z prędkością mniejszą niż 90x g; w naszym przypadku prędkość ta odpowiada 75x g. Wybrana względna siła odśrodkowa (RCF) w celu uzyskania osadu komórkowego jest prawdopodobnie najważniejszą zmienną, ponieważ wirowanie przy niskim RCF zapobiega uszkodzeniu błony komórkowej.

4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w mieszaninie do transfekcji, delikatnie i powoli pipetując osad aż do całkowitego rozbicia dużych skupisk komórek. Zazwyczaj można to osiągnąć poprzez całkowite zaspirowanie komórek przez końcówkę pipety nie więcej niż 3-4 razy.
5. Za pomocą pipety ostrożnie przenieść zawiesinę do certyfikowanej kuwety Amaxa, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Zamknąć kuwetę zakrętką.
6. Wybrać program Nucleofector X-001 na urządzeniu Nucleofector. Włożyć kuwetę do uchwytu kuwet Nucleofector Cuvette Holder i uruchomić wybrany program.

- Po przeprowadzeniu elektroporacji komórek najlepiej niezwłocznie przenieść je do wcześniej wyrównanego pod względem temperatury medium hodowlanego. Producenci zalecają, aby komórki pozostawały w medium do nukleofektora nie dłużej niż przez 15 minut.

7. Przenieś kuwetę oraz uprzednio wyrównaną temperaturowo, w pełni uzupełnioną pożywkę hodowlaną do dygestorium. Za pomocą dołączonej plastikowej pipety dodaj do kuwety około 500 μL pożywki, a następnie przenieś zawiesinę komórkową z płytki do pożywki, dodając ją kropla po kropli.
8. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przed obrazowaniem. Komórki naiwne należy inkubować w temperaturze 30 °C zamiast 37 °C; pomaga to zachować ich reaktywność na antygen.

- Trzy do czterech godzin inkubacji są zazwyczaj wystarczające, aby limfocyty T wykazały mierzalną ekspresję białek znakowanych GFP. Wybrano ten punkt czasowy do obrazowania komórek, ponieważ poziom ekspresji jest wówczas niski, co pozwala zminimalizować artefakty wynikające z nadekspresji. Jeśli jednak pożądana jest nadekspresja konkretnego białka, limfocyty T należy usunąć z medium Amaxa po 4 godzinach. Osiąga się to poprzez ponowne wirowanie komórek przy niskiej RCF i resuspensję w uprzednio wyrównanym temperaturowo medium hodowlanym dla limfocytów T, uzupełnionym o 50 U/mL interleukiny 2 (IL-2), przy gęstości 2 milionów komórek/mL.

2. Mikroskopia TIRF

Opis mikroskopu TIRF:

