Wykorzystanie niefiksowanych, zamrożonych tkanek do badania naturalnego rozkładu mucyn

Podsumowanie

Niefiksowane mrożone próbki tkanek zatopione w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) mogą być wykorzystane do badania naturalnego rozkładu i glikozylacji wydzielonego śluzu. W tym podejściu przetwarzanie tkanek jest minimalne, co pozwala na zachowanie naturalnej postaci glikolipidów, mucyn i epitopów glikanowych. Przekroje tkankowe można analizować za pomocą immunohistochemii z wykorzystaniem detekcji fluorescencyjnej lub chromogennej.

Streszczenie

Mucyny to złożone i silnie glikozylathed O-glikoproteiny, które zawierają ponad 70% węglowodanów w przeliczeniu na masę^1-3. Mucyny wydzielnicze, produkowane przez komórki kubkowe i błonę śluzową żołądka, stanowią rusztowanie dla warstwy śluzu o grubości wielu mikrometrów, która wyścieła nabłonki jelit i dróg oddechowych^3,4. Oprócz mucyn, warstwy śluzu zawierają również peptydy przeciwdrobnoustrojowe, cytokiny i immunoglobuliny^5-9. Warstwa śluzu jest istotnym elementem wrodzonej odporności gospodarza i stanowi pierwszą linię obrony przed naciekającymi mikroorganizmami^8,10-12. W związku z tym śluz podlega licznym oddziaływaniom z mikroorganizmami, zarówno patogenami, jak i symbiontami, a wydzielane mucyny tworzą ważny interfejs dla tych interakcji. Badanie takich oddziaływań biologicznych zazwyczaj wiąże się z zastosowaniem metod histologicznych do pobierania i barwienia tkanek. Dwie najczęściej stosowane w klinice i laboratoriach badawczych metody pobierania i utrwalania tkanek to: fiksacja w formalinie z następującym po niej zatapianiem w parafinie oraz zamrażanie tkanek z następującym po nim zatapianiem w mediach krioprotekcyjnych.

Próbki tkanek zatopione w parafinie pozwalają na uzyskanie skrawków o optymalnych właściwościach do wizualizacji histologicznej, w tym wysokiej przejrzystości i dobrze zdefiniowanej morfologii. Jednak w procesie zatapiania w parafinie szereg epitopów ulega modyfikacji, a w celu ich zbadania skrawki tkanek muszą zostać poddane dalszej obróbce przy użyciu jednej z wielu metod odzyskiwania epitopów¹³. Wydzielane mucyny i lipidy są usuwane z tkanki podczas etapu klarowania w procesie zatapiania w parafinie, co wymaga długotrwałej inkubacji w rozpuszczalnikach organicznych (ksylenie lub Citrisolv). W związku z tym podejście to jest nieoptymalne dla badań koncentrujących się na naturze i rozmieszczeniu mucyn oraz śluzu in vivo.

Z drugiej strony mrożenie tkanek w medium zatapiającym Optimal Cutting Temperature (OCT) pozwala uniknąć odwodnienia i przejrzyszczania próbki, zapewniając utrzymanie jej nawodnienia. Umożliwia to lepszą konserwację nawodnionej warstwy śluzu, a tym samym pozwala na badanie licznych funkcji mucyn w biologii nabłonka. Ponieważ metoda ta wymaga minimalnego opracowania tkanki, zostaje ona zachowana w stanie bardziej zbliżonym do naturalnego. W związku z tym mrożone przekroje tkanek nie wymagają żadnej dodatkowej obróbki przed barwieniem i mogą być łatwo analizowane przy użyciu metod immunohistochemicznych.

Prezentujemy metodę zachowania wydzielonej warstwy śluzu o grubości kilku mikrometrów w zamrożonych próbkach jelita grubego. Warstwa ta ulega drastycznemu zmniejszeniu, gdy te same tkanki zostaną zatopione w parafinie. Wykazujemy również barwienie immunofluorescencyjne epitopów glikanowych obecnych w mucynach z wykorzystaniem lektyn roślinnych. Zaletą tego podejścia jest brak konieczności stosowania specjalnych utrwalaczy oraz możliwość wykorzystania tkanek zamrożonych, które mogą być już przechowywane w laboratorium.

