Rozwój zapalenia obliteracyjnego oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepienia płuc

Podsumowanie

Zatarczeniowe zapalenie oskrzelików jest kluczową przeszkodą w długoterminowym przeżyciu biorców przeszczepów płuc, a brak wiarygodnego modelu przedklinicznego uniemożliwia badanie immunopatogenezy tego schorzenia. W przeciwieństwie do innych przeszczepów narządów miąższowych, transplantacja unaczynionego płuca mysiego została opracowana dopiero niedawno. W niniejszej pracy przedstawiamy opracowany przez nas model zatarczeniowego zapalenia oskrzelików po ortotopowym przeszczepieniu pojedynczego płuca myszy.

Streszczenie

O ortotopowym przeszczepie płuc u szczurów po raz pierwszy wspomnieli Asimacopoulos i współpracownicy w 1971 roku ¹. Obecnie metoda ta jest powszechnie akceptowana i standaryzowana nie tylko w badaniach nad odrzuceniem allogenicznym, ale także pomiędzy szczepami syngenicznymi w celu analizy mechanizmów uszkodzenia reperfuzyjnego po przeszczepie płuc. Choć zastosowanie modelu szczura oraz innych dużych zwierząt ² znacząco przyczyniło się do wyjaśnienia tych zagadnień, zakres tych badań jest ograniczony przez niedobór szczurów z nokautem genów oraz szczurów transgenicznych. Ze względu na brak skutecznych terapii zapalenia oskrzelików z obliteracją, będącego główną przyczyną zgonów pacjentów po przeszczepie płuc, prowadzono intensywne poszukiwania modeli przedklinicznych, które odwzorowywałyby zapalenie oskrzelików z obliteracją. Model alloprzeszczepu tchawicy jest najszerzej stosowany i może odtwarzać niektóre cechy histopatologiczne zapalenia oskrzelików z obliteracją ³. Jednak brak nienaruszonego układu naczyniowego i brak połączenia z drogami oddechowymi biorcy, a także niepełne cechy patologiczne zapalenia oskrzelików z obliteracją ograniczają użyteczność tego modelu ⁴. W przeciwieństwie do przeszczepiania innych narządów miąższowych, unaczynione przeszczepy płuc myszy zostały opisane po raz pierwszy dopiero w 2007 roku przez Okazaki i współpracowników ⁵. Stosując podstawowe zasady przeszczepu płuc szczura, nasze laboratorium zainicjowało model zapalenia oskrzelików z obliteracją przy użyciu ortotopowych przeszczepów pojedynczego lewego płuca u myszy z niedopasowaniem mniejszego antygenu histokompatybilnego, co pozwala na dalsze badanie immunopatogenezy zapalenia oskrzelików z obliteracją⁶.