1. Konfiguracja ogólna: Komponenty optyczne zbudowano wokół mikroskopu fluorescencyjnego Olympus IX71, który pierwotnie był wyposażony w moduł TIRF firmy Olympus. Szybko odkryliśmy efekty chromatyczne w tym module, polegające na tym, że pojedynczy stan wyrównania nie zapewniał wspólnej kolimacji dla linii laserowych o różnych długościach fal. Moduł ten nie pozwalał zatem na jednoczesne obrazowanie TIRF z wykorzystaniem różnych długości fal wzbudzenia, w związku z czym przystąpiliśmy do konstrukcji niestandardowego aparatu TIRF, który minimalizuje efekty chromatyczne w systemie, co szczegółowo omawiamy w następnych sekcjach. Opisana tutaj metoda została opracowana dla obiektywu TIRFM o powiększeniu 150 X i aperturze numerycznej (NA) 1,45 (Olympus), ale działa równie dobrze dla wersji o powiększeniu 60 X i NA 1,45. Do oświetlenia w polu szerokim mikroskop jest połączony z halogenowym źródłem światła Lambda-XL oraz kołem filtrów wzbudzenia (Sutter Instruments) wyposażonym w filtry wzbudzenia. W celu zautomatyzowanego pozycjonowania stolika z próbką względem obiektywu, mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowany zespół translacyjny XY oraz piezo-sterowany stolik Z (ASI). Obrazy są rejestrowane za pomocą dwóch identycznych kamer CCD z mnożeniem elektronów (EM) QuantEM (Photometrics). Rozmiar piksela tych kamer bardzo dobrze współgra z powiększeniem oferowanym przez obiektyw TIRF 150 X, co daje końcową rozdzielczość 0,1 μm na piksel. Kamery EMCCD oferują również czułość pozwalającą na wizualizację transfektantów GFP o niskim poziomie ekspresji.
2. Lasery: Do oświetlenia TIRF system 5 laserów dostarczających łącznie 6 linii laserowych (405, 440, 488, 514, 561 i 640 nm) jest sprzężony z włóknem jednomodowym (Solamere Technologies). Laser argonowy oraz laser DPSS pompowany diodami o długości fali 561 nm (linie 488, 514 i 561) są kierowane przez akustooptyczny programowalny filtr włóknowy (AOTF) w celu kontroli natężenia, podczas gdy natężenie laserów diodowych (405, 440 i 640 nm) jest kontrolowane poprzez modulację napięcia ich zasilaczy. Napięcie na AOTF oraz zasilaczach laserów diodowych jest sterowane za pomocą karty akwizycji danych (DAC) (Measurement Computing) przy użyciu oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices). Sprawność sprzężenia dla laserów diodowych wynosi 30%, natomiast dla laserów argonowego i DPSS wynosi ona około 60% ze względu na mniejsze średnice wiązki.
3. Moduł TIRF: Aby jednocześnie obrazować TCR i powiązane z nim cząsteczki sygnałowe, jak opisano wcześniej, niezbędne było zastosowanie oświetlenia TIRF skorygowanego chromatycznie, które nie wymagałoby ponownego wyrównania lub ponownego ustawienia ostrości podczas rejestracji emisji fluorescencji o różnych długościach fal. TIRFM osiągnięto stosując oświetlenie przez obiektyw, jak opisano wcześniej¹⁷. Kabel światłowodowy dostarczający światło laserowe do mikroskopu został zamocowany w uchwycie światłowodowym z regulacją XY, zamontowanym na napędzanej mikrometrem szynie optycznej do regulacji w osi Z (Thorlabs). Aby uzyskać oświetlenie TIRF, wiązka lasera jest ogniskowana w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu za pomocą systemu dwóch soczewek (L1 (soczewka kolimująca) i L2 (soczewka ogniskująca) na Rysunku 1), tak aby wiązka opuszczała obiektyw w sposób skolimowany. Zapewnia to, że wszystkie promienie światła wychodzące z obiektywu będą miały ten sam kąt względem płaszczyzny próbki. Końcówka światłowodu jest ustawiona w ognisku soczewki kolimującej. Przesuwając mikrometr wzdłuż szyny optycznej względem soczewki kolimującej (kierunek Z), można dostosować ogniskową wiązki, a za pomocą pokręteł regulacji XY można przesuwać wiązkę w pozycjach X i Y. Ze względu na bardzo małą tylną aperturę obiektywu 150 X, stwierdziliśmy, że aby osiągnąć TIRF, rozmiar plamki laserowej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej musi być mały. Aby uzyskać ogniskowanie niezbędne do wytworzenia małej plamki, konieczne były soczewki o krótkiej ogniskowej (Keir Neumann, komunikacja osobista); dlatego użyliśmy soczewki ogniskującej o ogniskowej około 108 mm, która została umieszczona w kostce dichroicznej bezpośrednio przed obiektywem. Soczewka kolimująca została umieszczona bliżej dzielnika wiązki, który wprowadzał oświetlenie TIRF. Aby zminimalizować niepożądane efekty chromatyczne, zastosowaliśmy dublety achromatyczne (soczewki skorygowane chromatycznie, wykonane z dwóch elementów soczewkowych z materiałów o różnych współczynnikach załamania) z powłokami antyrefleksyjnymi zarówno dla soczewki kolimującej, jak i ogniskującej (JML Optical). Ogniskowanie można zweryfikować, sprawdzając, czy wiązka opuszczająca obiektyw jest skolimowana, gdy znajduje się w centrum tylnej apertury, co powinno tworzyć zwartą plamkę na suficie pomieszczenia. Następnie przesuwa się pozycję ogniskowanej plamki w stronę krawędzi apertury (w kierunku Y), co powoduje zbieżność wiązki na płaszczyźnie obrazu pod dużymi kątami, aż w końcu zostanie osiągnięty kąt krytyczny dla całkowitego wewnętrznego odbicia. Używając tych komponentów optycznych, osiągnęliśmy jednoczesną kolimację dla wszystkich długości fal od 442 do 640 nm przy tym samym wyrównaniu. Pojedyncze wyrównanie optyczne pozwoliło nam zatem na jednoczesne przeprowadzanie TIRFM w wielu długościach fal.
4. Aparat z dwiema kamerami: Jednoczesną akwizycję odrębnych emisji fluorescencji pochodzących z dwóch różnych fluoroforów osiągnięto poprzez budowę systemu z dwiema kamerami, który rozdziela emisję na dwa zakresy długości fal za pomocą luster dichroicznych (Rysunek 2). Emitowane światło jest odbijane z obiektywu i wychodzi prawym portem mikroskopu. Ponieważ większość obiektywów posiada korekcję do nieskończoności (obrazy powstają w nieskończoności), do ogniskowania obrazu wymagana jest soczewka tubusowa. Aby jednocześnie manipulować dwiema długościami fal emisji, usunięto soczewkę tubusową z prawego portu. Zamontowano niestandardowy adapter z gwintem c-mount (Sutter Instruments), który połączono z uchwytem lustra dichroicznego (Edmund Optics). W uchwycie tym zainstalowano lustra dichroiczne oddzielające emisję GFP od emisji barwników organicznych użytych do znakowania TCR (Alexa546, Alexa647 itp.). Za tym modułem, w obu torach świetlnych, znajdował się uchwyt soczewki tubusowej, uchwyt filtra emisji oraz tubusy przedłużające. Soczewki tubusowe (TL1 i TL2 (Rysunek 2)) mają ogniskową 180 mm. Szczeliny w tubusach przedłużających prowadzących do kamer EM CCD zostały zaklejone czarnym papierem, aby osłonić kamery przed światłem rozproszonym. Aby umożliwić wyrównanie obu kanałów, kamery zamontowano na dwóch niestandardowych statywach translacyjnych XYZ (Holmarc Products).