Protokół

1. Oddziaływanie tkanki w OCT

1. Przygotuj kąpiel mrożącą, dodając suchy lód do 2-metylobutanu w płytkim pudełku styropianowym.
2. Pobierz tkankę i delikatnie osusz ją ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar cieczy. W przypadku stosowania tkanki gwałtownie zamrożonej (zamrożonej w ciekłym azocie), pozwól tkance ogrzać się do -20 °C, umieszczając ją w komorze kriomikrotomu.
3. Dodaj niewielką ilość OCT do formy mrożącej Peel-A-Way, w ilości wystarczającej do pokrycia dna formy.
4. Umieść tkankę w formie, upewniając się, że spoczywa ona na dnie formy w pożądanej orientacji. Po zamrożeniu blok tkanki będzie cięty albo od dołu, albo z boków.
5. Przykryj tkankę OCT i umieść formę w kąpieli mrożącej. Związek OCT stanie się biały w miarę zamrażania tkanki.
6. Po zamrożeniu oderwij formę od zamrożonego bloku i umieść go w oznakowanej torbie do mrożenia.
7. Zamrożone bloki można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie skrawków tkanek

1. Umieść bloki tkankowe w komorze kriomikrotomu i poczekaj, aż osiągną temperaturę -20 °C (około 30 min).
2. Wykonaj skrawki o grubości 3-5 μm, a następnie połóż na nich dodatnio naładowane szkiełko przedmiotowe. Tkanka przywrze do szkiełka.
3. Pozostaw tkanki do wyschnięcia na powietrzu przez 30-60 min.
4. Szkiełka można wykorzystać na tym etapie lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

3. Barwienie tkanek

1. Preparaty przechowywane w -80 °C: pozostawić preparaty do rozmrożenia i wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 min.
2. Utrwalić preparaty w 10% buforowanej formalinie przez 30 min w temperaturze pokojowej.
3. Przemyć trzykrotnie w buforze PBS lub TBST; podczas każdego płukania zanurzyć preparaty 10 razy w 250 ml buforu. Bufor PBS może być stosowany do barwienia immunofluorescencyjnego, jednak w przypadku detekcji chromogenicznej z użyciem przeciwciała sprzężonego z fosfatazą alkaliczną należy stosować TBST, ponieważ fosforany w PBS hamują aktywność fosfatazy alkalicznej.
4. Preparaty z przekrojami tkanek są teraz gotowe do barwienia.

4. Wykorzystanie barwień histochemicznych, takich jak błękit alkianowy i kwas periodiczny (PAS), do wykrywania śluzu

1. Barwienie błękitem Alcianem:
   1. Opłukać preparaty w wodzie, inkubować w 3% kwasie octowym przez 3 min w temperaturze pokojowej.
   2. Barwić roztworem błękitu Alcianu o pH 2,5 przez 30 min w temperaturze pokojowej.
   3. Przemyć preparaty pod bieżącą wodą z kranu przez 10 min, opłukać wodą DI.
   4. Dobarwić Nuclear Fast Red przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   5. Przemyć preparaty trzykrotnie w wodzie DI.
2. Barwienie kwasem okresowym i Schiffem (PAS):
   1. Opłukać preparaty w wodzie, inkubować w świeżo przygotowanym 1% kwasie okresowym przez 5 min.
   2. Przemyć trzykrotnie w wodzie DI, zanurzyć raz w wodzie miliQ.
   3. Barwić odczynnikiem Schiffa przez 15 min w temperaturze pokojowej.
   4. Przemyć preparaty pod bieżącą wodą z kranu przez 10 min, opłukać wodą DI.
   5. Dobarwić hematoksyliną Surgipath przez 30 s w temperaturze pokojowej.
   6. Przemyć preparaty trzykrotnie w wodzie DI.
   7. Inkubować preparaty przez 30 s w wodzie z kranu według metody Scotta w temperaturze pokojowej.
   8. Przemyć trzykrotnie w wodzie DI.
3. Odwodnić i przejrzeć preparaty poprzez inkubację przez 1 min w 95% etanolu, następnie trzy szybkie zmiany w 100% etanolu oraz trzy zmiany w Citrisolv, po 2 min każda. Wszystkie etapy w temperaturze pokojowej.
4. Zamontować preparaty pod szkiełkami przykrywkowymi w medium żywicznym (Cytoseal 60).