Protokół

1. Procedura dawcy

1. Wszystkie procedury chirurgiczne przeprowadzono z zachowaniem techniki sterylnej. Ani myszy dawcy, ani myszy biorcy nie podawano antybiotyków.
2. Indukcję znieczulenia myszy dawcy rozpoczęto przy użyciu 5% izofluranu.
3. U myszy wykonano intubację przez otwór ustno-gardłowy przy użyciu cewnika dożylnego 20G, a następnie podłączono ją do respiratora dla gryzoni, stosując 100% tlenu z częstotliwością 125 oddechów/minutę i objętością oddechową około 0,5 ml (2% masy ciała).
4. Znieczulenie podtrzymywano za pomocą inhalacji 1-2% izofluranu.
5. Myszą dawcę ułożono w pozycji na plecach i przygotowano skórę za pomocą 70% alkoholu.
6. Laparosternotomię wykonano jako połączone cięcie w linii środkowej i poprzeczne.
7. Heparynę w dawce 100 u/kg wstrzyknięto do żyły głównej dolnej (IVC), tuż poniżej wątroby.
8. Przeponę przecięto wzdłuż brzusznego przyczepu żebrowego w kierunku kręgosłupa, a jamę klatki piersiowej odsłonięto, przecinając obie strony ściany klatki piersiowej aż do szyi.
9. Po przecięciu IVC na poziomie przepony, wycięto wyrostek prawego przedsionka i przepłukano płuca 2 ml schłodzonego (4 °C) roztworu Ringera z mleczanem oraz 0,1 ml heparyny poprzez cięcie poprzeczne u nasady pnia tętnicy płucnej (PA).
10. Zatrzymując wentylację w dwóch trzecich fazy końca wdechu, wycięto blok serce-płuca i przechowywano go w lodzie (4 °C).
11. Lewe płuco dawcy przygotowano dla biorcy poprzez zamocowanie mankietów. Przecięto więzadło płucne aż do żyły płucnej (PV). Wylot płuca odsłonięto poprzez usunięcie przełyku i aorty.
12. Zidentyfikowano PA, znajdującą się w najbardziej kranialnej części wylotu, a także dołączony do niej oskrzela główne (Br). Ostrożnie odseparowano PA od oskrzela.
13. Mankiet PA wykonano z cewnika dożylnego (I.V.) 24G i przycięto do długości 0,5 mm z przedłużeniem 0,7 mm.
14. Całą powierzchnię mankietu zatarto, aby ułatwić anastomozę.
15. Mankiet dla oskrzela wykonano z cewnika IV 20G i przycięto do długości 1,0 mm z przedłużeniem 0,7 mm.
16. Przy użyciu tych samych materiałów, rozmiar mankietu PV zależał od masy myszy dawcy. Konkretnie, dla myszy o masie 24-27 g rozmiar mankietu wynosił 22G, długość 0,7 mm z przedłużeniem 0,7 mm. Dla myszy o masie 27-32 g w badaniach wykorzystano cewnik 20G o długości 0,7 mm z przedłużeniem 0,7 mm.
17. Mankiet wprowadzono do końców dystalnych PA, PV oraz Br i zabezpieczono szwem 9-0.
18. Płuco dawcy przepłukano i przemyto sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem sterylnej heparyny przed przechowywaniem. Następnie płuco dawcy owinięto sterylną gazą nasączoną sterylną solą fizjologiczną w lodzie (4 °C), co pozwoliło zachować czystość i sterylność płuca.
19. Na oskrzela nałożono zacisk do mikro naczyń, aby zapobiec przedostaniu się roztworu Ringera z mleczanem do dróg oddechowych.

2. Procedura biorcy

1. Indukcja znieczulenia i wentylacja mechaniczna przebiegają tak samo, jak opisano powyżej dla dawcy.
2. Lewą ścianę klatki piersiowej ogalono i przygotowano za pomocą 70% alkoholu, a następnie pole operacyjne odizolowano sterylnymi obłożeniami.
3. Wykonuje się nacięcie torakotomiczne w lewej trzeciej przestrzeni międzyżebrowej, prowadząc nacięcie grzbietowo w pobliżu kręgosłupa, a następnie umieszcza się zacisk naczyniowy na lewych naczyniach płucnych i oskrzeli w sąsiedztwie serca. W górnej części widoczna jest PA, w końcowym odcinku wnęki PV, a pomiędzy nimi Br.
4. Stosując delikatną trakcję hemostatyka, aby wywołać lekki naciąg PA, Br i PV, lewe płuco zostaje wyciągnięte z jamy klatki piersiowej, pozostawiając zaklemowane centralne struktury wnęki.
5. PA, PV i Br izoluje się poprzez tępą dyssekcję, a następnie umieszcza się luźną sztywą 9-0 wokół PA, PV i Br.
6. Po całkowitym oddzieleniu PA od jej osłonki zewnętrznej, w ścianie przedniej wykonuje się niewielkie nacięcie poprzeczne obejmujące około jednej czwartej obwodu naczynia, pozostawiając nienaruszoną kontynuację tylnej części tętnicy.
7. Płuco dawcy, owinięte w zimną, nasączoną roztworem Lactated Ringer gazą bawełnianą i przygotowane zgodnie z powyższym opisem, zostaje umieszczone w jamie klatki piersiowej, a mankiety wprowadzone do PA, PV i Br biorcy oraz zabezpieczone szwem 9-0.
8. Zdejmuje się zacisk poprzeczny wnęki, umożliwiając reperfuzję i wentylację.
9. Po umieszczeniu przeszczepionego płuca z powrotem w klatce piersiowej biorcy, nacięcie torakotomiczne zamyka się szwem 5-0.
10. Mysz zostaje pozostawiona do wybudzenia z narkozy. Bezpośrednio po operacji oraz co 8 godzin przez 2-3 dni po zabiegu podaje się buprenorfinę (0,05-0,15 mg/kg).