Poniżej opisujemy sposób ustawienia mikroskopu do jednoczesnego obrazowania dwukanałowego. Procedura obejmuje dopasowanie oświetlenia TIRF, regulację mocy lasera oraz wyrównanie dwóch obrazów wyjściowych przy użyciu mikrokulek o rozmiarach poniżej rozdzielczości.

1. Przed rozpoczęciem pracy należy włączyć wszystkie komponenty mikroskopu. Następnie uruchamia się komputer oraz oprogramowanie i upewnia się, że wszystkie komponenty sprzętowe są rozpoznawane przez oprogramowanie.
2. W celu zastosowania jako wzorca kolokalizacji, należy rozcieńczyć 1 μL mikrosfer fluorescencyjnych Fluoresbrite Multi-fluorescent Microspheres o rozmiarze poniżej rozdzielczości (0,2 μm) w 2 mL PBS, a następnie dodać 0,25 mL zawiesiny mikrosfer do każdej studni systemu szkiełek podstawowych z 8 komorami Lab-Tek II (Nunc). System szkiełek komorowych należy umieścić na platformie nad obiektywem. Następnie ustawia się ostrość na kulekach zaadsorbowanych do szkła.
3. Za pomocą wyrównania Y wprowadzenia włókna XYZ, położenie wiązki lasera należy przesunąć do środka tylnej apertury obiektywu. Ważne jest, aby wykonać tę czynność, gdy obiektyw znajduje się w pozycji, w której płaszczyzna szkła jest w ostrości. Jeśli wiązka nie jest skolimowana, należy wyregulować mikrometr Z, aby uzyskać pełną kolimację. Kolimację sprawdza się oddzielnie dla wszystkich linii laserowych, które będą wykorzystywane w eksperymencie. Na tym etapie moc lasera dla każdej linii mierzy się za pomocą watomierza laserowego i dostraja do wartości 20-30 μW w każdym kanale.

