Rozwój zarostowego zapalenia oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepu płuc

Podsumowanie

Zacierające zapalenie oskrzelików jest kluczową przeszkodą dla długoterminowego przeżycia biorców przeszczepu płuc, a brak solidnego modelu przedklinicznego uniemożliwia zbadanie immunopatogenezy zacierającego zapalenia oskrzelików. W przeciwieństwie do innych przeszczepów narządów litych, unaczyniony przeszczep płuc myszy został opracowany dopiero niedawno. Tutaj pokazujemy nasz niezależnie opracowany model zarostowego zapalenia oskrzelików po mysim ortotopowym przeszczepie jednego płuca.

Streszczenie

Ortotopowy przeszczep płuc u szczurów został po raz pierwszy opisany przez Asimacopoulosa i współpracowników w 1971 roku ¹. Obecnie metoda ta jest dobrze akceptowana i standaryzowana nie tylko do badania odrzucenia allo, ale także między szczepami syngenicznymi w celu zbadania mechanizmów uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego po przeszczepie płuc. Chociaż zastosowanie modelu ² na szczurach i innych dużych zwierzętach znacząco przyczyniło się do wyjaśnienia tych badań, zakres tych badań jest ograniczony ze względu na niedobór szczurów z nokautem i transgenicznych. Ze względu na brak skutecznych terapii zarostowego zapalenia oskrzelików, które jest główną przyczyną zgonów u pacjentów po przeszczepie płuc, trwają intensywne poszukiwania modeli przedklinicznych, które replikują zarostowe zapalenie oskrzelików. Model alloprzeszczepu tchawicy jest najczęściej stosowany i może odtwarzać niektóre cechy histopatologiczne zarostowego zapalenia oskrzelików ³. Jednak brak nienaruszonego układu naczyniowego bez połączenia z przewodzącymi drogami oddechowymi biorcy oraz niepełne patologiczne cechy zarostowego zapalenia oskrzelików ograniczają użyteczność tego modelu ⁴. W przeciwieństwie do przeszczepów innych narządów litych, unaczynione przeszczepy płuc myszy zostały po raz pierwszy opisane przez Okazakiego i współpracowników dopiero niedawno, w 2007 ^roku. Stosując podstawowe zasady przeszczepu płuc szczura, nasze laboratorium zainicjowało model zarostowego zapalenia oskrzelików przy użyciu drobnych histoniezgodnych histopiście mysich ortotopowych przeszczepów pojedynczego lewego płuca, co pozwala na dalsze badania nad immunopatogenezą zarostowego zapalenia oskrzelików⁶.

