Artykuł metodologiczny

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

DOI:

10.3791/3906

⸱

13 czerwca 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady transplantacja komórek macierzystych zyskała coraz większe zainteresowanie jako główna lub pomocnicza metoda terapeutyczna w leczeniu wielu chorób, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych. Jednak do tej pory wyniki dotyczące efektów funkcjonalnych i/lub regeneracji tkanek po transplantacji komórek macierzystych są bardzo zróżnicowane. Zazwyczaj korzyść kliniczna jest obserwowana bez głębokiego zrozumienia podstawowych mechanizmów1. W związku z tym podjęto liczne wysiłki w celu opracowania różnych metod obrazowania molekularnego do monitorowania przyjmowania się przeszczepów komórek macierzystych, z nadrzędnym celem dokładnej oceny przeżywalności, losów i fizjologii przeszczepionych komórek macierzystych i/lub ich mikrośrodowiska. Zmiany obserwowane w jednym lub większej liczbie parametrów określonych przez obrazowanie molekularne mogą być powiązane z obserwowanym efektem klinicznym. W tym kontekście nasze badania koncentrują się na połączonym zastosowaniu obrazowania bioluminescencyjnego (BLI), obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) oraz analizy histologicznej w celu oceny przyjmowania się przeszczepów komórek macierzystych.

BLI jest powszechnie stosowane do nieinwazyjnego śledzenia komórek oraz monitorowania ich przeżywalności w czasie po transplantacji2-7, w oparciu o reakcję biochemiczną, w której komórki wykazujące ekspresję genu reporterowego lucyferazy są zdolne do emisji światła po oddziaływaniu z jej substratem (np. D-lucyferyną)8, 9. MRI z kolei jest nieinwazyjną techniką o zastosowaniu klinicznym10, która może być wykorzystywana do precyzyjnej lokalizacji przeszczepów komórkowych z bardzo wysoką rozdzielczością11-15, choć jej czułość w dużym stopniu zależy od kontrastu uzyskanego po oznakowaniu komórek środkiem kontrastowym do MRI. Ostatecznie, pośmiertna analiza histologiczna jest preferowaną metodą walidacji wyników badań uzyskanych za pomocą technik nieinwazyjnych, zapewniającą najwyższą rozdzielczość i czułość. Ponadto końcowa analiza histologiczna pozwala na przeprowadzenie szczegółowej analizy fenotypowej przeszczepionych komórek i/lub otaczającej je tkanki, w oparciu o zastosowanie fluorescencyjnych białek reporterowych i/lub bezpośrednie znakowanie komórek specyficznymi przeciwciałami.

Podsumowując, prezentujemy tutaj wizualnie komplementarność BLI, MRI oraz histologii w celu odkrycia różnych cech związanych z komórkami macierzystymi i/lub ich środowiskiem po przeszczepieniu komórek macierzystych do OUN myszy. Przykładowo, komórki zrębowe pochodzące z szpiku kostnego, zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) i lucyferazy świetlika (fLuc) oraz znakowane niebieskimi fluorescencyjnymi mikrocząsteczkami tlenku żelaza (MPIOs), zostaną przeszczepione do OUN myszy immunokompetentnych, a wyniki będą monitorowane za pomocą BLI, MRI oraz histologii (Rycina 1).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek

  1. Eksperymenty należy rozpocząć, wykorzystując hodowane ex vivo populacje komórek macierzystych modyfikowanych genetycznie w celu ekspresji białek reporterowych lucyferazy i eGFP. W niniejszej procedurze zastosowano mysie komórki zrębowe pochodzące z szpiku kostnego wykazujące ekspresję lucyferazy/eGFP (BMSC-Luc/eGFP), zgodnie z wcześniejszym opisem Bergwerf et al.2, 5.
  2. Na dwa dni przed znakowaniem komórek, należy wysiać komórki BMSC-Luc/eGFP w zagęszczeniu 8 x 105 komórek na kolbę hodowlaną T75 w 15 ml kompletnej pożywki ekspansyjnej (CEM) uzupełnionej o 1 μg/ml puromycyny.
  3. Komórki należy hodować przez 48 hr w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  4. Do rosnącej kultury komórkowej należy dodać 5 x 106 mikrometrycznych cząsteczek tlenku żelaza Glacial Blue (GB MPIO) na ml pożywki hodowlanej (łącznie: 75 x 106 cząsteczek na 15 ml pożywki w kolbie T75).
  5. Inkubować przez 16 hr, aby umożliwić pobieranie cząsteczek drogą endocytozy.
  6. Wypłukać pozostałe cząsteczki i pozwolić komórkom rosnąć przez kolejne 24 hr w celu uzyskania konfluencji komórek oraz homogenicznego rozkładu GB MPIO.
  7. Weryfikację pobrania cząsteczek należy przeprowadzić wizualnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, obliczając stosunek komórek eGFP+ i GB MPIO+ do całkowitej liczby komórek eGFP+.
  8. Komórki BMSC-Luc/eGFP znakowane GB MPIO należy przemyć dwukrotnie 10 ml PBS, a następnie zebrać po traktowaniu trypsyną-EDTA (5 ml na kolbę T75 przez 5 minut).
  9. Zebrane komórki należy przemyć i resuspendować w PBS do końcowego stężenia 133 x 106 komórek/ml.
  10. Komórki należy przechowywać w lodzie do momentu transplantacji.

2. Implantacja komórek do OUN myszy

  1. Zanieś myszom znieczulenie poprzez dopaciemną iniekcję mieszaniny ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (16 mg/kg).
  2. Odczekaj 5 minut, aż myszy zasną.
  3. Wygol głowę myszy, aby umożliwić sterylne manipulacje.
  4. Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym.
  5. Zdezynfekuj skórę i zwilż oczy myszy, aby zapobiec ich odwodnieniu.
  6. Wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej, aby odsłonić czaszkę, a następnie wywierć otwór w czaszce za pomocą wiertła dentystycznego w podanych współrzędnych: 2 mmy posterioralnie i 2 mmy lateralnie względem Bregma.
  7. Krótko wymieszaj zawiesinę komórkową w wortexie, a następnie pobierz ją do strzykawki.
  8. Wprowadź igłę strzykawki na głębokość 2,5 mm pod oponę twardą i odczekaj 1 minutę w celu wyrównania ciśnienia.
  9. Wstrzyknij 3 μl zawiesiny komórkowej (4 x 105 komórek) na głębokość 2 mm pod oponę twardą z prędkością 0,70 μl/min przy użyciu automatycznej pompy do mikroiniekcji.
  10. Odczekaj dodatkowe 5 minut, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętej zawiesiny komórkowej.
  11. Powoli wycofaj igłę i zdezynfekuj brzegi skóry przed jej zaszyciem.
  12. Wstrzyknij podskórnie 300 μl 0,9% roztworu NaCl, aby zapobiec odwodnieniu, i umieść mysz pod lampą grzewczą do czasu wybudzenia z narkozy. Podaj pooperacyjny lek przeciwbólowy zgodnie ze standardami instytucjonalnymi.

3. Bioluminescencja in vivo

  1. Zanurz myszy w narkozie, stosując mieszaninę 3% izofluranu i tlenu.
  2. Umieść myszy w urządzeniu Photon Imager i zmniejsz poziom znieczulenia do 1,5% izofluranu i tlenu.
  3. Wstrzyknij dożylnie D-lucyferynę w dawce 150 mg na kg masy ciała.
  4. Rejestruj obraz przez 5 minut, korzystając z oprogramowania Photo Vision.
  5. Przeprowadź przetwarzanie obrazu przy użyciu oprogramowania M3vision. Ilościowo określ zaobserwowany sygnał, wykorzystując stałe obszary zainteresowania (ROI).

4. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego in vivo

  1. Zanurzyć myszy w narkozie z użyciem 3% izofluranu w mieszaninie O2:N2O (3:7).
  2. Umieścić myszy w stabilizatorze poziomego systemu MR 9,4T i zmniejszyć poziom znieczulenia do 1% izofluranu w mieszaninie O2:N2O (3:7).
  3. Nawilżyć oczy myszy, aby zapobiec ich odwodnieniu, przymocować sondę rektalną do monitorowania temperatury ciała oraz monitorować częstość oddechów, umieszczając czujnik pod brzuchem myszy.
  4. Utrzymywać częstość oddechów na poziomie 110 ± 10 oddechów na minutę oraz utrzymywać stałą temperaturę ciała w wąskim zakresie 37 ± 0,5 °C.
  5. Umieścić cewkę RF powierzchniową na głowie myszy i ustawić mysz w centrum magnesu.
  6. Pozyskać zestaw 10 obrazów koronarnych T2-zależnych spin-echo (SE) w celu uzyskania szczegółowych informacji anatomicznych oraz obrazów T2*-zależnych gradient-echo (GE) do badania migracji komórek macierzystych z rozdzielczością w płaszczyźnie 70 μm2. Ustalić parametry sekwencji w następujący sposób: czas repetycji (TR): 500 ms, czas echa (TE): 8 ms (sekwencja GE) oraz czas repetycji (TR): 4200 ms, czas echa (TE): 12,16 ms (sekwencja SE); pole widzenia (FOV): 18x18 mm2, macierz: 256x256, grubość warstwy 1 mm i odstęp między warstwami 1 mm (oprogramowanie Paravision 5.1).
  7. Przeprowadzić przetwarzanie danych przy użyciu oprogramowania Amira 4.0.

5. Histologia pośmiertna

  1. Przeprowadzić głęboką narkozę myszy poprzez inhalację mieszaniny izofluranu (4%), tlenu (0,5 L/min) i azotu (1 L/min) przez 2 minuty. Uśmiercić myszy poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.
  2. Wyjąć mózg myszy z czaszki i utrwalić tkankę mózgową w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 2 godziny.
  3. Ododawodnić tkankę mózgową, umieszczając mózg kolejno w roztworach sacharozy o różnych stężeniach: przez 2 h w 5% sacharozy w PBS, 2 h w 10% sacharozy w PBS oraz przez noc w 20% sacharozy w PBS.
  4. Zamrozić tkankę mózgową w ciekłym azocie i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do momentu wykonania przekrojów.
  5. Wyciąć przekroje tkanki mózgowej o grubości 10 μm przy użyciu kriotomu.
  6. Przeskanować niebarwione krioprzekroje pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu wykrycia niebieskiej fluorescencji cząsteczek GB MPIO oraz zielonej fluorescencji komórek ekspresujących eGFP.
  7. Przeskanować niebarwione krioprzekroje w celu wykrycia zielonej/czerwonej fluorescencji tła pochodzącej z komórek zapalnych.
  8. Przeprowadzić dalsze barwienia immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne w celu zidentyfikowania endogennych populacji komórek (np. mikrogleju, astrocytów, limfocytów T...), wchodzących w interakcje z przeszczepami komórkowymi.

6. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiliśmy tutaj optymalną sekwencję działań dla skutecznego obrazowania multimodalnego populacji (macierzystych) komórek wykazujących ekspresję lucyferazy/eGFP w OUN myszy. Najpierw opisana procedura znakowania GB MPIO prowadzi do wysoce wydajnego znakowania komórek BMSC-Luc/eGFP, co można łatwo potwierdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rycina 2A). Następnie, po wszczepieniu znakowanych GB MPIO komórek BMSC-Luc/eGFP do OUN myszy, przeżywalność przeszczepu komórkowego można monitorować za pomocą obrazowania BLI in vivo w oparciu o aktywność lucyferazy (Rycina 2B). Dodatkowo, dokładną lokalizację wszczepionych komórek można monitorować za pomocą MRI in vivo w oparciu o zawartość żelaza w GB MPIO (Rycina 2C). Na koniec analiza histologiczna umożliwia walidację wyników uzyskanych za pomocą BLI i MRI. Stabilną przeżywalność potwierdzono poprzez stabilną w czasie ekspresję eGFP (Rycina 2D). W tym celu kolokalizacja komórek wykazujących ekspresję eGFP z niebieską fluorescencją MPIO pozwala na dokładne określenie lokalizacji i przeżywalności wszczepionych komórek. Ponadto takie podwójne znakowanie fluorescencyjne komórek macierzystych zmniejsza możliwość obserwacji wyników fałszywie dodatnich wynikających z fluorescencji tła generowanej przez komórki zapalne5.