-Komórki T są niezwykle wrażliwe na promieniowanie laserowe, dlatego moc oświetlenia jest ograniczona do maksymalnie 50 μW.

4. Obrazy kuleczek pozyskuje się przy użyciu oświetlenia TIRF w trybie na żywo. Obracaj mikrometr wyrównania Y w module wprowadzającym światłowód tak, aby wiązka zaczęła oddalać się od sufitu, aż jej kąt względem osi optycznej obiektywu zbliży się do 90 stopni. Ostatecznie, po osiągnięciu kąta krytycznego dla TIR, światło lasera przestanie opuszczać obiektyw. Wyrównanie TIRF ocenia się następnie poprzez ustawianie ostrości w górę i w dół przez płaszczyznę szkiełka podstawowego. Jeśli widoczne są kuleczki pływające w roztworze, należy dalej zwiększyć kąt wiązki względem normalnej obiektywu. Przy prawidłowym ustawieniu TIRF w ostrości znajdzie się tylko jedna płaszczyzna optyczna (tj. tylko kuleczki zaadsorbowane na szkiełku podstawowym). Bardziej precyzyjne sprawdzenie wyrównania TIRF można przeprowadzić podczas obrazowania limfocytów T barwionych barwnikiem powierzchniowym, które rozprzestrzeniły się na powierzchni. (Patrz punkt 3.4)).
5. Po uzyskaniu oświetlenia TIRF można wyrównać oba kanały względem siebie. Ustaw ostrość na kuleczkach i porównaj położenie charakterystycznych cech na obrazach uzyskanych w obu kanałach. Używając śrub mikrometrycznych X i Y w jednym statywie kamery, zbliż względne położenie kuleczek tak bardzo, jak to możliwe. Zapisz obrazy z obu kanałów. Obrazy te posłużą jako standard kolokalizacji do wyrównania obu kanałów.
6. Konieczne jest również wyrównanie kamer tak, aby były one parfokalne względem siebie. Osiąga się to poprzez pozyskanie zestawu obrazów kuleczek poniżej rozdzielczości, które są oddzielone od siebie w kierunku Z o 100 nm. Jeśli piksel o maksymalnej intensywności dla kuleczek znajduje się w tej samej płaszczyźnie dla obu kamer, oznacza to, że są one parfokalne.

3. Obrazowanie

Po przygotowaniu mikroskopu kolejnym zadaniem jest przygotowanie komór przepływowych zawierających wsparte na szkle dwuwarstwy lipidowe prezentujące antygen i cząsteczki adhezyjne, zgodnie z wcześniejszym opisem ⁶, a następnie przeprowadzenie TIRFM limfocytów T po transfekcji wchodzących w interakcję z podłożem. Postępowano zgodnie z opublikowanym protokołem tworzenia dwuwarstw^5-6, z wyjątkiem tego, że liposomy nie były inkubowane przez 20 minut na szkiełku nakrywce po złożeniu komory przepływowej. Zamiast tego, bezpośrednio po montażu, przez komórkę przepływową przepuszczono bufor HBS-BSA.