Protokół

1. Procedura dawcy

1. Wszystkie zabiegi chirurgiczne zostały wykonane techniką sterylną. Nie podaje się antybiotyków zarówno myszom dawcom, jak i biorcom.
2. Indukcję znieczulenia myszy dawcy rozpoczyna się od 5% izofluranu.
3. Mysz jest intubowana jamy ustnej i tchawicy za pomocą cewnika dożylnego o rozmiarze 20G, a następnie umieszczana na respiratorze gryzoni, przy użyciu 100% tlenu z szybkością 125 oddechów na minutę i około 0,5 ml objętości oddechowej (2% masy ciała).
4. Znieczulenie utrzymuje się za pomocą wziewnego 1-2% izofluranu.
5. Mysz dawcę umieszcza się w pozycji leżącej, zaprawioną 70% alkoholem.
6. Laparorosternotomia jest wykonywana jako połączone nacięcie w linii środkowej i poprzecznej.
7. Heparyna w stężeniu 100 j./kg jest wstrzykiwana do żyły głównej dolnej (IVC) tuż poniżej wątroby.
8. Przepona jest przecinana wzdłuż brzusznego przyczepu żebrowego w kierunku kręgosłupa, a jama piersiowa jest odsłaniana poprzez przecięcie obu stron ściany klatki piersiowej do szyi.
9. Po nacięciu IVC na poziomie przepony przecina się prawy uszek przedsionka i przepłukuje płuca 2 ml schłodzonego (4 °C) wstrzyknięcia Ringera z mleczanami i 0,1 ml heparyny przez poprzeczne nacięcie u nasady pnia tętnicy płucnej (PA).
10. Zatrzymując wentylację przy dwóch trzecich napompowania końcowo-oddechowego, blok płuco-serce jest wycinany i przechowywany na lodzie (4 °C).
11. Lewe płuco dawcy jest przygotowywane dla biorcy poprzez założenie mankietów. Więzadło płucne jest nacięte aż do żyły płucnej (PV). Wnęka jest wydobywana przez usunięcie przełyku i aorty.
12. Zidentyfikuj PA, znajdujący się w najbardziej czaszkowym aspekcie wnęki, a także przyczepione oskrzela główne (Br). Ostrożnie wypreparuj PA z oskrzeli.
13. Mankiet PA jest wykonany z cewnika dożylnego (IV) o rozmiarze 24 i przycięty do długości 0,5 mm z przedłużeniem 0,7 mm.
14. Cała powierzchnia mankietu jest następnie ścierana, aby ułatwić zespolenie.
15. Mankiet na oskrzela pochodzi z cewnika dożylnego o rozmiarze 20 i jest cięty na długość 1,0 mm z przedłużeniem 0,7 mm.
16. Wykonany z tych samych materiałów mankiet PV zmienia się w zależności od wagi myszy dawcy. W szczególności dla myszy o wadze 24-27 gramów rozmiar mankietu to 22 mm, 0,7 mm długości z przedłużeniem 0,7 mm. W przypadku myszy o wadze 27-32 gramów w badaniach wykorzystano cewnik o rozmiarze 20 mm o długości 0,7 mm z przedłużeniem 0,7 mm.
17. Mankiety są wkładane do dystalnych końców PA, PV i Br i zabezpieczane szwem 9-0.
18. Płuco dawcy jest przepłukiwane i przemywane sterylnym roztworem soli fizjologicznej ze sterylną heparyną przed przechowywaniem. Płuco dawcy jest następnie owijane sterylną gazą nasączoną sterylnym roztworem soli fizjologicznej na lodzie (4 °C), który utrzymuje płuca w czystości i sterylności.
19. Zacisk mikronaczyniowy jest umieszczony na oskrzelach, aby zapobiec przedostawaniu się Lactated Ringer do dróg oddechowych.

2. Procedura odbiorcy

1. Indukcja znieczulenia i wentylacja mechaniczna są takie same, jak opisano dla dawcy powyżej.
2. Lewa ściana klatki piersiowej jest ogolona i przygotowana 70% alkoholem, a pole operacyjne jest udrapowane.
3. W lewej trzeciej przestrzeni międzyżebrowej wykonuje się nacięcie torakotomii, przedłużając nacięcie grzbietowo blisko kręgosłupa, a na lewe naczynia płucne i oskrzela przylegające do serca umieszcza się zacisk mikronaczyniowy. Możesz zobaczyć PA w aspekcie czaszkowym, PV na ogonowym końcu wnęki i Br między nimi.
4. Używając delikatnej trakcji na hemostacie w celu wywołania łagodnego napięcia PA, Br i PV, lewe płuco jest wyciągane z jamy piersiowej, pozostawiając zaciśnięte centralne struktury wnękowe.
5. PA, PV i Br są izolowane przez rozwarstwienie, a następnie umieszczanie szwu 9-0 luźno umieszczonego wokół PA, PV i Br.
6. Po całkowitym wycięciu PA z pochewki przybyszowej, w przedniej ścianie wykonuje się małe poprzeczne nacięcie około jednej czwartej obwodu naczynia, pozostawiając nienaruszoną kontynuację grzbietowej części tętnicy.
7. Płuco dawcy, owinięte zimną, nasączoną mleczanami gazą bawełnianą nasączoną Ringerem i przygotowane w sposób opisany powyżej, umieszcza się następnie w jamie klatki piersiowej, a mankiety wkłada się do biorcy PA, PV i Br i zabezpiecza szwem 9-0.
8. Zacisk krzyżowy wnękowy jest usuwany, co pozwala na reperfuzję i wentylację.
9. Po umieszczeniu przeszczepionego płuca z powrotem w klatce piersiowej biorcy, nacięcie torakotomii zamyka się za pomocą szwu 5-0.
10. Mysz może dojść do siebie po znieczuleniu. Buprenorfinę (0,05-0,15 mg/kg) podaje się bezpośrednio po zabiegu oraz co 8 godzin przez 2-3 dni po zabiegu.