3. Reprezentatywne wyniki

Nasze doświadczenie wykazało, że biegłość w modelu transplantacji płuc u myszy wymaga kilku miesięcy powtarzalnej praktyki. Po osiągnięciu biegłości uzyskaliśmy 96% przeżywalności okołooperacyjnej (96/100 kolejnych zabiegów), przy czym zgony nastąpiły w ciągu siedmiu dni po operacji. Dwa zgony były wynikiem krwawienia, które rozpoczęło się w trakcie operacji, a przyczyną śmierci pozostałych dwóch myszy był odma opłucnowa. We wszystkich procedurach czas ciepłego niedokrwienia wynosił 14,32 ± 3,14 minuty, a czas zimnego niedokrwienia 58,51 ± 18,06 minuty. Badano trzy grupy ortotopowej transplantacji płuc: izograft: C57BL/6→C57BL/6, allograft: C57BL/10→C57BL/6 oraz C57BL/6→C57BL/10. Wykorzystaliśmy wyłącznie samce myszy, jednak nasza technika może być stosowana również u samic, ponieważ nie występują istotne różnice anatomiczne między płciami.

Ocena stopnia patologii odrzucenia została przeprowadzona w sposób zaślepiony, przy wykorzystaniu standardowych kryteriów dla klinicznych transplantacji płuc⁷(Tabela 1). Podczas gdy w przypadku izoszczepów (C57BL/6→C57BL/6) zaobserwowano łagodne odrzucenie lub jego brak, obie kombinacje alloszczepów rozwinęły porównywalne odrzucenie ostre lub przewlekłe (Rysunek 1). Z kolei OB występował znacznie częściej w grupie C57BL/10→C57BL/6 niż w grupie C57BL/6→C57BL/10 do 28. dnia (Tabela 1).

	C57BL/6→ C57BL/6	C57BL/10→ C57BL/6	C57BL/6→ C57BL/10	Wartość P
Patologia odrzucenia Wyniki „A” w dniu 28	0.67±0.89	*3.33±0.82	*3.29±0.76	*P>0.05
OB/Całkowita liczba myszy w dniu 21 i 28	0/24 (0%)	**14/34 (42.1%)	**2/16 (12.5%)	**P<0.05

Tabela 1. Wyniki histologiczne odrzutania ostrego oraz rozpowszechnienie zapalenia oskrzelików z obliteracją po transplantacji. Ocena odrzutania ostrego (wyniki „A”) według standardowych kryteriów opisanych w reprezentatywnych wynikach. Dane przedstawiają średnią ± SD wyników „A” w 28. dniu po transplantacji. Dane przedstawiają liczbę i procent myszy w każdej grupie, u których rozwinęła się OB w 21. i 28. dniu po transplantacji.

Rysunek 1. Wyniki makroskopowe i histopatologia w 28. dniu po transplantacji płuc. Panel 1A przedstawia wyniki makroskopowe oraz barwienie H&E izoszczepu płuca i prawego płuca naiwnego. Panele 1B i 1C przedstawiają barwienie H&E oraz trichromem Massona alloszczepu płuca BL/10 przeszczepionego myszy biorcy BL/6, w których odpowiednio rozwinął się OB i brak OB. Biała strzałka w 1B wskazuje zmiany OB. Panel 1D przedstawia alloszczep płuca BL/6 przeszczepiony myszy biorcy BL/10.

Główne problemy rozwiązane w trakcie procedury były następujące.

1. Zaburzenia przepływu krwi: Płukanie płuca dawcy do momentu, aż nabierze ono białego koloru. Zastosowanie nadmiernego ciśnienia może doprowadzić do obrzęku płuc. Należy jednak unikać zbyt intensywnego płukania, aby zapobiec obrzękowi po przeszczepie.
2. Trudności z wprowadzeniem mankietu do dawcy: Należy upewnić się, że naczynia krwionośne mają odpowiednią długość i są wolne od przylegającego tłuszczu oraz tkanek łącznych.
3. Krwawienie w miejscu anastomozy: Należy użyć patyczków higienicznych, aby wywrzeć ucisk w dotkniętym miejscu przez około 5 minut.
4. Zator przepływu krwi w tętnicy płucnej (PA) biorcy: Spowodowany głównie skręceniem naczynia podczas wprowadzania mankietu. Jeśli w PA zostanie zaobserwowane powietrze, konieczne jest ponowne wykonanie anastomozy.
5. Trudna anastomoza żyły płucnej (PV): Błona PV jest bardzo cienka i łatwo ulega rozerwaniu. Należy dobrać odpowiedni rozmiar mankietu i wprowadzić go prosto do PV biorcy, czyniąc to bardzo delikatnie.
6. Zator przepływu krwi w żyle płucnej (PV) biorcy: Należy sprawdzić położenie i kierunek mankietu. Należy zwolnić ucisk mankietu oskrzelowego.
7. Odma opłucnowa: Może być spowodowana albo perforacją oskrzeli wskutek manipulacji w drogach oddechowych, albo perforacją powierzchni płuca na skutek urazu związanego z procedurą przeszczepu. W pierwszym przypadku stosuje się chirurgiczne zamknięcie otworu w ścianie dróg oddechowych, a w drugim – zaszycie przecieku na powierzchni płuca przy użyciu nici nylonowej 10-0.