1. Złożyć komorę przepływową z płaskimi dwuwarstwami lipidowymi utworzonymi na szklanej lamellipse zawierającej lipidy Ni-NTA. Cząsteczki adhezyjne, ICAM-1 (100 cząsteczek/μm²), oraz kompleksy peptyd-MHC, I-E^k obciążone MCC (5-10 cząsteczek/μm²), są wbudowane w dwuwarstwę za pomocą ich znaczników histydynowych. Kostymulująca cząsteczka CD80 jest dodawana przy użyciu kotwicy GPI (100 cząsteczek/μm²).
2. Umieścić celę przepływową na stoliku mikroskopu i ustabilizować ją. Przymocować do celi przepływowej element grzejny dostarczony przez producenta w celu kontroli jej temperatury. Ustawić obiektyw nad dwuwarstwą i wyostrzyć obraz płaszczyzny dwuwarstwy. Włączyć podgrzewanie obiektywu i celi przepływowej, aby ustabilizować temperaturę w komorze na poziomie 37 °C.
3. Transfekowane limfocyty T są wirowane po 4 godzinach inkubacji z prędkością 80x g i resuspendowane w buforze HBS-BSA uzupełnionym o 10 μg/mL fragmentu Fab H57 lub 20 μg/mL jednoczynnikowego fragmentu zmiennego (scFv) H57 w celu znakowania TCR. Następnie komórki są wstrzykiwane do cel przepływowych. Obrazowanie odbywa się w stałej obecności Fab lub scFv ze względu na ich wysoką stałą dysocjacji. Ich obecność w medium nie zwiększa znacząco tła, ponieważ pole TIRF jest bardzo cienkie.
4. Warunki obrazowania są ustawione tak, aby dwukanałowa akwizycja na żywo wyświetlała podgląd kanałów TCR i GFP, co ułatwia wyszukiwanie transfekowanych komórek. Oświetlenie TIRF jest potwierdzane poprzez przesunięcie ostrzenia w górę płaszczyzny szklanej w celu wykrycia ewentualnego bocznego barwienia błony. Jeśli boczne błony nie wchodzą w ostrość, oznacza to, że ustawienie TIRF jest prawidłowe. Następnie transfekowane komórki są obrazowane pojedynczo lub w sekwencji obrazów w celu stworzenia filmów.

4. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

Oprogramowanie generuje obrazy z dwóch kamer w jednej ramce. Wyjście z każdej kamery ma rozdzielczość 512 x 512 pikseli; w związku z tym obraz wyjściowy ma rozmiar 1024 x 512 pikseli. Obrazy muszą zostać najpierw podzielone na pojedyncze klatki odpowiadające obu kamerom. Obrazy kulek subrozdzielczych z dwóch kanałów są nakładane na siebie, a następnie wyznacza się parametry dopasowania. Cechą charakterystyczną dla naszego systemu jest obrót jednego kanału o 1 stopień względem drugiego (patrz Rycina 3). Najbardziej prawdopodobną przyczyną tego obrotu są statywy kamer. Po tym obrocie należy przeprowadzić dalsze względne przekształcenia liniowe w osiach X i Y, aby idealnie dopasować kulki względem siebie. W każdym eksperymencie pozyskuje się obrazy kulek w celu wyznaczenia precyzyjnych parametrów dopasowania obu kanałów. Te przekształcenia liniowe i rotacyjne są następnie stosowane do wszystkich obrazów, które następnie poddawane są algorytmom segmentacji i analizie ko-lokalizacji.