3. Reprezentatywne wyniki

Nasze doświadczenie nauczyło nas, że potrzeba kilku miesięcy wielokrotnej praktyki, aby stać się biegłym w modelu przeszczepu płuc u myszy. Po osiągnięciu biegłości osiągnęliśmy 96% (96/100 kolejnych operacji) wskaźnik przeżycia okołooperacyjnego, przy czym zgony nastąpiły w ciągu siedmiu dni po operacji. Dwa zgony były spowodowane krwawieniem, które rozpoczęło się śródoperacyjnie, a odma opłucnowa była przyczyną śmierci pozostałych dwóch myszy. Dla wszystkich zabiegów czas ciepłego niedokrwienia wynosił 14,32 ± 3,14 minuty, a czas zimnego niedokrwienia wynosił 58,51± 18,06 minuty. Badano trzy grupy ortotopowych przeszczepów płuc: izograft: C57BL/6→C57BL/6, przeszczep allogeniczny: C57BL/10→C57BL/6 i C57BL/6→C57BL/10. Użyliśmy tylko samców myszy, ale naszą technikę można również zastosować do samic myszy, ponieważ nie ma znaczącej różnicy anatomicznej między płciami.

Ocena patologii odrzucenia została przeprowadzona w sposób zaślepiony, przy użyciu standardowych kryteriów klinicznego przeszczepu płuc⁷(Tabela 1). Podczas gdy zaobserwowaliśmy łagodne odrzucenie lub brak odrzucenia w przeszczepie (C57BL / 6→C57BL / 6), obie kombinacje przeszczepów allogenicznych rozwinęły porównywalne ostre lub przewlekłe odrzucenie (ryc. 1). Natomiast OB występował istotnie częściej w grupie C57BL/10→C57BL/6 niż C57BL/6→C57BL/10 do dnia28 (Tabela 1).

  C57BL/6→
Zobacz materiał C57BL/6 C57BL/10→
Zobacz materiał C57BL/6 C57BL/6→
Zobacz materiał C57BL/10 Wartość P Patologia odrzucenia
Wyniki "A" w dniu 28 0,67±0,89 *3,33±0,82 *3,29±0,76 *P>0,05 OB / Myszy ogółem w 21 i 28 dniu 0/24 (0%) **14/34 (42,1%) **2/16 (12,5%) **P <0,05

Tabela 1. Wyniki histologiczne ostrego odrzucenia i częstości występowania zarostowego zapalenia oskrzelików po przeszczepie. Punktacja ostrego odrzucenia (punktacja "A") według standardowych kryteriów, jak opisano w reprezentatywnych wynikach. Dane reprezentują średnią ± SD wyników "A" w 28 dniu po przeszczepie. Dane reprezentują ilość i odsetek myszy w każdej grupie, u których rozwinął się OB w 21 i 28 dniu po przeszczepie.

Rysunek 1. Wyniki makroskopowe i histopatologia po 28 dniach od przeszczepienia płuc. Panel 1A przedstawia wyniki makroskopowe i zabarwione H&E przeszczep płuca i prawego płuca naiwnego. Panele 1B i 1C reprezentują alloprzeszczep płuc BL/10 barwiony trichromem BL/10 firmy Masson przeszczepiony myszemu biorcy BL/6, u którego rozwinęły się odpowiednio OB i non OB. Biała strzałka w 1B identyfikuje zmiany w OB. Panel 1D pokazuje alloprzeszczep płuca BL/6 przeszczepiony myszemu biorcy BL/10.

Główne rozwiązywanie problemów podczas procedury było następujące.

1. Zaburzenie przepływu krwi: Przepłucz płuco dawcy, aż kolor stanie się biały. Stosowanie nadmiernego ciśnienia może wywołać obrzęk płuc. Ale nie naciskaj zbyt mocno, aby zapobiec obrzękowi po przeszczepie.
2. Trudność z włożeniem mankietu do dawcy: Upewnij się, że układ krwionośny jest wystarczająco długi i wolny od przyczepionego tłuszczu i tkanki łącznej.
3. Krwawienie w miejscu zespolenia: Użyj końcówek Q, aby uciskać dotknięte miejsce przez około 5 minut.
4. Niedrożność przepływu krwi PA biorcy: Głównie spowodowana skręceniem podczas zakładania mankietu. Jeśli w PA obserwuje się powietrze, konieczne jest ponowne wykonanie zespolenia.
5. Trudne zespolenie PV: Membrana PV jest bardzo cienka i łatwo się rozrywa. Wybierz odpowiedni rozmiar mankietu i bardzo delikatnie włóż go prosto do PV odbiorcy.
6. Przeszkoda w przepływie krwi PV biorcy: Upewnij się, że pozycja i kierunek mankietu. Zwolnić ucisk z mankietu oskrzelowego.
7. Odma opłucnowa: Może to być spowodowane perforacją oskrzeli spowodowaną manipulacją dróg oddechowych lub perforacją powierzchni płuc z powodu urazu związanego z zabiegiem przeszczepu. Ten pierwszy leczy się chirurgicznym zamknięciem otworu w ścianie dróg oddechowych; A ten ostatni leczy się poprzez przeszycie wycieku na powierzchni płuc za pomocą nylonowego szwu 10-0.

