Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

Podsumowanie

Krzyżowania seksualne i izolacja potomstwa rekombinowanego są ważnymi narzędziami badawczymi w przypadku grzyba nitkowatego Fusarium graminearum. Przedstawiono techniki niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia tych procesów.

Streszczenie

Fusarium graminearum stało się systemem modelowym do badań nad rozwojem i patogennością grzybów nitkowatych. F. graminearum najłatwiej wytwarza owocniki, zwane peritecjami, na agarze marchwiowym. Peritecja zawierają liczne typy tkanek, powstające w określonych stadiach rozwoju peritecji. Obejmują one (w kolejności pojawiania się) formowanie się inicjałów peritecji (z których powstają strzępki askogenne), ścianę zewnętrzną, parafizy (sterylne grzybnie zajmujące centrum peritecji do czasu rozwoju worków), worki oraz askospory wewnątrz worków¹⁴. Rozwój każdej z tych tkanek jest oddzielony od siebie o około 24 godziny i stanowił podstawę badań transkryptomicznych podczas rozwoju płciowego^12,8. Bardziej szczegółowy opis rozwoju, zawierający fotografie każdego etapu, znajduje się w pracy Hallen et al. (2007). W niniejszej pracy przedstawiamy metody generowania i zbioru synchronicznie rozwijających się trawników peritecji do badań czasowych regulacji genów, rozwoju i procesów fizjologicznych. Chociaż metody te zostały opracowane konkretnie z myślą o F. graminearum, techniki te mogą być stosowane w przypadku wielu innych grzybów, pod warunkiem że owocowanie może zostać indukowane w kulturze i występuje pewna synchronizacja rozwoju. Niedawno dostosowaliśmy ten protokół do badania rozwoju płciowego F. verticillioides. Chociaż u tego gatunku poszczególne peritecja muszą być zbierane ręcznie, ponieważ nie udało się zindukować powstania trawnika rozwijających się peritecji, proces ten sprawdził się w badaniu rozwoju (Sikhakolli i Trail, niepublikowane).

Najważniejszą funkcją owocników grzybów jest rozprzestrzenianie zarodników. U wielu gatunków Ascomycota (grzybów workowych), zarodniki są wystrzeliwane z worka w wyniku generowania ciśnienia turgorowego wewnątrz worka, co powoduje wyrzut zarodników (oraz płynu epiplazmatycznego) przez otwór w wierzchołku worka^2,7. Nasze badania nad wymuszonym wyrzutem ascospor doprowadziły do opracowania „testu wyrzutu zarodników”, którego używamy do przesiewania mutacji w tym procesie. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły tego testu.

F. graminearum jest homotaliczny, a zatem może tworzyć ciała owocnikowe wobec braku kompatybilnego partnera. Przewagą homotalizmu jest brak konieczności krzyżowania w celu uzyskania potomstwa homozygotycznego pod względem konkretnej cechy, co ułatwiło badanie rozwoju seksualnego u tego gatunku^14,7. Niemniej jednak wygenerowano szczepy heterotaliczne, które mogą być wykorzystywane do krzyżowania^5,9. Możliwe jest również krzyżowanie szczepów homotalicznych w celu uzyskania mutantów dla kilku genów w jednym szczepie¹. Odbywa się to poprzez wspólne inokulowanie jednej szalki Petriego dwoma szczepami. W miejscu ich styku większość peritecji będzie rekombinantami (pod warunkiem, że mutacja w jednym ze szczepów rodzicielskich nie hamuje krzyżowania). Wraz z wiekiem peritecie przestają gwałtownie wyrzucać ascospory, a zaczynają wydzielać je masowo. Powstały wysięk zarodników (zwany cirrhusem) gromadzi się na wierzchołku peritecium i może zostać łatwo usunięty w celu odzyskania pojedynczych zarodników. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół ułatwiający identyfikację peritecji rekombinantnych oraz odzyskiwanie rekombinantnego potomstwa.