5. Wykorzystanie lektyn i przeciwciał (Tabela 1) do wykrywania epitopów glikanów metodami histochemicznymi

1. W celu detekcji fluorescencyjnej trzech epitopów glikanowych przy użyciu lektyn, zablokować preparaty na szkiełkach za pomocą 1% BSA w PBS przez 10-30 min w temperaturze pokojowej.
2. Ponieważ stosowana jest lektyna biotynylowana, należy zablokować biotynę endogenną, inkubując preparaty przez 15 min z 0,1% awidyną, a następnie przez 15 min z 0,01% biotyną w temperaturze pokojowej.
3. Przemyć szkiełka w PBS po każdym etapie blokowania.
4. Przygotować świeżą mieszaninę 1 μg/ml sukcynylowanej aglutyniny zarodków pszenicy (sWGA) sprzężonej z rodamyną, 1,3 μg/ml biotynylowanej aglutyniny Sambucus nigra (SNA) oraz 5 μg/ml jakaliny sprzężonej z fluoresceiną w buforze HEPES/NaCl (10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7,5).
5. Umieścić szkiełka na płaskiej powierzchni lub w kasecie do barwienia, a następnie nanieść na nie warstwę mieszaniny lektyn. Objętość mieszaniny można zmniejszyć, delikatnie przykrywając ciecz parafilmem; parafilm wyrównuje powierzchnię cieczy i zapobiega jej odparowywaniu.
6. Inkubować przez 1 hr w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Przemyć szkiełka trzy razy w PBS.
8. Nanieść na szkiełka warstwę 0,7 μg/ml streptawidyny sprzężonej z CY5 (do detekcji biotynylowanej SNA) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
9. Przemyć szkiełka trzy razy w PBS.
10. Przeprowadzić przeciwbarwienie jąder komórkowych za pomocą 0,1 μg/ml DAPI.
11. Zamontować szkiełka z nakrywek za pomocą medium wodnego, takiego jak VectaMount mounting media (lub dowolnego innego medium wodnego).

6. Kontrola specyficzności barwienia lektynami

1. Specyficzność barwienia lektynowego kontroluje się albo poprzez specyficzne enzymatyczne rozszczepienie epitopu glikanu przed barwieniem, albo poprzez konkurencję z małymi cząsteczkami.
2. Rozszczepienie enzymatyczne dla specyficzności wiązania aglutyniny z Sambucus nigra (SNA)
   1. Rozcieńczyć sjalidazę z Arthrobacter ureafaciens (AUS) do stężenia 250 mU/ml w 50 mM octanie sodu o pH 5,5.
   2. Wlać wodę na dno pustego pudełka na końcówki; utworzy to komorę wilgotną podczas inkubacji.
   3. Umieścić preparaty szkiełek stroną górną do góry na górnej tacy pudełka na końcówki, nanieść na szkiełko 150-200 μl roztworu AUS i przykryć szkiełkiem nakrywką. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
   4. Zamknąć pokrywę pudełka i inkubować w 37 °C przez 2,5 h.
   5. Przemyć szkiełka trzykrotnie w PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszystkie wolne kwasy sjalowe. Preparaty te powinny być negatywne w barwieniu SNA.
3. Inhibitory konkurencyjne dla specyficzności jakaliny i sukcynilowanej aglutyniny z zarodków pszenicy (sWGA)
   1. Odmiarzyć 200 μl mieszaniny lektyn przygotowanej w kroku 5.4 do dwóch probówek Eppendorf.
   2. Do jednej z probówek dodać 200 mM melibiozy (inhibitor jakaliny), a do drugiej hydrolizat chityny w rozcieńczeniu 1:10 (inhibitor sWGA).
   3. Nałożyć mieszaninę zawierającą inhibitory na szkiełka kontrolne negatywne i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej równocześnie z pozostałymi szkiełkami. Preparaty te powinny być odpowiednio negatywne w barwieniu jakaliną lub sWGA.