Schemat znakowania komórek, implantacji, obrazowania BLI/MRI in vivo; mikroskopii, obrazowania i analizy histologicznej.
Rysunek 1. Przegląd sekwencji działań

  1. ずOznaczanie komórek: BMSC-Luc/eGFP znakowano cząsteczkami GB MPIO w stężeniu 5 x 106 cząsteczek na ml pożywki hodowlanej. Po 16 h inkubacji i następującym po niej 24-godzinnym okresie odpoczynku komórki zebrano do implantacji wewnątrzczaszkowej.
  2. Implantacja komórek: Znakowane GB MPIO komórki BMSC-Luc/eGFP wszczepiono do mózgu myszy według następujących współrzędnych: bregma -2 mm, 2 mm na prawo od linii środkowej i 2 mm pod oponą twardą.
  3. In vivo BLI: Po dożylnym podaniu 150 mg D-lucyferyny/kg masy ciała, emitowane światło rejestrowano przez 5 minut za pomocą systemu Photon Imager.
  4. In vivo MRI: Wykonano zestaw 10 obrazów w przekroju czołowym w sekwencjach spin echo (SE) ważonych T2 oraz gradient echo (GE) ważonych T2* z rozdzielczością w płaszczyźnie obrazowania wynoszącą 70 μm2. Parametry sekwencji były następujące: czas powtórzenia (TR): 500 ms, czas echa (TE): 8 ms (sekwencja GE) oraz czas powtórzenia (TR): 4200 ms, czas echa (TE): 12,16 ms (sekwencja SE); pole widzenia (FOV): 18x18 mm2, macierz: 256x256, grubość warstwy 1 mm i odstęp między warstwami 1 mm.
  5. Histologia pośmiertna: Krioprzekroje o grubości 10 μm analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu wykrycia komórek BMSC wykazujących ekspresję eGFP oraz niebieskie znakowanie fluorescencyjne.

Schematy znakowania komórek in vitro, obrazowania in vivo, MRI oraz histologii do analizy badawczej.
Rycina 2. Multimodalne obrazowanie przeszczepów komórek macierzystych