Protokół

1. Wytwarzanie peritecji

1. Zaszczep w centrum podłoża agarowego z marchewką¹⁰ w czarce Petriego o średnicy 6,0 cm szczepem produkcyjnym F. graminearum (zalecany PH-1).
2. Umieść zaszczepione czalki pod jasnymi lampami fluorescencyjnymi w temperaturze pokojowej (18-24 °C) i pozostaw do wzrostu, aż grzybnia osiągnie zewnętrzną krawędź czalki (3-5 dni). Komercyjne domowe lampy fluorescencyjne są wystarczające do stymulowania formowania i uwalniania owocników.
3. Delikatnie usuń grzybnię powietrzną za pomocą sterylnego wykałaczką.
4. Rozprowadź 1,0 ml 2,5 % roztworu Tween 60 na powierzchni za pomocą sterylnego szklanego wycieraczki lub zaokrąglonego końca sterylnego pręta szklanego.
5. Ponownie wystaw płytki na światło. Nie zabezpieczaj płytek Parafilmem.
6. Po 24 h powierzchnia płytek powinna mieć błyszczącą strukturę. Jeśli grzybnia pojawi się ponownie, zeskrob powierzchnię i ponownie nanieś roztwór Tween-60.
7. Obserwuj rozwój perytecji w ciągu kolejnego tygodnia. Pośrednie stadia rozwoju perytecium można pozyskać, delikatnie zeskrobując powierzchnię agaru, a następnie zamrozić je gwałtownie w celu ekstrakcji RNA (Rycina 1).
8. Dożrzałe zarodniki zgromadzą się na pokrywce płytki do 7. dnia. Początkowo będą one widoczne tylko pod stereomikroskopem, ale do 9. dnia osiągną gęstość wystarczającą, by były widoczne gołym okiem.

2. Test uwalniania ascospor

1. W 6. dniu po aplikacji roztworu Tween, za pomocą świdra do drewna wyciąć z agaru krążek o średnicy 1 cm. Alternatywnie można użyć skalpela do usunięcia fragmentu o podobnej wielkości. Krążek można przekroić na pół, a każdą z połówek umieścić na szklanym szkiełku mikroskopowym.
2. Ułożyć fragmenty tak, aby powierzchnia zawierająca ciała owocnikowe była prostopadła do powierzchni szkiełka, a zarodniki były wyrzucane wzdłuż szkiełka.
3. Umieścić szkiełko w komorze wilgotnościowej na noc pod oświetleniem. Zarodniki będą gromadzić się na szkiełku i będą widoczne gołym okiem następnego ranka (Rycina 2).
4. Nagromadzone zarodniki można spłukać ze szkiełka wodą i w razie potrzeby poddać kwantyfikacji.
5. Potencjalne inhibitory wyrzutu ascospór można badać, dodając je na tylną stronę bloku agarowego podczas przygotowywania testu. Tą techniką badano wcześniej niektóre inhibitory kanałów jonowych, które zmniejszają wyrzut zarodników¹⁵.

3. Generowanie potomstwa rekombinacyjnego

1. Rozpocznij krzyżowanie poprzez zaszczepienie agaru z marchwią dwoma szczepami F. graminearum (jednym Nit+ i jednym nit-), umieszczając punkty inokulacji po przeciwnych stronach szalki Petriego.
2. Gdy strzępki wypełnią powierzchnię, zeskrob część powietrzną i zastosuj roztwór Tween-60 zgodnie z powyższym opisem. Użyj markera, aby zaznaczyć na boku szalki Petriego miejsce, w którym strzępki się stykają.
3. Przenieś kultury do światła i inkubuj, aż rozwiną się peritecja i zaczną formować się cyrry z peritecji wzdłuż linii przecięcia obu kultur.
4. Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw w polu widzenia peritecja wzdłuż przecięcia obu kultur. Używając wysterylizowanej i zanurzonej w sterylnej wodzie szpilki entomologicznej, delikatnie dotknij końcówką szpilki cyrry wzdłuż tej granicy. Wilgoć na szpilce powinna sprawić, że cyrra przyklei się do niej.
5. Opłucz końcówkę szpilki z przyczepioną cyrrą w 200 μl sterylnej wody w probówce Eppendorf, aby wypłukać zarodniki.
6. Wypal szpilkę w płomieniu, ponownie ją zwilż i pobierz kolejną cyrrę. Pobierz od 10 do 15 cyrr, umieszczając każdą w oddzielnej probówce z wodą.
7. Krótko wymieszaj probówki z zawiesinami cyrr na wirówce typu vortex.
8. Pobierz pipetą 60 μl zawiesiny zarodników i nanieś na podłoże MMTS¹ na szalce Petriego o średnicy 9 cm. Rozprowadź zawiesinę sterylnym rozprowadzaczem typu „hockey stick”. Pozostałą zawiesinę zarodników można przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia i w razie potrzeby ponownie wysiać na podłoże.
9. Inkubuj w temperaturze pokojowej (światło nie jest wymagane) przez 3-5 dni, aż pojawią się bardzo małe kolonie (Rysunek 3). Wśród kolonii wystąpią dwa rodzaje fenotypów. Kolonie nit- będą miały rzadsze strzępki niż kolonie Nit+. Cyrry z rekombinantowych peritecji wykażą oba fenotypy kolonii w przybliżeniu w równych proporcjach. Odrzuć szalki, na których znajdują się kolonie tylko jednego fenotypu. Należy zauważyć, że czasami w wyniku segregacji innych czynników powstaje więcej niż dwa fenotypy.
10. Przenieś kolonie na agar V8 lub agar z marchwią w celu przechowywania. Przetestuj kolonie na agarze Czapek's Dox (szczepy nit- nie będą rosły na Czapek's Dox) oraz na PDA z chloranem (0,5 M chloran potasu; szczepy Nit+ nie będą rosły na PDA z chloranem), aby potwierdzić prawidłowy fenotyp. Zbadaj te kolonie pod kątem pożądanych właściwości.