Dyskusja

Ortotopowy przeszczep płuc u myszy jest trudny ze względu na wymagania mikrochirurgiczne oraz ekstremalną kruchość tkanek. Wprowadzenie techniki mankietowej umożliwiło powszechne stosowanie ortotopowego przeszczepu płuc u szczurów⁸. Stało się to podstawą do opracowania w naszym laboratorium modelu ortotopowego przeszczepu płuc u myszy. U myszy i szczurów, w przeciwieństwie do ludzi, lewe płuco składa się tylko z jednego płata i stanowi jedynie 25% całkowitej masy płuc. Dzięki temu jednopłatowy przeszczep lewego płuca jest możliwy do wykonania w modelu mysim bez konieczności stosowania systemu wspomagania krążenia.

Nasze wstępne operacje wykazały, że wentylacja i perfuzja przeszczepionego płuca były w dużym stopniu zależne od rozmiaru anastomozy żyły płucnej (PV). Aby dopasować dawcę do biorcy, zastosowano konkretne rozmiary mankietów anastomozy PV, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami⁹. Niewłaściwy dobór rozmiaru mankietu prowadził albo do niedodmy przeszczepionego płuca, albo do rozejścia się anastomozy PV. Okazaki et al opisali zastosowanie połączonego podwiązania naczyń i zaciskania oskrzela⁵. W niniejszym badaniu we wszystkich strukturach wnęki zastosowaliśmy zacisk naczyniowy (do tętniaków), co w naszej ocenie może skrócić czas ciepłego niedokrwienia. Jednym z ograniczeń ortotopowego przeszczepu lewego płuca w modelu mysim jest fakt, że zwierzęta biorcy mogą przeżyć po nekrozie allograftów indukowanej odpowiedzią alloimmunologiczną⁵. W związku z tym badania przeżywalności nie są wykonalne, a ocena przeszczepu opiera się na badaniu histologicznym przeszczepionego płuca¹⁰.

Wykorzystując tę technikę opracowaliśmy przedkliniczny model zapalenia bronchiolów z obowiązującym zwłóknieniem (obliteracyjnego zapalenia bronchiolów) u myszy. W szczególności mysz dawca to szczep C57BL/10, a biorca to C57BL/6. Sugeruje to rolę mniejszych, a nie głównych antygenów zgodności tkankowej w patogenezie obliteracyjnego zapalenia bronchiolów⁶. Ponadto wykazaliśmy, że neutralizacja IL-17 zapobiega obliteracyjnemu zapaleniu bronchiolów w modelu mysim. Model ten stanowi nowe narzędzie badawcze do analizy transplantacji płuc oraz rozwoju klinicznych przeszczepów płuc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zeiss Opmi 6SFC-1880	Prescott’s Inc	PMZ014
Respirator dla gryzoni Harvard	Harvard Apparatus	55-7058
kaniula do dożylnego podawania leków (I.V.) o rozmiarze 20G	Terumo Medical Corporation	100510D
kaniula dożylna 22G	Terumo Medical Corporation	081015S
kaniula dożylna 24G	Terumo Medical Corporation	100522A
9/0 Methylenowe Błękitne Jedwabne Nieskażone	Ashaway Line Twine Mfg. CO	MBVS-90
Szew chirurgiczny Alcon 10-0	Alcon Laboratories, Inc.	8065-192101
Czarny pleciony jedwab 5-0/18 cali	Henry Schein	M652630
Heparyna sodowa 1000 j./ml	APP Pharmaceuticals	407156
Roztwór Betadine	Produkt Purdue	67618-150
roztwór Laktatu Ringera do zastrzyków	Hospira	NDC 0409-7953-03
C57BL/10	Harlan Sprague-Dawley	8–12 tygodni, 25–30 g	Mężczyzna, dawca
C57BL/6	Harlan Sprague-Dawley	8–12 tygodni, 25–30 g	Mężczyzna, dawca lub biorca
Tabela 2. Tabela myszy, specyficznych odczynników i sprzętu.