Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

30.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3894

⸱

21 lutego 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Pathogenesis Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 2Tick-Borne Diseases Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

W tym artykule

Podsumowanie

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Streszczenie

Kleszcze występują na całym świecie i zarażają ludzi wieloma chorobami odkleszczowymi. Kleszcze są wektorami patogenów wywołujących boreliozę i nawracającą gorączkę kleszczową (Borrelia spp.), plamistą gorączkę Górskich Skał (Rickettsia rickettsii), ehrlichiozę (Ehrlichia chaffeensis i E. equi), anaplazmozę (Anaplasma phagocytophilum), zapalenie mózgu (wirus kleszczowego zapalenia mózgu), babeszjozę (Babesia spp.), gorączkę kleszczową Kolorado (Coltivirus) oraz tularemię (Francisella tularensis) 1-8. Aby zostać prawidłowo przeniesionymi do gospodarza, czynniki zakaźne te różnicowo regulują ekspresję genów, oddziałują z białkami kleszcza i migrują przez jego organizm 3,9-13. Na przykład czynnik wywołujący boreliozę, Borrelia burgdorferi, adaptuje się poprzez różnicową ekspresję genów do etapów sytości i głodu w cyklu enzootycznym kleszcza 14,15. Ponadto, gdy kleszcz z rodzaju Ixodes spożywa posiłek z krwi, Borrelia namnażają się i migrują z jelita środkowego do hemocelu, skąd przedostają się do gruczołów ślinowych i są przenoszone do gospodarza wraz z wydzielaną śliną 9,16-19.

Kiedy kleszcz żeruje, organizm gospodarza zazwyczaj reaguje silną odpowiedzią hemostatyczną i wrodzoną odpowiedzią immunologiczną 11,13,20-22. Pomimo tych reakcji gospodarza, I. scapularis może żerować przez kilka dni, ponieważ ślina kleszcza zawiera białka o działaniu immunomodulującym, czynniki lityczne, przeciwkrzepliwe oraz fibrinolityczne, które wspomagają żerowanie kleszcza 3,11,20,21,23. Działania immunomodulujące śliny kleszcza lub ekstraktu z gruczołów ślinowych (SGE) ułatwiają transmisję, proliferację i rozprzestrzenianie się licznych patogenów przenoszonych przez kleszcze 3,20,24-27. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób infekcyjne czynniki przenoszone przez kleszcze wywołują chorobę, niezbędne jest przeprowadzenie sekcji aktywnie żerujących kleszczy i pobranie ich śliny. Niniejszy protokół wideo prezentuje techniki sekcji w celu pobrania hemolimfy i usunięcia gruczołów ślinowych z aktywnie żerujących nimf I. scapularis po 48 i 72 godzinach od umieszczenia na myszy. Prezentujemy również metodę pobierania śliny od dorosłej samicy kleszcza I. scapularis.

Protokół

1. Pobieranie hemolimfy do przygotowania preparatów

(Film 1)

  1. Ostrożnie usuń aktywnie żerujące kleszcze z organizmu zwierzęcia, umieść je w 3% nadtlenku wodoru do stosowania miejscowego na 5 minut, a następnie w 70% etanolu na 10 minut w celu sterylizacji powierzchniowej.
  2. Za pomocą pisaka do cytologii (pap pen) narysuj okrąg na szkiełku mikroskopowym powleczonym silanem i umieść kleszcza wewnątrz tego okręgu.
    1. Szkiełka powleczone silanem stosuje się, aby zapewnić najlepszą adhezję hemolimfy do szkiełka mikroskopowego.
  3. Obejrzyj kleszcza pod mikroskopem stereoskopowym (obiektyw 1X, okular 10X, powiększenie 3,5X).
  4. Delikatnie naciśnij pęsetą na grzbiet kleszcza, aby rozsunąć jego odnóża i unieruchomić zwierzę.

Uwaga: Podczas unieruchamiania kleszcza nie należy naciskać zbyt mocno, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia jelita środkowego lub przebicia kleszcza i zanieczyszczenia hemolimfy.

  1. Amputować nogę lub nogi kleszcza w stawie dystalnym za pomocą jednorazowego skalpela z cienkim ostrzem. Aby określić zakaźność poprzez hemolimfę, wystarczy amputować tylko jedną nogę. W celu pobrania hemolimfy na szkiełko przedmiotowe można amputować kilka nóg.