Dyskusja

Ortotopowy przeszczep płuc u myszy jest trudny ze względu na wymagania mikrochirurgiczne i ekstremalną kruchość tkanek. Wprowadzenie techniki mankietowej pozwoliło na powszechne zastosowanie ortotopowego przeszczepu płuc u szczurów⁸. Stało się to podstawą do opracowania ortotopowego modelu przeszczepu płuc u myszy w naszym laboratorium. U myszy i szczurów, w przeciwieństwie do ludzi, lewe płuco zawiera tylko jeden płat i stanowi tylko 25% całkowitej masy płuc. To sprawia, że przeszczep lewego pojedynczego płuca jest możliwy w modelu mysim bez konieczności stosowania systemu wspomagania krążenia.

Nasze wstępne operacje wykazały, że wentylacja i perfuzja przeszczepionego płuca była w dużym stopniu zależna od wielkości zespolenia PV. Specyficzny rozmiar mankietu zespolenia PV został wykorzystany do dopasowania dawcy i biorcy, jak zgłoszono⁹. Niewłaściwy rozmiar mankietu powodował albo niedodmę przeszczepionego płuca, albo rozejście się zespolenia PV. Okazaki i wsp. poinformowali o zastosowaniu połączonego podwiązania naczyń krwionośnych i przycinania oskrzeli⁵. W niniejszym badaniu stosujemy klips do tętniaka dla wszystkich struktur wnękowych, co naszym zdaniem może skrócić czas ciepłego niedokrwienia. Jednym z ograniczeń ortotopowego przeszczepu lewego płuca w modelu mysim jest to, że zwierzęta biorcy mogą przeżyć po alloimmunologicznej martwicy ich alloprzeszczepów⁵. W związku z tym badania przeżycia nie są możliwe, a ocena przeszczepu zależy od badania histologicznego przeszczepionego płuca¹⁰.

Korzystając z tej techniki, opracowaliśmy przedkliniczny model zarostowego zapalenia oskrzelików u myszy. W szczególności mysz dawcy to C57BL/10, a biorca to C57BL/6. Sugeruje to rolę mniejszych, a nie głównych antygenów zgodności tkankowej w obliteracyjnej patogenezie zapalenia oskrzelików⁶. Ponadto informowaliśmy, że neutralizacja IL-17 zapobiega zacierającemu zapaleniu oskrzelików w modelu mysim. Model ten stanowi nowatorskie narzędzie badawcze do badania przeszczepów płuc i postępu klinicznych przeszczepów płuc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zeiss Opmi 6SFC-1880	Prescott’ s Inc	PMZ014
Harvard Respirator do gryzoni	Aparat Harvard	55-7058
Cewnik dożylny o średnicy 20 mm	Terumo Medical Corporation	100510D
Cewnik dożylny o rozmiarze 22	Terumo Medical Corporation	081015S
Cewnik dożylny o rozmiarze 24	Terumo Medical Corporation	100522A
9/0 Meth Blue Virgin Silk	Ashaway Line Sznurek Mfg. CO	MBVS-90
10-0 Nici chirurgiczne Alcon	Alcon Laboratories, Inc	8065-192101
pleciony jedwab 5-0 / 18 cali	Henry Schein	M652630
Heparyna Sód 1000 jednostek/ml	APP Pharmaceuticals	407156
Roztwór betadyny Purdue	Produkt 67618-150
Mleczan Iniekcja Ringera	Hospira	NDC 0409-7953-03
C57BL/10	Harlan Sprague-Dawley	8-12 tygodni, 25-30g	Mężczyzna, Dawca
C57BL/6	Harlan Sprague-Dawley	8-12 tygodni, 25-30g	Mężczyzna, Dawca lub biorca
Tabela 2. Tabela myszy, odczynniki i sprzęt.