Filtry z wełny szklanej do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę oraz rolniczych patogenów odzwierzęcych

Podsumowanie

Filtry z wełny szklanej były wykorzystywane do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę przez liczne grupy badawcze na całym świecie. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę konstruowania filtrów z wełny szklanej i wykazujemy, że są one również skuteczne w zagęszczaniu wodnych patogenów wirusowych, bakteryjnych i pierwotniakowych.

Streszczenie

Kluczowym pierwszym krokiem w ocenie poziomu patogenów w wodzie z podejrzeniem zanieczyszczenia jest ich zagęszczenie. Metody zagęszczania są zazwyczaj specyficzne dla konkretnej grupy patogenów, na przykład metoda 1623 Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (US Environmental Protection Agency) dla Giardia i Cryptosporidium¹, co oznacza, że w przypadku programów pobierania próbek obejmujących więcej niż jedną grupę patogenów wymagane jest zastosowanie wielu metod. Inną wadą obecnych metod jest fakt, że sprzęt może być skomplikowany i kosztowny, czego przykładem jest metoda VIRADEL z zastosowaniem wkładu filtrującego 1MDS do zagęszczania wirusów². W niniejszym artykule opisujemy sposób konstrukcji filtrów z wełny szklanej do zagęszczania patogenów przenoszonych przez wodę. Po elucji z filtra koncentrat może zostać poddany drugiemu etapowi zagęszczania, takiemu jak wirowanie, a następnie detekcji i enumeracji patogenów za pomocą metod hodowlanych lub molekularnych. Filtry te mają kilka zalet. Ich konstrukcja jest prosta, a filtry mogą być budowane w dowolnym rozmiarze, aby spełnić konkretne wymogi pobierania próbek. Elementy filtru są niedrogie, co umożliwia zebranie dużej liczby próbek bez znaczącego obciążenia budżetu projektu. Możliwe jest zagęszczenie dużych objętości próbek (od setek do tysięcy L), w zależności od tempa zapychania się filtra wynikającego z mętności próbki. Filtry są wysoce mobilne i przy minimalnym wyposażeniu, takim jak pompa i przepływomierz, mogą być stosowane w terenie do pobierania próbek uzdatkowionej wody pitnej, wód powierzchniowych, wód podziemnych oraz spływów rolniczych. Wreszcie, filtracja wełną szklaną jest skuteczna w zagęszczaniu różnych typów patogenów, więc wystarczająca jest tylko jedna metoda. W pracy tej raportujemy skuteczność filtrów w zagęszczaniu ludzkich enterowirusów przenoszonych przez wodę, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum oraz wirusa grypy ptaków.

Protokół

1. Przygotowanie wełny szklanej

1. Przed przygotowaniem i po każdej partii filtrów należy wysterylizować obszar roboczy 10% roztworem wybielacza.
2. Założyć rękawiczki i fartuch. Wysterylizować wiadro w autoklawie w temperaturze 121°C i pod ciśnieniem 15 psi przez co najmniej 20 minut. Umieścić wełnę szklaną w sterylnym wiadrze.
3. Nasycić wełnę szklaną wodą z odwróconej osmozy i pozostawić do namoczenia na 15 minut.
4. Odlać wodę z odwróconej osmozy z wiadra.
5. Nasycić wełnę szklaną 1 M HCl i pozostawić do namoczenia na 15 minut.
6. Odlać 1 M HCl z wiadra.
7. Przepłukać wełnę szklaną wodą z odwróconej osmozy.
8. Dokładnie wymieszać.
9. Sprawdzić pH za pomocą papierka wskaźnikowego i powtarzać płukanie wodą z odwróconej osmozy aż do uzyskania neutralnego pH.
10. Odlać wodę z płukania.
11. Nasycić wełnę szklaną 1 M NaOH i pozostawić do namoczenia na 15 minut.
12. Odlać 1 M NaOH z wiadra.
13. Powtarzać płukanie wodą z odwróconej osmozy aż do uzyskania neutralnego pH.
14. Odlać wodę z płukania.
15. Zamiast wiadra można skonstruować myjkę do wełny szklanej, której budowa jest zbliżona do myjki do pipet szklanych (Rysunek 1).
16. Całkowicie przykryć wełnę szklaną sterylnym solnym roztworem buforowanym fosforanem (PBS) o pH 6,8.
17. Przygotowaną wełnę szklaną należy zużyć niezwłocznie lub przechowywać w temperaturze 4°C. Może być ona przechowywana do dwóch tygodni. Przed użyciem należy upewnić się, że pH jest neutralne, ponieważ z czasem ulegnie ono zwiększeniu. Jeśli pH nie jest neutralne, należy ponownie przepłukać wełnę sterylnym solnym roztworem buforowanym fosforanem (pH 6,8).