5. Reprezentatywne wyniki

Opisany tutaj system można dostosować do badania sygnalizacji w dół dowolnego receptora w błonie plazmatycznej. Jest on szczególnie pomocny w badaniu sygnalizacji TCR, ponieważ sygnalizacja ta zachodzi w rozdzielczych optycznie skupiskach zwanych mikroskupiskami TCR lub w endosomach, jak opisano niedawno¹⁸. Gdyby sygnalizacja zachodziła w skupiskach receptorów poniżej granicy rozdzielczości lub w receptorach nieutworzonych w skupiska, do interpretacji danych konieczne byłoby przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów. Jak wspomniano wcześniej, łańcuchy CD3 kompleksu TCR ulegają fosforylacji przez kinazę z rodziny Src, Lck, po zaangażowaniu TCR przez kompleksy peptyd-MHC. Sfosforylowany łańcuch CD3ζ rekrutuje następnie kinazę z rodziny Syk, Zap70. Wizualizacja rekrutacji Zap70 informuje zatem o stanie fosforylacji łańcucha CD3ζ. Siłę stymulacji TCR można zmieniać, stosując peptydy zmutowane w miejscach kontaktu z TCR. Takie peptydy nazywa się zmodyfikowanymi ligandami peptydowymi (APLs). Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rysunku 4, gdzie peptydy agonistyczne skutecznie rekrutują Zap70 do mikroskupisk TCR, podczas gdy peptyd o niższej sile działania T102L nie rekrutuje Zap70 do mikroskupisk TCR, co dowodzi, że w tym przypadku łańcuch CD3ζ nie uległ fosforylacji. Mogliśmy wyciągnąć taki wniosek, ponieważ wystarczyło zaobserwować rekrutację Zap70 do skupisk TCR, które były łatwo wykrywalne za pomocą TIRFM. Do policzenia liczby mikroskupisk Zap70 na komórkę zastosowano zautomatyzowany algorytm segmentacji. W filmie uzupełniającym pokazano również jednoczesne obrazowanie fluorescencji związanej z TCR i Zap70. Należy zwrócić uwagę na dynamiczny charakter lamelipodium.

Rysunek 1. Zdjęcie i schemat autorskiego modułu wprowadzania światła TIRF. Panel A przedstawia fotografię modułu TIRF zainstalowanego na mikroskopie, a Panel B jest schematem modułu TIRF obrazującym drogę światła. Schemat i zdjęcie pokazują położenie soczewki zbierającej, dzielnika wiązki, wprowadzenia światłowodowego z regulacją w osiach X, Y i Z, soczewki kolimującej L1 oraz soczewki skupiającej L2 zainstalowanej w kostce dichroicznej oraz obiektywu TIRF. Wstawka przedstawia soczewkę skupiającą zainstalowaną w kostce dichroicznej.

Rycina 2. Zdjęcie i schemat systemu dwóch kamer. Panel A przedstawia zdjęcie systemu dwóch kamer przymocowanego do mikroskopu, a Panel B jest schematem tego samego układu. Schemat i zdjęcie pokazują położenie obiektywu, lustra, filtra dichroicznego, soczewek tubusowych TL1 i TL2, filtrów emisyjnych F1 i F2 oraz dwóch kamer C1 i C2 na statywach z ich odpowiednimi regulacjami w osiach X, Y i Z.

Rycina 3. Zastosowanie kulek poniżej rozdzielczości do wyrównania dwóch kanałów. Panele A i B przedstawiają nałożenie obrazów kulek poniżej rozdzielczości przed (Panel A) i po (Panel B) wyrównaniu. Panel A pokazuje, że jeden z kanałów jest obrócony względem drugiego. Panele C i D stanowią fragmenty obrazów z paneli A i B. Panel E przedstawia dwukanałowy obraz nałożony z komórkami bez przetwarzania. Parametry wyrównania zastosowane w panelu D zostały użyte do obrazu pokazanego w panelu F. Zauważmy, że lamelipodium z dwóch kanałów jest idealnie wyrównane w panelu F, a nie w panelu E. Pasek skali 4 μm dla wszystkich paneli.