Uwaga: Nie należy odcinać odnóża zbyt blisko ciała, ponieważ może to spowodować zanieczyszczenie hemolimfy treścią z jelita środkowego.

  1. Po odcięciu jednej lub wszystkich nóg należy kontynuować delikatne uciskanie grzbietu kleszcza, aby hemolimfa wydzieliła się z nóg na szkiełko. Delikatnie przesuwać kleszcza po szkiełku, aby rozprowadzić hemolimfę.

2. Usunięcie gruczołu ślinowego

(Filmy 2 i 3)

  1. Nanieś kilka kropel PBS (fosforanowego buforu soli) o objętości 25 μl na szkiełko przedmiotowe i umieść kleszcza w jednej z kropli PBS.
  2. Obejrzyj kleszcza pod mikroskopem stereoskopowym (obiektyw 1X, okular 10X, powiększenie 3,5X).
  3. Unieruchom kleszcza za pomocą pęsety z cienkim czubkiem, trzymając go za basis capitulum (aparat gębowy) lub za tylną część ciała.
  4. Wprowadź pęsetę z cienkim czubkiem w tylną część kleszcza i przetnij grzbiet, aby odsłonić narządy. W razie potrzeby w tym momencie można usunąć jelito środkowe i przenieść je do nowej kropli PBS na szkiełku przedmiotowym lub do probówki do wirówki zawierającej PBS.
  5. Zlokalizuj parę gruczołów ślinowych (skupiska przypominające winogrona) rozmieszczonych obustronnie wzdłuż odnóży kleszcza. Jeśli gruczoły ślinowe nie są widoczne wśród szczątków kleszcza, przenieś główną część ciała kleszcza, w której wciąż znajdują się gruczoły ślinowe, do nowej kropli PBS, aby ograniczyć zanieczyszczenie i zapobiec utracie gruczołów.

Uwaga: Na wczesnym etapie żerowania gruczoły ślinowe są trudniejsze do zlokalizowania, ponieważ nie są tak rozwinięte jak w późniejszej fazie karmienia.

  1. Usunąć gruczoły ślinowe z kleszcza za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami i umieścić je w nowej kropli PBS.
  2. Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieść gruczoły ślinowe do kolejnej czystej kropli 25 μl PBS; powtórzyć ten etap płukania jeszcze 3-4 razy, aby usunąć wszelkie zewnętrzne mikroorganizmy oraz resztki tkanek kleszcza.

Uwaga: clusters gruczółów ślinowych należy płukać delikatnie, aby zminimalizować straty i uszkodzenia poszczególnych gruczółów ślinowych.

  1. Umieść gruczoły w czystej kropli PBS na szkiełku pokrytym silanem lub w probówce do wirówki zawierającej PBS.

3. Pobieranie śliny

(Film 4)

  1. Tuż przed całkowitym odczepieniem się w pełni nasyconych kleszczy, około 5-7 dni po przymocowaniu, delikatnie usuń dorosłe samice z królika lub innego żywiciela, używając pęsety z cienkimi końcówkami.
  2. Przytwierdź niemal nasyconego kleszcza do jednego końca szkiełka przedmiotowego za pomocą taśmy klejącej. Taśmę należy umieścić mniej więcej w 3/4 długości grzbietu kleszcza w kierunku głowy, pozostawiając odsłoniętą podstawę kapituluma (części gębowe) kleszcza.
  3. W miejscu, gdzie taśma styka się z przednią krawędzią powierzchni grzbietowej kleszcza, nanieś pipetą 5 μl 5% roztworu pilokarpiny (w metanolu). Pozostaw pilokarpinę, aby została wchłonięta przez taśmę na grzbiet kleszcza, dbając o to, by pilokarpina nie miała kontaktu z podstawą kapituluma kleszcza.
  4. Przymocuj kawałek nietoksycznej plasteliny do szkiełka przedmiotowego w odległości około jednej uncji od części gębowych kleszcza.
  5. Używając pęsety z cienkimi końcówkami, odłam końcówkę dociąganej rurki kapilarnej28 do pożądanej średnicy.
  6. Obejrzyj podstawę kapituluma kleszcza pod mikroskopem stereoskopowym.
  7. Delikatnie wsuń hypostom kleszcza do dociąganej rurki kapilarnej, pozwalając, aby palpy szczękowe pozostały na zewnątrz rurki kapilarnej.
  8. Wciśnij przeciwległy koniec rurki kapilarnej w plastelinę, aby utrzymać rurkę na miejscu.
  9. Umieść zamocowanego, śliniącego się kleszcza w ciemnej komorze o wysokiej wilgotności (np. w zamkniętym pudełku styropianowym wyłożonym mokrymi ręcznikami papierowymi). Przechyl szkiełko tak, aby hypostom był skierowany w stronę dna pojemnika, co pozwoli grawitacji wspomóc zbieranie śliny.
  10. Pozostaw pojemnik w temperaturze pokojowej.
  11. Dokładnie monitoruj śliniące się kleszcze przez pierwszą godzinę i zbieraj ślinę w miarę jej wydzielania, wypychając ją z rurek kapilarnych za pomocą gruszki do pipety Pasteura. Po pierwszej godzinie sprawdzaj ilość nagromadzonej śliny co godzinę przez co najmniej 4 godziny. Kontynuuj zbieranie śliny w miarę jej wydzielania.