2. Montaż filtra z wełny szklanej

1. Wywierć otwór o średnicy 11/16 cala w nasadkach z PVC i nacinaj gwinty, aby możliwe było wkręcenie nylonowych złączek z adapterem męskim w nasadki. Krok ten jest konieczny tylko przy pierwszym montażu. Następnie nasadki mogą być używane przez lata. Nałóż taśmę teflonową na gwinty złączek nylonowych i wkręć je w nasadki.
2. Wypełnij rurkę z PVC małymi kawałkami wełny szklanej. Do ciasnego upakowania użyj metalowego tłoka, np. zaworu silnika samochodowego. Upakowywanie nie wymaga dużej siły. Upakuj materiał na tyle ściśle, aby wełna szklana pozostała na miejscu i nie tworzyły się kanały. Jednak nie upakuj jej zbyt mocno, aby woda mogła przepływać przez filtr. Przy odpowiednim upakowaniu, przy podłączeniu filtra do kranów wodnych z ciśnieniem od 40-60 psi, powinno być możliwe osiągnięcie przepływu rzędu 4 do 5 litrów na minutę. Dla rozmiaru rurki z PVC określonego w tym protokole, na jedną rurkę zużywa się około 85 g wypłukanej i upakowanej wełny szklanej. Wyzeruj pustą rurkę z PVC na wadze górnej i wypełniaj ją wypłukaną wełną szklaną, aż masa rurki wzrośnie o 85 g.
3. Włóż siatkę z polipropylenu do nasadek z PVC z przymocowanymi nylonowymi złączkami z adapterem męskim.
4. Nałóż taśmę teflonową na gwintowane części rurki z PVC.
5. Przykręć nasadki z PVC do rurki z PVC i oznacz jeden koniec filtra jako wlot, a drugi jako wylot. Jest to istotne w późniejszym etapie elucji. To, który koniec zostanie oznaczony jako wlot, nie ma znaczenia.
6. Wprowadź 60 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (pH = 6.8) do filtra za pomocą strzykawki z końcówką cewnikową. Nadmiar wypłynie z przeciwległego końca.
7. Szczelnie owiń końce folią Parafilm, aby zapobiec wyciekom. Filtry można przechowywać do 30 dni w temperaturze 4°C.