Rycina 4. Rekrutacja Zap70 do mikroklastrów TCR w odpowiedzi na różne APL. Aktywowane in-vitro limfocyty T zostały transfektowane plazmidem kodującym Zap70 połączone z GFP i inkubowane na szklanych podłożach z nanowarstwami Ni-NTA zawierającymi 6 cząsteczek/μm² obciążonego peptydem His-tagged-I-E^k, 100 cząsteczek/μm² sprzężonego z Alexa647 His-tagged ICAM-1 oraz 100 cząsteczek/μm² zakotwiczonego w GPI CD80. Obciążone peptydy wskazano na wstawce. ICAM-1 odnosi się do komórek na nanowarstwach zawierających 100 cząsteczek/μm² sprzężonego z Alexa-647 His-tagged ICAM-1. Mikroskopia TIRF z jednoczesną akwizycją dwukanałową była prowadzona w stałej obecności sprzężonego z Alexa546 fragmentu Fab H57 (nieblokującego) w celu barwienia TCR. Obrazy komórek wykonano do jednej godziny po początkowym kontakcie z nanowarstwą. Liczbę klastrów Zap70 na komórkę przeanalizowano za pomocą oprogramowania do automatycznego zliczania klastrów. W każdym przypadku przeanalizowano co najmniej 40 komórek. Pasek skali 2 μm dla wszystkich obrazów.

Rycina 5. Dopasowanie systemu dwóch kamer z wykorzystaniem dwóch różnych typów kamer. Panel przedstawia dopasowaną nakładkę obrazów kulek o rozmiarze poniżej rozdzielczości, wykonaną za pomocą systemu dwóch kamer o różnych rozmiarach pikseli (zielony: rozmiar piksela 6.45 μm obrazowany przy binningu 2x2 oraz czerwony: rozmiar piksela 16 μm obrazowany bez binningu). Wstawka przedstawia powiększony widok kwadratowego obszaru w centrum pola widzenia. Pasek skali 5 μm.

Film uzupełniający. Rekrutacja Zap70 do mikroklastrów TCR w odpowiedzi na peptyd agonistyczny. Aktywowane in vitro limfocyty T CD8+ zostały przetransfekowane plazmidem kodującym Zap70 połączone z GFP i inkubowane na szklanych warstwach lipidowych Ni-NTA zawierających 6 cząsteczek/μm² peptydu obciążonego His-tagged-I-E^k, 100 cząsteczek/μm² koniugatu Alexa647 z His-tagged ICAM-1 oraz 100 cząsteczek/μm² CD80 zakotwiczonego w GPI. Dwukanałowa jednoczesna akwizycja za pomocą mikroskopii TIRF była przeprowadzana w obecności koniugatu Alexa546 z fragmentem Fab H57 (nieblokującym) w celu barwienia TCR. Pole przetransfekowanych komórek obrazowano wielokrotnie (40 razy) z rozdzielczością czasową 10 sekund na klatkę. Pasek skali 2 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film uzupełniający.

Dyskusja

Opisujemy tutaj system do badania sygnalizacji w antygenowo specyficznych pierwotnych limfocytach T myszy z wykorzystaniem TIRFM oraz szklanych wspieranych dwuwarstw lipidowych jako sztucznych APC. Technika ta opiera się na pomyślnej ekspresji białek znakowanych GFP w tych komórkach. Transfekcja limfocytów T jest zawsze trudnym zadaniem. Zazwyczaj stosuje się elektroporację lub dostarczanie genów za pomocą retrowirusów lub lentiwirusów. Żadna z tych technik nie jest lepsza od pozostałych; każda z nich ma swoje ograniczenia i zalety. Stwierdzamy, że elektroporacja posiada następujące zalety: 1) komórki nie muszą aktywnie się dzielić, co jest wymagane w przypadku retrowirusów, ale nie lentiwirusów, oraz 2) poziom ekspresji można kontrolować poprzez zmianę czasu inkubacji komórek przed obrazowaniem. Największą wadą jest to, że ekspresja białek o dużym rozmiarze w komórkach pierwotnych jest bardzo trudna. Przedstawiliśmy metodę, która zapewnia bardzo dobrą żywotność komórek po elektroporacji. W rezultacie można ją zastosować do wyciszania genów za pomocą siRNA.