7. Reprezentatywne wyniki

Porównanie próbek tkanek zatopionych w parafinie z tkankami mrożonymi w medium krioprotekcyjnym (OCT) ujawniło wyraźną różnicę w zachowaniu i jakości barwienia glikoprotein mucyn. Barwienie tkanek barwnikami histochemicznymi, takimi jak błękit Alciana oraz Periodic Acid Schiff, daje bardzo odmienne wyniki w porównywalnych przekrojach tkanek z próbek mrożonych lub zatopionych w parafinie (Rysunek 1). Wydaje się, że rozpuszczalnik organiczny (ksylen lub Citrisolv) stosowany podczas procesu zatapiania w parafinie wpływa na rozkład wydzielanych mucyn na nabłonkach, a także usuwa znaczną część glikolipidów z próbek (Rysunek 2). W rezultacie warstwa śluzu wydaje się zapadnięta na komórkach błony śluzowej i występuje głównie w komórkach kubkowych. Gwałtowne mrożenie tkanek w medium krioprotekcyjnym (OCT) pozwoliło na zachowanie nawodnienia próbek oraz wymiarów warstwy wydzielanych mucyn. Proces zatapiania w parafinie w podobny sposób wpłynął na inne glikany i glikolipidy związane ze śluzem. Rozkład glikanów badano przy użyciu lektyn, które są rutynowo stosowane do wykrywania glikanów (Rysunek 3), oraz przeciwciał przeciwko epitopom występującym w mucynach i glikolipidach (Rysunek 6). Ponieważ wiązanie lektyn nie jest dobrze zdefiniowane i zależy od przestrzennego rozkładu glikanów, a także od ich struktury^14,15, ważne jest zastosowanie odpowiednich kontroli barwienia lektynami. Przedstawiamy tutaj dwie metody kontroli barwienia lektynami w badanych tkankach: rozszczepianie enzymatyczne oraz inhibicję konkurencyjną. Rozszczepianie epitopów glikanów przeprowadzono poprzez trawienie przekroju tkanki enzymami specyficznymi dla glikanów, na przykład bakteryjną sialidazą jako kontrolą wiązania kwasu sialowego przez SNA (Rysunek 4). W przypadkach, gdy specyficzny enzym (np. glikozydaza) nie jest dostępny do usunięcia badanego epitopu glikanu, specyficzność lektyny można potwierdzić poprzez dodanie inhibitora konkurencyjnego, takiego jak melibioza dla barwienia jakaliną lub hydrolizat chityny dla barwienia sWGA (Rysunek 5).

Wykazujemy tutaj, że próbki tkanek zamrożone w sposób gwałtowny, które są rutynowo pobierane w klinikach i laboratoriach badawczych, mogą być dalej zatapiane w OCT i wykorzystywane do badania glikoprotein mucyn oraz licznych obecnych w nich glikanów.

Lektyna / Przeciwciało	Źródło	Główna swoistość
LFA	Limax flavus (ślimak żółty)	Terminalne Sia
MAA*	Maackia amurensis (maackia amurska)	Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-siarczan na Galβ1-R
SNA	Sambucus nigra (bez czarny)	Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc
WGA	Triticum vulgaris (zarodek pszenicy)	GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia
sWGA	Sukcynilowana Triticum vulgaris (zarodek pszenicy)	GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
PNA	Arachis hypogaea (araszydowy)	Galβ1-3GalNAc (niemodyfikowany antygen T)
Jakalina	Artocarpus integrifolia (jakalina)	Galβ1-3GalNAc występujące w glikanach typu O
ECA	Erythrina cristagalli (erytryna koralowa)	Galβ1-4GlcNAc
TKH2	Przeciwciało	Siaa2-6GalNAc(STn) w glikanach typu O
CA19-9	Przeciwciało	Siaa2-3Galβ1-4(Fuca1-3)GlcNAc (SLea)
SNH3	Przeciwciało	Siaa2-3Galβ1-3(Fuca1-4)GlcNAc (SLex)

Skróty: Ab, przeciwciało; Sia, kwas sialowy; Gal, galaktoza; GalNAc, N-acetylgalaktozamina; GlcNAc, N-acetylglukozamina; Fuc, fukoza; STn, sialyl Tn; SLe^a, sialyl Lewisa; SLe^x, sialyl Lewis^x. * Komercyjne źródła MAA obejmują MALI, MALII i MAH.

Tabela 1. Częściowa lista lektyn i przeciwciał przeciwko epitopom glikanowym.