  1. Mikroskopia bezpośredniej immunofluorescencji komórek BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO (Glacial blue).
  2. Obrazowanie BLI in vivo myszy po wstrzyknięciu 4x105 komórek BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO w 1. i 2. tygodniu po implantacji. Analiza statystyczna wykrytych sygnałów BLI w 1. i 2. tygodniu po implantacji. Dane przedstawiono jako średnią liczbę fotonów na sekundę na steradian na centymetr kwadratowy (ph/s/sr/cm2) z okresu 5 minut +/- błąd standardowy obliczony dla stałego obszaru zainteresowania u myszy wykazujących wyraźny sygnał BLI w miejscu wstrzyknięcia.
  3. Koronalne dwuwymiarowe MRI przeszczepów BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO (lewy panel: (i) obraz spin-echo ważony T2 oraz (ii) obraz echo gradientowe ważony T2*) i nieznakowanych BMSC-Luc/eGFP (prawy panel: (iii) obraz spin-echo ważony T2 oraz (vi) obraz echo gradientowe ważony T2*) w mózgu myszy.
  4. Analiza histologiczna implantów BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO w 2. tygodniu po implantacji. (i) Analiza bezpośredniej immunofluorescencji w celu lokalizacji przeszczepów BMSC-Luc/eGFP wykazujących ekspresję eGFP i znakowanych GB MPIO. (ii) Szczegół powiększenia z (i). (iii) Barwienie immunofluorescencyjne dla antygenu GFAP, wskazujące na rozwój blizny astrocytarnej wokół BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO. (vi) Barwienie immunofluorescencyjne dla antygenu Iba-1, wskazujące na naciekanie i otaczanie BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO przez mikroglej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisujemy zoptymalizowany protokół łączący trzy komplementarne metody obrazowania (BLI, MRI i histologię) w celu szczegółowej charakterystyki implantów komórkowych w ośrodkowym układzie nerwowym kompetentnych immunologicznie myszy. Połączenie znakowania komórek za pomocą genów reporterowych, opartych na modyfikacji genetycznej z wykorzystaniem genów lucyferazy świetlika i eGFP, oraz bezpośredniego znakowania komórek za pomocą GB MPIO, pozwala na dokładną ocenę przeszczepów komórek macierzystych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy declare, że nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace autorów były wspierane przez grant badawczy ID-BOF 2006 Uniwersytetu w Antwerpii (przyznany PPo i AVdL), granty badawcze G.0136.11 oraz G.0130.11 (przyznane AVdL, ZB i PPo) oraz grant 1.5.021.09.N.00 (przyznany PPo) z Funduszu Badań Naukowych Flandrii (FWO-Vlaanderen, Belgia), grant badawczy SBO IWT-60838: BRAINSTIM z Flandryjskiego Instytutu Nauki i Technologii (przyznany ZB i AVDL), częściowo przez grant badawczy Methusalem z rządu flandryjskiego (przyznany ZB), częściowo przez EC-FP6-NoE DiMI (LSHB-CT-2005-512146), EC-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) oraz przez Międzyuczelniane Bieguny Przyciągania IUAP-NIMI-P6/38 (przyznane AVDL). Nathalie De Vocht posiada stypendium doktoranckie z FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts jest stypendystą postdoktorskim FWO-Vlaanderen.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IMDMLonza Inc.BE12-722FSkładnik pożywki do wzrostu komórek CEM
Płodowa surowica bydlęcaGIBCO, by Life Technologies10270-106Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM
Surowica końskaGIBCO, by Life Technologies1605-122Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM
Penicylina-streptomycynaGIBCO, by Life Technologies15140Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM
FungizoneGIBCO, by Life Technologies15290-018Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM
PBSGIBCO, by Life Technologies14190
PuromycynaInvitrogenant-pr-1
trypsynaGIBCO, by Life Technologies25300
GB MPIOBangs LaboratoriesME04F/7833
D-lucyferynaPromega Corp.E1601
Ketamina (Ketalar)Pfizer Pharma GmbH
Ksylazyna (Rompun)Bayer AG
IzofluranIsoflo05260-05
0.9% roztwór NaClBaxter Internationl Inc.
paraformaldehydMerck & Co., Inc.1.04005.1000
sacharozaApplichemA1125
Pompa do mikroiniekcjiKD scientificKDS100
Obrazownik fotonowyBiospace Lab
Skaner MR 9.4TBruker CorporationBiospec 94/20 USR
Mikroskop BX51Olympus CorporationBX51
Kriostat Mycrom HMProsanHM525
strzykawkaHamilton Co7635-01
igła 30 GHamilton Co7762-03
Oprogramowanie Photo VisionBiospace Lab
Oprogramowanie M3visionBiospace Lab
Oprogramowanie Paravision 5.1Bruker Corporation
Oprogramowanie Amira 4.0Visage Imaging

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. Molecular imaging of stem cells. , (2008).
  2. Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1(2009).
  3. Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
  4. Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
  5. De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
  6. Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
  7. Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
  8. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
  9. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
  10. Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
  11. Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
  12. Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
  13. Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
  14. Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
  15. Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
  16. Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
  17. Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
  18. Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
  19. Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
  20. Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
  21. Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
  22. Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
  23. Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
  24. Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
  25. Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
  26. Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
  27. Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
  28. Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
  29. Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
  30. Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczepianie kom rek macierzystychobrazowanie bioluminescencyjneobrazowanie rezonansem magnetycznymanaliza histologicznakom rki macierzyste szpiku kostnegofluorescencyjne nanocz steczki tlenku elaza o rozmiarach mikrometrycznychekspresja EGFP i lucyferazyimplantacja do m zgu myszyprocedura wstrzykni cia stereotaktycznegopo miertna walidacja histologiczna

Powiązane artykuły