Uwaga: Pobieranie śliny można przerwać po zebraniu ilości wystarczającej do przeprowadzenia planowanego badania.

  1. Jeśli kleszcze nie ślinią się lub jeśli wymagana jest większa ilość śliny, ślinienie można sporadycznie indukowć, masując hypostom za pomocą rurki kapilarnej.
  2. Do śliny dodać 0,1 objętości koktajlu inhibitorów proteaz i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.

4. Reprezentatywne wyniki

Film 1 demonstruje sposób trzymania częściowo nasyconej nimfy I. scapularis oraz amputacji odnóży w celu zebrania hemolimfy na szkiełko mikroskopowe. Po amputacji odnóża wydzielany jest przezroczysty płyn (rycina 1A i 1B). W przypadku przerwania jelita środkowego hemolimfa wypływająca z amputowanych odnóży jest mętna (rycina 1C i 1D).

Ekstrakcję gruczołów ślinowych po 48 lub 72 godzinach żerowania nimfy przedstawiono w filmach 2 i 3. Po nakłuciu kleszcza zazwyczaj powstaje dużo zanieczyszczeń (składających się z tchawicek, cewek Malpighiego, krwi, tkanki łącznej itp.); aby zapobiec utracie lub uszkodzeniu gruczołów ślinowych, należy przenieść kleszcza do świeżej porcji PBS. Rysunki 2A i 2B pokazują położenie gruczołów ślinowych po rozcięciu nimfy, a rysunek 2C przedstawia wyizolowane skupiska gruczołów ślinowych w PBS.

Przygotowanie do pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis pokazano w filmie 4 i na rysunku 3. Kleszcz wydzielający ślinę do kapilary widoczny jest w filmie 5. Ta metoda pobierania śliny wykorzystuje pilokarpinę w celu stymulacji saliwacji i pozwala na uzyskanie ponad 20 μl śliny z jednej dorosłej samicy kleszcza.

Schemat anatomii kleszcza; oznaczone gruczoły ślinowe, hypostom, grzbiet, jelito środkowe; biologia edukacyjna.
Rycina 1. Oznaczone struktury nimfy I. scapularis.

Film 1. Ixodes scapularis pobieranie hemolimfy. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Proces sekcji kleszcza; obraz mikroskopowy; badania biologiczne; metoda badania w parazytologii.
Rycina 2. Niezanieczyszczona (A i B) oraz zanieczyszczona (C i D) hemolimfa wypływająca z nogi nimfy.

Film 2. Wyizolowanie gruczołów ślinowych z nimfy I. scapularis karmionej przez 48 godzin.Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 3. Ekstrakcja gruczołów ślinowych z nimfy I. scapularis karmionej przez 72 godziny. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Proces żerowania kleszczy; powiększone obrazy mikroskopowe; etapy przytwierdzania się pasożyta i pobierania posiłku krwi.
Rycina 3. Ixodes scapularis gruczoły ślinowe nimfy. (A i B) Przykłady gruczołów ślinowych u nimfy żerującej przez 72 h, przed ekstrakcją. (C) Wyizolowany zespół gruczołów ślinowych.