Rysunek 1. Barwienie błękitem Alcianem oraz kwasem okresowym i Schiffem tkanek okrężnicy mrożonych i zatopionych w parafinie. Przekroje tkanek okrężnicy ludzi, myszy lub kurcząt mrożonych w OCT (panel górny) lub zatopionych w parafinie (panel dolny) zabarwiono kwasem okresowym i Schiffem (PAS) lub błękitem Alcianem (AB). Odczynniki te barwią śluz odpowiednio na różowo lub niebiesko. Panel górny: w tkankach mrożonych, oprócz mucyn w komórkach kubkowych, widoczny był również wydzielony śluz (strzałki). Panel dolny: w tkankach zatopionych w parafinie barwienie śluzu ograniczało się do komórek kubkowych. Jądra komórkowe przeciwbarwiono hematoksyliną Surgipath (PAS) lub hematoksyliną Mayera (AB). Pasek skali wskazuje 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 2. Inkubacja z Citrisolv prowadzi do znacznej utraty mucyn. Seryjne przekroje zamrożonych próbek jelita krętego kurczaka utrwalono w 10% buforowanej formalinie i utrzymano w stanie nawodnienia (panel lewy), odwodniono w etanolu poprzez sekwencyjną inkubację w 70%, 90% i 100% etanolu po 20 min każda (panel środkowy) lub odwodniono w etanolu i przejaśniono za pomocą Citrisolv przez 1 hr (panel prawy). Odwodnione próbki rehydratowano do PBS przed barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) lub błękitem Alcianem. Odwodnienie etanolem i przejaśnianie Citrisolv poprawiły morfologię tkanki (np. górny rząd, obrazy środkowy i prawy w porównaniu z obrazem lewym). Odwodnienie etanolem nie miało istotnego wpływu na barwienie błękitem Alcianem (środkowy rząd, porównanie obrazów lewego i środkowego). W przeciwieństwie do tego, inkubacja z Citrisolv zmniejszyła barwienie błękitem Alcianem i ograniczyła je do komórek kubkowych (środkowy rząd, obraz prawy) w sposób podobny do tego, który obserwowano w tkankach zatopionych w parafinie (Rysunek 1). Dane te sugerują, że intensywne barwienie granulek śluzu w próbkach zatopionych w parafinie wynika z kurczenia się i kondensacji śluzu w komórkach kubkowych podczas etapu przejaśniania. Słabsze i mniej gęste barwienie śluzu w tkankach zamrożonych w OCT odzwierciedla bardziej naturalny rozkład śluzu w tkance. Powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami wskazano strzałkami. Paski skali oznaczają 50 μm (górny i środkowy rząd) oraz 10 μm (dolny rząd).

Rysunek 3. Wiązanie lektyn do epitopów glikanowych w tkankach mrożonych i zatopionych w parafinie. Próbki jelita cienkiego kurczaka (ileum) mrożone w OCT (panele górne) lub zatopione w parafinie (panele dolne) poddano analizie z użyciem Jacaliny (niebieski), sWGA (zielony) i SNA (czerwony). Powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami wskazano strzałkami. W tkankach mrożonych wiązanie Jacaliny do glikanów typu O ujawniło struktury, które wydawały się wypływać z komórek kubkowych do światła jelita (Jacalin, panel górny, strzałki). W przeciwieństwie do tego, wiązanie Jacaliny w tkankach zatopionych w parafinie ograniczało się do komórek kubkowych (Jacalin, panel dolny, strzałki) oraz do rąbka szczoteczkowego kosmków (obraz na dole po lewej, strzałka). Barwienie sWGA dla β1-4GlcNAc częściowo współlokalizowało się z wiązaniem lektyny Jacalina zarówno w tkankach mrożonych (panel górny, strzałki), jak i w tkankach zatopionych w parafinie (panel dolny, strzałki). Z kolei wiązanie lektyny SNA do kwasów sialowych z wiązaniem α2-6 ma charakter wewnątrzkomórkowy (SNA, groty strzałek) i nie współlokalizuje się z Jacaliną (obraz kolorowy, SNA na czerwono zaznaczona grotem strzałki, Jacalina na niebiesko zaznaczona przerywaną strzałką). Paski skali wskazują 100 μm (obrazy po lewej) i 20 μm (powiększone obszary w ramkach).

Rycina 4. Kontrola cięcia enzymatycznego dla barwienia kwasu sialowego za pomocą SNA. Próbki jelita cienkiego kurczaka inkubowano z 250 mU/ml sialidazą z Arthrobacter ureafaciens (AUS) lub w buforze octanu sodu 50 mM o pH 5.5 przez 2.5 h w 37 °C. Traktowanie AUS znosi barwienie biotynylowanym SNA, co potwierdza specyficzność wiązania SNA z kwasami sialowymi. Pasek skali wskazuje 100 μm.