Opisujemy tutaj również dostosowany mikroskop TIRF z dwukanałową symultaniczną akwizycją, który jest skorygowany chromatycznie i nie wymaga osobnego ustawiania dla różnych długości fal. Możliwości te są jednak dostępne w rozwiązaniach komercyjnych. Nasz system opiera się na zasadach mikroskopii TIRF opublikowanych przez ekspertów w tej dziedzinie i jest tańszy niż alternatywy komercyjne. Jedną z możliwych krytyk naszej konstrukcji może być fakt, że stosujemy ten sam kąt padania dla różnych długości fal wzbudzenia. Wynikowałoby to z różnej głębokości penetracji TIRF dla różnych długości fal wzbudzenia. Uważamy, że efekty te są niewielkie, ponieważ fala ewanescentna jest polem zanikającym wykładniczo, a głębokość pola TIRF jest funkcją liniową długości fali. Fluorofory znajdujące się blisko powierzchni szkła nie odczują różnicy w intensywności lasera między dwiema długościami fal. Dla fluoroforów znajdujących się w pobliżu głębokości penetracji, różnica intensywności wyniesie 1,3-krotność dla długości fal 488 i 640 nm oraz 1,15-krotność dla długości fal 488 i 561 nm. Ten sam system może być stosowany w połączeniu z technikami superrozdzielczości, które wykorzystują oświetlenie TIRF.

Opisaliśmy również system dwukamerowy wykonany na specjalne zamówienie. Podobnie jak w przypadku systemu TIRF, analogiczne urządzenia są dostępne w sprzedaży. Nasz system oferuje elastyczność w kwestii wymiany filtrów i luster dichroicznych, co umożliwia jego zastosowanie z różnymi kombinacjami długości fal. Wadą naszego systemu jest konieczność rotacji w jednej osi w celu wyrównania dwóch obrazów. Problem ten można rozwiązać, stosując statywy kamer sterowane piezoelektrycznie, które oferują możliwość regulacji kąta obrotu. Z sukcesem zaimplementowaliśmy w tym mikroskopie system dwukamerowy, w którym zastosowano różne kamery o odmiennych rozmiarach pikseli. Taki system byłby przydatny w sytuacjach, gdy wymagana jest wysoka czułość w jednym kanale i szeroki zakres dynamiczny w drugim, co rzadko zdarza się w przypadku jednej kamery. Użyliśmy kamery Photometrics HQ-2 z binningiem 2x2, co dało efektywny rozmiar piksela 12,9 μm, oraz kamery Photometrics Quant-EM, która posiada rozmiar piksela 16 μm. Dla kamery Quant-EM zastosowano soczewkę tubusową o ogniskowej 180 mm, a dla kamery HQ-2 soczewkę tubusową o ogniskowej 145 mm. Kamera HQ-2 była sterowana za pomocą oprogramowania Metamorph, natomiast Quant-EM była sterowana poprzez oprogramowanie micro-manager na osobnym komputerze w trybie wyzwalania zewnętrznego. Sygnał wyzwalający dla kamery Quant-EM był dostarczany przez wyjście cyfrowe karty DAC systemu measurement computing, co zostało zaimplementowane jako dodatkowa migawka w ustawieniach konfiguracji oświetlenia programu Metamorph. Stosunek ogniskowych soczewek tubusowych odpowiada stosunkowi efektywnych rozmiarów pikseli. Reprezentatywne wyrównanie przedstawiono na Rysunku 5.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Amaxa Nucleofector do limfocytów T mysich	Lonza Inc.	VPA-1006
Zestaw PureLink HiPure Plasmid Midiprep	Life Technologies	K2100-05	Do preparatyki DNA wolnego od endotoksyn
Urządzenie Amaxa Nucleofector	Lonza Inc.	AAD-1001
Rekombinowana mysia IL-2	PeproTech Inc	212-12
Wielobarwne fluorescencyjne mikrosfery Fluoresbrite 0,20μm	Polysciences, Inc.	24050-5
Szkiełka nakrywki z 8 komorami Lab-Tek II	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155409