Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kleszcze występują na całym świecie i zarażają ludzi wieloma chorobami odkleszczowymi. Kleszcze są wektorami patogenów wywołujących boreliozę i nawracającą gorączkę kleszczową (Borrelia spp.), plamistą gorączkę Górskich Skał (Rickettsia rickettsii), ehrlichiozę (Ehrlichia chaffeensis i E. equi), anaplazmozę (Anaplasma phagocytophilum), zapalenie mózgu (wirus kleszczowego zapalenia mózgu), babeszjozę (Babesia spp.), gorączkę kleszczową Kolorado (Coltivirus) oraz tularemię (Francisella tularensis) 1-8. Aby zostać prawidłowo przeniesionymi do gospodarza, czynniki zakaźne te różnicowo regulują ekspresję genów, oddziałują z białkami kleszcza i migrują przez jego organizm 3,9-13. Na przykład czynnik wywołujący boreliozę, Borrelia burgdorferi, adaptuje się poprzez różnicową ekspresję genów do etapów sytości i głodu w cyklu enzootycznym kleszcza 14,15. Ponadto, gdy kleszcz z rodzaju Ixodes spożywa posiłek z krwi, Borrelia namnażają się i migrują z jelita środkowego do hemocelu, skąd przedostają się do gruczołów ślinowych i są przenoszone do gospodarza wraz z wydzielaną śliną 9,16-19.
Kiedy kleszcz żeruje, organizm gospodarza zazwyczaj reaguje silną odpowiedzią hemostatyczną i wrodzoną odpowiedzią immunologiczną 11,13,20-22. Pomimo tych reakcji gospodarza, I. scapularis może żerować przez kilka dni, ponieważ ślina kleszcza zawiera białka o działaniu immunomodulującym, czynniki lityczne, przeciwkrzepliwe oraz fibrinolityczne, które wspomagają żerowanie kleszcza 3,11,20,21,23. Działania immunomodulujące śliny kleszcza lub ekstraktu z gruczołów ślinowych (SGE) ułatwiają transmisję, proliferację i rozprzestrzenianie się licznych patogenów przenoszonych przez kleszcze 3,20,24-27. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób infekcyjne czynniki przenoszone przez kleszcze wywołują chorobę, niezbędne jest przeprowadzenie sekcji aktywnie żerujących kleszczy i pobranie ich śliny. Niniejszy protokół wideo prezentuje techniki sekcji w celu pobrania hemolimfy i usunięcia gruczołów ślinowych z aktywnie żerujących nimf I. scapularis po 48 i 72 godzinach od umieszczenia na myszy. Prezentujemy również metodę pobierania śliny od dorosłej samicy kleszcza I. scapularis.
Protokół
1. Pobieranie hemolimfy do przygotowania preparatów
(Film 1)
- Ostrożnie usuń aktywnie żerujące kleszcze z organizmu zwierzęcia, umieść je w 3% nadtlenku wodoru do stosowania miejscowego na 5 minut, a następnie w 70% etanolu na 10 minut w celu sterylizacji powierzchniowej.
- Za pomocą pisaka do cytologii (pap pen) narysuj okrąg na szkiełku mikroskopowym powleczonym silanem i umieść kleszcza wewnątrz tego okręgu.
- Szkiełka powleczone silanem stosuje się, aby zapewnić najlepszą adhezję hemolimfy do szkiełka mikroskopowego.
- Obejrzyj kleszcza pod mikroskopem stereoskopowym (obiektyw 1X, okula....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny kleszczy jest istotne w badaniu transmisji, rozpowszechnienia, dysseminacji, proliferacji i przetrwania patogenów przenoszonych przez kleszcze zarówno w organizmie kleszcza, jak i gospodarza 6,11-13,20,23,29. Istnieje kilka metod sekcji kleszcza30,31. Jednak podczas pobierania gruczołów ślinowych kluczowe jest prawidłowe przeprowadzenie sekcji, aby gruczoły te nie zostały przerwane ani zagubione w szczątkach kleszcza. Po usunięciu gruczołów ślinowy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować pracownikom Oddziału Zasobów Zwierzęcych Dywizji Chorób Przenoszonych przez Wektory, a w szczególności Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien i Johnowi Liddellowi za opiekę nad myszami i królikami oraz ich utrzymanie. Chcielibyśmy również podziękować Amy Ullmann, Theresie Russell i Barbarze J. Johnson za ich wkład w przygotowanie niniejszego manuskryptu. Na koniec pragniemy podziękować Alissie Eckert z Biura Zastępczego Dyrektora ds. Komunikacji w CDC za przygotowanie ilustracji graficznych oraz Judy Lavelle za nadzór nad wszystkimi kwestiami prawnymi związanymi z filmowaniem materiału do niniejszego manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nadtlenek wodoru | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Etanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Precyzyjna pęseta Dumont (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Lamelki mikroskopowe traktowane silanem | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pisak PAP | Bioworld | 21750008-1 | |
| Lamelki mikroskopowe Super Frost Plus | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpina | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Koktajl inhibitorów proteaz | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Jednorazowy skalpel #11 | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nietoksyczna glina modelarska | Fisher Scientific | S17307 | |
| Kapilary | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
Bibliografia
- Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
- Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
- Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