3. Pobieranie próbek

1. Sterylizować węże używane do pobierania próbek poprzez recyrkulację lub zanurzenie elementów na 30 minut w 0,525% NaClO (tj. w 10% roztworze standardowego wybielacza domowego). Następnie należy spuścić roztwór podchlorynu i zneutralizować go 0,05% tiapplicantem sodu, przygotowanym przez dodanie 25 mL 2% roztworu zapasowego bezwodnego tiosiarczanu sodu do jednego litra wody z odwróconej osmozy.
2. W przypadku wody z próbki o pH wyższym niż 7,5, należy dostosować pH do wartości między 6,5 a 7,0 za pomocą HCl. Stężenie HCl może wynosić od 0,25 M do 1 M. Cztery litry 0,5 M HCl są zazwyczaj wystarczające dla dwóch próbek o objętości 800 litrów, w zależności od pH otoczenia i pojemności buforowej wody. HCl należy wstrzykiwać podczas pobierania próbek za pomocą pompy perystaltycznej lub Venturiego (Rycina 2). Dostosować prędkość pompy lub otwór Venturiego, aby osiągnąć docelowe pH. pH należy mierzyć na wylocie linii pobierania próbek za pomocą polowego pH-metru.
3. W przypadku zapchania filtra z wełny szklanej przez wodę o wysokiej mętności należy zastosować filtr wstępny. (Specyfikacje filtra wstępnego i jego obudowy znajdują się w internetowej liście materiałów). Ponieważ patogeny mogą być przyczepione do cząsteczek zatrzymanych przez filtr wstępny, musi on zostać poddany elucji wraz z filtrem z wełny szklanej (patrz poniżej).
4. Dostosować natężenie przepływu do wartości między 2 a 4 litrami/minutę. Typowe objętości próbek wynoszą od 200 do 1 500 litrów.
5. Odłączyć filtr z wełny szklanej i przechowywać w sterylnej plastikowej torbie w temperaturze 4°C przez maksymalnie 48 godzin.

4. Elucja

1. Przymocuj filtr z wełny szklanej do statywu z pierścieniem tak, aby koniec wlotowy dla próbki był skierowany w dół, do butelki z polipropylenu. Elucję przeprowadź w kierunku przeciwnym do przepływu próbki.
2. Przepchnij przez filtr 80 mL sterylnego 3% ekstraktu wołowego w 0,05 M glicynie o pH 9,5.
3. Odczekaj 15 minut.
4. Przepchnij przez filtr kolejne 80 mL sterylnego 3% ekstraktu wołowego w 0,05 M glicynie o pH 9,5.
5. Przepychaj powietrze przez filtr, aż z wlotu filtra zacznie wydostawać się piana.
6. Dostosuj pH eluatu do wartości między 7,0 a 7,5 za pomocą 1 M HCl.
7. Przechowuj eluat w temperaturze 4°C do 24 godzin lub w -20°C przez dłuższy czas.
8. Przeprowadź elucję z przedfiltru, jeśli był on użyty. Odkręć górną część obudowy wkładu i zlej całą pozostałą wodę z wnętrza obudowy, przytrzymując przedfiltr w miejscu dłońmi w sterylnych rękawiczkach.
9. Wyjmij przedfiltr z obudowy wkładu i włóż go do woreczka strunowego o wymiarach 15" x 6".
10. Wlej do woreczka 200 mL sterylnego 3% ekstraktu wołowego w 0,05 M glicynie o pH 9,5 i szczelnie zamknij go za pomocą zamknięcia strunowego.
11. Kilkukrotnie odwróć woreczek z przedfiltrem, aby upewnić się, że cała jego powierzchnia ma kontakt z ekstraktem wołowym.
12. Odczekaj 15 minut, okresowo odwracając i masując woreczek z przedfiltrem.
13. Otwórz zamknięcie strunowe. Mocno ściśnij woreczek wokół przedfiltru, aby wycisnąć jak najwięcej ekstraktu wołowego, a następnie wyjmij przedfiltr dłońmi w sterylnych rękawiczkach.
14. Przelej eluat z ekstraktu wołowego do butelki z polipropylenu.
15. Dostosuj pH eluatu do wartości między 7,0 a 7,5 za pomocą 1 M HCl.
16. Przechowuj eluat w temperaturze 4°C do 24 godzin lub w -20°C przez dłuższy czas. Eluat z przedfiltru można analizować oddzielnie pod kątem obecności patogenów lub połączyć z eluatem z filtra z wełny szklanej.