Rycina 5. Kontrola inhibicji konkurencyjnej dla barwienia glikanów jakaliną i sWGA. Próbki jelita cienkiego kurczaka (jelita kręte) inkubowano z mieszaniną jakaliny i sWGA w obecności specyficznych inhibitorów lektynowych: melibiozy (środkowa kolumna), hydrolizatu chityny (prawa kolumna) lub bez inhibitora (A i D). Panel górny: (lewo) barwienie jakaliną bez inhibitorów. (środek) barwienie jakaliną zostało zahamowane przez melibiozę. (prawo) hydrolizat chityny nie zahamował barwienia jakaliną. Panel dolny: (lewo) barwienie sWGA bez inhibitora. (środek) melibioza nie zahamowała barwienia sWGA. (prawo) barwienie sWGA zostało zahamowane przez hydrolizat chityny. Inhibicja ta potwierdza specyficzność oddziaływania lektyn z tkankami. Gwiazdki oznaczają obrazy z zahamowaniem barwienia. Pasek skali wskazuje 100 μm.

Rysunek 6. Detekcja mucyn wydzielniczych, glikolipidów i epitopów glikanowych w zamrożonych tkankach raka jelita grubego człowieka. Biopsje raka jelita grubego z raka kosmkowego i raka śluzowego zostały błyskawicznie zamrożone w ciekłym azocie i zatopione w OCT. Przekroje tkankowe inkubowano przez 1 h z przeciwciałami przeciwko wydzielanej mucynie MUC5AC, epitopowi glikanowemu sialyl Lewis a występującemu na gangliozydach (marker raka jelita grubego CA 19-9) oraz epitopowi glikanowemu sialyl-Tn, obficie występującemu na mucynach (wykrywanemu za pomocą przeciwciała TKH2), a następnie inkubowano przez 30 min z biotynilowanym wtórnym przeciwciałem osiołkowym anty-mysie IgG oraz przez 30 min z streptawidyną sprzężoną z peroksydazą. Dodatkowe tkanki inkubowano przez 1 h z biotynilowanymi lektynami SNA i sWGA, a następnie przez 30 min ze streptawidyną sprzężoną z peroksydazą. Barwienie peroksydazowe wywołano przy użyciu zestawu AEC. Czarny pasek skali oznacza 200 μm.

Dyskusja

Zachowanie śluzu i epitopów glikanowych w tkankach mrożonych jest lepsze niż w tkankach zatopionych w parafinie. Wykazaliśmy zachowanie wydzielonej warstwy śluzu (Ryciny 1 i 3) oraz rozkład trzech struktur glikanowych (Rycina 3) w tkankach mrożonych w porównaniu z tkankami zatopionymi w parafinie. Do optymalnego utrwalenia warstwy śluzu w próbkach tkankowych opracowano specjalistyczne utrwalacze, takie jak roztwór Carnoya (60% etanolu, 30% chloroformu, 10% kwasu octowego)¹⁷. Optymalnie roztwór ten należy stosować do pobierania próbek tkanek przeznaczonych do badań nad śluzem; wykazano, że pozwala on zachować gładką strukturę warstwy śluzu^16-17. Warstwa śluzu w nieutrwalonych próbkach mrożonych zatopionych w OCT wydaje się nierównomierna i w niektórych obszarach może oddzielać się od tkanki, jednak całkowita grubość warstwy jest zgodna z obserwowaną w tkankach utrwalonych roztworem Carnoya i zatopionych w parafinie^16-17. Na przykład warstwa śluzu w mrożonym przekroju tkanki jelita grubego człowieka wynosi ~100 μm (Rycina 1), co mieści się w zakresie zgłaszanym dla próbek jelita grubego człowieka utrwalonych metodą Carnoya: 55,4±2,5 μm (zakres 7,7 - 204,8 μm) ¹⁶.