Film 4. Przygotowanie do pobierania śliny od dorosłej samicy kleszcza I. scapularis. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Proces przytwierdzania kleszcza, układ eksperymentalny z szkiełkami, narzędzie do usuwania kleszczy, analiza preparatu.
Rycina 4. Pobieranie śliny od dorosłych samic kleszczy I. scapularis. (A i B) Kleszcz zamocowany na szkiełku z hypostomem w wyssawanym końcu rurki kapilarnej, przy czym koniec niewyssawany rurki kapilarnej jest unieruchomiony plasteliną. (C i D) Komora nawilżana zawierająca saliwujących dorosłe samice kleszczy I. scapularis.

Film 5. Ixodes scapularis samica kleszcza saliwująca do rurki kapilarnej. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny kleszczy jest istotne w badaniu transmisji, rozpowszechnienia, dysseminacji, proliferacji i przetrwania patogenów przenoszonych przez kleszcze zarówno w organizmie kleszcza, jak i gospodarza 6,11-13,20,23,29. Istnieje kilka metod sekcji kleszcza30,31. Jednak podczas pobierania gruczołów ślinowych kluczowe jest prawidłowe przeprowadzenie sekcji, aby gruczoły te nie zostały przerwane ani zagubione w szczątkach kleszcza. Po usunięciu gruczołów ślinowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować pracownikom Oddziału Zasobów Zwierzęcych Dywizji Chorób Przenoszonych przez Wektory, a w szczególności Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien i Johnowi Liddellowi za opiekę nad myszami i królikami oraz ich utrzymanie. Chcielibyśmy również podziękować Amy Ullmann, Theresie Russell i Barbarze J. Johnson za ich wkład w przygotowanie niniejszego manuskryptu. Na koniec pragniemy podziękować Alissie Eckert z Biura Zastępczego Dyrektora ds. Komunikacji w CDC za przygotowanie ilustracji graficznych oraz Judy Lavelle za nadzór nad wszystkimi kwestiami prawnymi związanymi z filmowaniem materiału do niniejszego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH312-500
EtanolAcros Organics61509-5000
PBSBoston BioproductsBM-2205
Precyzyjna pęseta Dumont (3C)Fisher ScientificNC9906085
Lamelki mikroskopowe traktowane silanemBioworld42763007-1
Pisak PAPBioworld21750008-1
Lamelki mikroskopowe Super Frost PlusFisher Scientific12-550-18
PilocarpinaSigma-AldrichP6503-5G
Koktajl inhibitorów proteazSigma-AldrichP2714
Jednorazowy skalpel #11Feather Safety Razor Co, Ltd.2975#11
Nietoksyczna glina modelarskaFisher ScientificS17307
KapilaryChase Scientific Glass, Inc.40A502

Bibliografia

  1. Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
  2. Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
  3. Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. Vector-host interactions in disease transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).
  4. Estrada-Pena, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).
  5. Nuttall, P. A. Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus. Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).
  6. Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. Enhancement of virus transmission by tick salivary glands. J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).
  7. Labuda, M., Nuttall, P. A. Tick-borne viruses. Parasitol. 129, 221-245 (2004).
  8. Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. Update on tick-borne bacterial diseases in Europe. Parasite. 16, 259-273 (2009).
  9. Zhang, L., et al. Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph. PLoS Pathog. 7, e1002079(2011).
  10. Piesman, J., Schneider, B. S. Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks. Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).
  11. Brossard, M., Wikel, S. K. Tick immunobiology. Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).
  12. Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo. Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).
  13. Nuttall, P. A., Labuda, M. Tick-host interactions: saliva-activated transmission. Parasitol. 129, 177-189 (2004).
  14. Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host. FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).
  15. Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis. Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).
  16. Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).
  17. Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).
  18. Piesman, J. Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi. Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).
  19. De Silva, A. M., Fikrig, E. Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).
  20. Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).
  21. Brossard, M., Wikel, S. K. Immunology of interactions between ticks and hosts. Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).
  22. Wikel, S. K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).
  23. Binnington, K. C., Kemp, D. H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).
  24. Guo, X., et al. Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).
  25. Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils. Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).
  26. Lima, C. M., et al. Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut. J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).
  27. Severinova, J., et al. Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice. Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).
  28. How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM (2009).
  29. Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts. Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).
  30. Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544(2011).
  31. Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide. Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).
  32. Ledin, K. E., et al. Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum. Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).
  33. Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva? Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).
  34. Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods. J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).
  35. Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Disekcja gruczołów ślinowychpobieranie ślinydyssekcja kleszczasólstropatyczny bufor fosforanowystymulacja pilokarpinąkapilaraanaliza immunofluorescencyjnamikroskopia konfokalna
Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.