5. Reprezentatywne wyniki

Patogen	Poziom mętności wody (NTU) a	Ilość zaszczepiona/L b,c,d	% odzysku ± 1 SD	Liczba niezależnych prób
Enterovirus- Poliovirus Sabin III	0.5	500	81% ± 11	7
Enterovirus- Poliovirus Sabin III	0.5	5000	67% ± 12	8
Enterovirus- Poliovirus Sabin III	215	500	59% ± 32	7
Enterovirus- Poliovirus Sabin III	215	5000	38% ± 22	6
Enterovirus- Poliovirus Sabin III	447	500	56% ± 18	8
Enterovirus- Poliovirus Sabin III	447	5000	63% ± 37	8
Cryptosporidium parvum	0.5	5	38% ± 14	7
Cryptosporidium parvum	0.5	50	53% ± 19	8
Cryptosporidium parvum	215	5	40% ± 16	7
Cryptosporidium parvum	215	50	30% ±6	6
Cryptosporidium parvum	447	5	33% ± 13	8
Cryptosporidium parvum	447	50	28% ± 11	8
Salmonella enterica	0.5	5	29% ± 24	7
Salmonella enterica	0.5	500	56% ± 16	8
Salmonella enterica	215	5	32% ± 24	7
Salmonella enterica	215	500	34% ±11	6
Salmonella enterica	447	5	34% ± 18	8
Salmonella enterica	447	500	31% ± 24	8

1. Jednostka mętności nefelometrycznej
2. Enterowirusy zliczone metodą qPCR jako kopie genomowe/L
3. C. parvum zliczone metodą immunofluorescencji jako oocysty
4. S. enterica zliczone metodą hodowli jako jednostki tworzące kolonie

Tabela 1. Stężenie wełny szklanej przy zmiennej mętności wody i gęstości patogenów.

Patogen	Miejsce pobrania próbki wody	Ilość zaszczepiona/La	% odzysku
Avian Influenza H5N2	Sundi Lake, Anchorage Borough	2500	42.9%
Avian Influenza H5N2	Minto Flats, Fairbanks North Star Borough	2500	36.7%
Avian Influenza H5N2	Portage Valley, Anchorage Borough	2500	7.8%
Avian Influenza H5N2	Potter Marsh, Anchorage Borough	2500	41.5%
Avian Influenza H5N2	Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough	2500	15.5%

1. Zmierzono za pomocą qPCR jako kopie genomowe/L

Tabela 2. Koncentracja wirusa grypy ptaków na wełnie szklanej z wykorzystaniem wody z pięciu lokalizacji na Alasce.

Rycina 1. Schemat myjki z wełny szklanej. Może ona być stosowana zamiast wiadra, co pozwala zaoszczędzić czas podczas płukania. Koncepcja ta jest podobna do myjki do pipet szklanych.

Rycina 2. Filtracja przez watę szklaną z wstrzykiwaniem kwasu za pomocą pompy perystaltycznej. Należy zwrócić uwagę na złączkę w kształcie litery „T”, w której rurka pompy wprowadza kwas do linii z próbką pomiędzy kranem wodnym a filtrem z waty szklanej. Regulacja pH jest konieczna tylko wtedy, gdy pobrana woda ma pH > 7.5.

Filtry z wełny szklanej są skuteczne w zagęszczaniu patogenów z wody o szerokim zakresie mętności i gęstości patogenów (Tabela 1). Aby to sprawdzić, 20 litrów odchlorowanej wody z kranu zmieszano z wysuszonymi glebami pyłowymi (0, 1,27 lub 2,75 g/L), aby uzyskać pożądany poziom mętności, a następnie zaszczepiono patogenami o różnych gęstościach. Wodę przepuszczono przez filtr z wełny szklanej, a następnie policzono zagęszczone patogeny w eluate, co stanowiło licznik w obliczeniach procentowego odzysku. Ilość patogenów zaszczepionych do wody, czyli mianownik w obliczeniach procentowego odzysku, określono poprzez wcześniejsze zaszczepienie patogenów do eluatu ujemnego, a następnie ich policzenie. Eluat ujemny przygotowano poprzez przepuszczenie niezaszczepionej próbki o objętości 20 litrów przez filtr i przeprowadzenie elucji. Ilościowe oznaczenie zaszczepionych patogenów w eluacie ujemnym pozwala uniknąć różnic w liczeniu patogenów, które mogłyby wynikać z różnic w matrycy powstałych w wyniku filtracji wełną szklaną. Znaczenie tego kroku przy ilościowym oznaczaniu patogenów metodą qPCR omówiono w pracy Lambertini et al.³. Próbkę kontrolną ujemną o objętości 20 litrów zagęszczono za pomocą filtracji wełną szklaną, aby upewnić się, że nie występują w niej naturalne patogeny, które mogłyby zakłócić obliczenia procentowego odzysku. W przypadku poziomu mętności ≥ 215 NTU zastosowano przefiltrowanie wstępne przy użyciu filtra o nominalnej wielkości porów 10 μm.