Od dziesięcioleci wiadomo, że odwodnienie etanolem powoduje ok. 30% skurcz próbek biologicznych¹⁸, a rozpuszczalniki organiczne, takie jak ksylen, Citrisolv i chloroform, ekstrahują z tkanek lipidy, glikolipidy, a w pewnym stopniu również białka¹³. Obróbka tkanek do zatopienia w parafinie obejmuje następujące etapy: utrwalanie (10% buforowana formalina), odwodnienie (rosnące stężenie etanolu) oraz klarowanie (Citrisolv lub ksylen). Naśladując te etapy na nieutrwalonych, zamrożonych skrawkach tkanek, wykazaliśmy, że Citrisolv ekstrahuje śluz z zamrożonych skrawków tkanek, co prowadzi do uzyskania morfologii tkanki podobnej do tej w tkankach zatopionych w parafinie (Rysunek 2, panel prawy). W przeciwieństwie do tego, warstwa śluzu nie uległa zmianie podczas inkubacji z formaliną lub etanolem (Rysunek 2, panele lewy i środkowy). Sugeruje to, że etap klarowania w standardowej procedurze zatapiania w parafinie, wymagający przedłużonej inkubacji w Citrisolv/ksylenie, prowadzi do zapadnięcia się warstwy śluzu. Utrwalanie formaliną nie uszkadza warstwy śluzu, a zamrożone skrawki tkanek utrwalone formaliną mogą być łatwo barwione lektynami oraz przeciwciałami przeciwko glikanom, glikolipidom i białkom (Rysunki 2, 3 i 6). Efekty te mogą być pomijalne w badaniach białek błonowych i patologii tkanek, lecz są niszczycielskie dla struktur silnie uwodnionych, takich jak wydzielana warstwa śluzu. Niemniej jednak badania histologiczne mucyn są nadal prowadzone głównie na próbkach zatopionych w parafinie, w których zachowanie warstwy śluzu jest nieoptymalne. Pogłębione analizy składu warstwy śluzu, takie jak precyzyjna identyfikacja kombinacji glikoprotein MUC wydzielanych lub związanych z błoną, wymagają specyficznych przeciwciał oraz spektrometrii mas w celu identyfikacji szkieletów białkowych. Zachowanie warstwy śluzu jest jedynie wstępnym wymogiem dla takich badań.

Wiele laboratoriów posiada próbki tkanek zamrożone w OCT, które zostały pobrane w przeszłości na potrzeby różnych projektów; tkanki te mogą być bez problemu wykorzystane do badania mucyn, glikolipidów i rozmieszczenia glikanów, co eliminuje konieczność pobierania tkanek do specjalnych utrwalaczy zaprojektowanych wyłącznie w celu zachowania śluzu. Zamrożone tkanki poddawane są minimalnej obróbce, dzięki czemu zachowany zostaje naturalny rozkład glikanów, które z natury są hydratowane. Jest to szczególnie istotne w obszarze interakcji między mikroorganizmami a gospodarzem. Wiedza o naturalistycznym rozkładzie i obfitości wydzielanych mucyn oraz o wielu strukturach glikanowych zdobiących te cząsteczki „bariery” będzie kluczowa dla zrozumienia obrony gospodarza, eksploatacji mikrobowej oraz patogenezy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-metylbutan	Fisher Scientific	03551-4
zestaw substratu peroksydazy AEC	Vector Labs	SK-4200
Błękit Alciana	Sigma-Aldrich	A3157
przeciwciało monoklonalne anty-CA 19-9	Calbiochem	CA1003
przeciwciało monoklonalne anty-MUC5AC	Millipore	MAB2011
zestaw blokujący awidyna-biotyna	Vector Labs	SP-2001
biotynilowane przeciwciało osiołkowe anty-mysie	Jackson Immunoresearch	90863
biotynilowana SNA	Vector Labs	B-1305
albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A4503
hydrolizat chityny	Vector Labs	SP-0090
mikrotom kriostatyczny	Leica Microsystems	Leica CM 1800
hematoksylina	Surgipath Medical Ind.	3801570
nadtlenek wodoru 30%	Fisher Scientific	H325-100
Jacalin-FITC	Vector Labs	FL-1151
hematoksylina Mayera	Sigma-Aldrich	MHS32
melibioza	Sigma-Aldrich	M5500
Nuclear Fast Red	Vector Labs	H-3403
związek OCT	VWR International	25608-930
streptawidyna koniugowana z peroksydazą	Jackson Immunoresearch	94638
odczynnik Schiffa	Electron microscopy sciences	26052
sWGA-Rodamina	Vector Labs	RL1022S
przeciwciało monoklonalne TKH2	ATCC	HB-9654
wodny nośnik do zamykania preparatów VectaMount	Vector Labs	H-5501
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
formy Peel-A Way	Polysciences Inc.	18646A-1