4. Reprezentatywne wyniki

Wytwarzanie peritecji

Celem jest uzyskanie warstwy peritecji bez widocznej grzybni lub zarodników. Powierzchnia hodowli będzie przypominać czarny aksamit (Rycina 1). 24 h po zastosowaniu Tween powierzchni agaru powinien nadać lekki połysk. Jeśli grzybnia pojawi się ponownie, może to oznaczać, że płytka nie została wystarczająco zeskrobana, aby wywołać rozwój peritecji.

Wyrzut askospor

W badaniu zawsze należy zapewnić kilka bloków agaru z szczepem typu dzikiego. Jeśli nie nastąpi wyrzut zarodników, oznacza to, że peritecja są albo zbyt młode, albo zbyt stare. W przypadku zbyt starych peritecji na powierzchni hodowli pojawi się liczne grzybnia, nadając jej białawy odcień. Jeśli tak nie jest, mogą być one zbyt młode i badanie należy powtórzyć za 24 hr. Sporadycznie zdarza się, że hodowle nie wykazują prawidłowego wyrzutu, wówczas eksperyment trzeba powtórzyć. Należy upewnić się, że badanie jest przeprowadzane w odpowiednich warunkach oświetleniowych.

Potomstwo rekombinowane

Rekombinantne peritecja powinny stanowić większość peritecji wzdłuż styku obu szczepów. Zazwyczaj analizujemy 10 cirrhi z jednego skrzyżowania i co najmniej 4-6 z nich powinno być rekombinantami. Bardzo rzadko mutacja uniemożliwia kopulację szczepu. Jeśli jeden z rodziców wykazuje aberracyjny fenotyp wzrostu, wśród kolonii na MMTS może wystąpić więcej niż 2 fenotypy.

Rysunek 1. Etapy rozwoju peritecji na agarze marchwiowym. Po lewej, 72 h po zastosowaniu Tween. Zwróć uwagę na czerwony pigment oraz bardzo młode peritecje widoczne jako czarne ziarna na powierzchni. Po prawej, w 144 h, uformowały się dojrzałe peritecie. Zwróć uwagę na niemal całkowity brak grzybni powierzchniowej w obu kulturach.

Rysunek 2. Test wyrzutu zarodników. Pomarańczowy krążek agaru z marchewką jest zorientowany tak, aby zarodniki gwałtownie wyrzucane z dojrzałych peritecji na jego powierzchni mogły gromadzić się na powierzchni szkiełka przedmiotowego. Czas akumulacji 15 hr.

Rysunek 3. Różnice w wzroście między koloniami Nit+ a nit- na selektywnym podłożu MMTS. Kolonie nit- (groty strzałek) są mniejsze. Kolonie Nit+ (strzałki) wykazują intensywny wzrost. Fotografia wykonana po 7 dniach.

Dyskusja

F. graminearum jest szczególnie odpowiednim obiektem do badania rozwoju ciał owocnikowych ze względu na dostępność dobrze adnotowanego genomu (mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/ ;⁴) oraz dostępność mikromacierzy opartej na technologii Affymetrix⁶. Ułatwiło to identyfikację genów istotnych dla wyrzutu askospor^7,11,3. Przedstawione tutaj metody pozwolą badaczowi skupić się na konkretnym zestawie etapów rozwoju i funkcji podczas analizy genetycznej ciał owocnikowych F. graminearum. Metody te można również łatwo dostosować do pokrewnych grzybów, które mogą owocnikować w kulturze, a mogą one służyć jako standard badania rozwoju dla wielu innych typów ciał owocnikowych grzybów.

Zdolność do oceny fenotypu wyrzutu zarodników może być utrudniona u gatunków, w których zarodniki są małe i trudne do dostrzeżenia, takich jak F. graminearum. Zbieranie zarodników na czystym szkiełku ułatwia zarówno ocenę wizualną, jak i ilościową, ponieważ zarodniki można spłukać ze szkiełka i poddać kwantyfikacji. Niektóre gatunki grzybów wytwarzają śluz otaczający zarodniki, co sprawia, że nie można ich spłukać, lecz należy policzyć je mikroskopowo, gdy pozostają na szkiełku. Stwierdziliśmy, że dotyczy to gatunku Sclerotinia sclerotiorum.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczep Fusarium graminearum PH-1	Fungal Genetics Stock Center	FGSC 9075
Tween 60	Sigma-Aldrich	P1629
Agar Czapek’s Dox	Difco Laboratories	233810
Chloran potasu	Sigma-Aldrich	255572