Ilość poliwirusa określono za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym, wykorzystując procedury wtórnego zagęszczania i ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz startery i sondy opisane przez Lambertini et al.³. Ilość Cryptosporidium parvum określono w końcowej objętości próbki zagęszczonej (FCSV), otrzymanej w wyniku procedury wtórnego zagęszczania poliwirusa. Oocysty z wizualizowano za pomocą immunofluorescencji (MeriFluor Cryptosporidium & Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Ilość Salmonella enterica w FCSV określono poprzez wysiew na agar XLD (Remel, Lenexa, KS) i liczenie jednostek tworzących kolonie.

Filtry z wełny szklanej są skuteczne w zagęszczaniu wirusów grypy ptaków (Tabela 2). Wirus grypy ptaków o niskiej zjadliwości (H5N2) został zaszczepiony do próbek wody z kilku lokalizacji na Alasce, a procent odzysku obliczono zgodnie z powyższym opisem. Procedury wtórnego zagęszczania oraz izolacji kwasów nukleinowych przeprowadzono analogicznie jak w przypadku poliovirusa; wirusa oznaczono metodą qPCR, wykorzystując startery i sondę opisane przez Spackmana et al.⁴

Dyskusja

Filtry z wełny szklanej były wykorzystywane przez kilka zespołów badawczych^3,5,6 do zagęszczania ludzkich wirusów jelitowych z różnych źródeł wody, takich jak uzdatkowiona woda pitna⁷, woda podziemna^8,9, woda powierzchniowa¹⁰, woda morska¹¹, ścieki¹² oraz spływy rolnicze¹³. W niniejszej pracy wykazujemy, że filtry te są również skuteczne w zagęszczaniu wirusa grypy ptaków, a także bakterii i pierwotniaków chorobotwórczych: odpowiednio Salmon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas solny	Fisher Scientific	A144-500
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	BP359-212
Fosforanowy bufor solny Chlorek sodu Fosforan potasu(II) Fosforan potasu(I)	Fisher Scientific	BP358-212 BP363-500 BP362-500
Podchloran sodu t.j. wybielacz domowy	Clorox
Tiosiarczan sodu, bezwodny	Fisher Scientific	S 475-212
Ekstrakt wołowy, suszony	BD Biosciences	211520
Glicyna	Fisher Scientific	G46-500
Naoliwiona wełna szklana sodowo-wapniowa Lub niepowlekana izolacja z włókna szklanego R-11	Johns Manville	Bourre 725 QN
Siatka z polipropylenu	Industrial Netting	xN4510
Gwintowany nippel z PVC 2"x4" Sch 80	Grainger	6MW35
Zaślepka z PVC 2" Sch 40	Grainger	5WDW3
Nylonowy adapter zewnętrzny (1/2"x1/2")	US Plastic Corp.	62178
Butelki na eluat - 1 litr	Fisher Scientific	03-313-4F
Strzykawka 60 mL	Fisher Scientific	NC9661991
Paski pH	Whatman, GE Healthcare	2614 991
Prefiltr, polipropylenowy, wkład 10 cali, 10 μm	McMaster-Carr	4411K75
Obudowa prefiltra	Cole-Parmer	S-29820-10