Artykuł metodologiczny

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/3951

⸱

28 października 2012

 , 
1Department of Engineering, University of California, Merced

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do ustanowienia kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) po izolacji blastocysty wykorzystano embrionalne fibroblasty mysie (MEFs)1. Ten system komórek zasilających (feeder system) zapobiega spontanicznej różnicowaniu się hESCs podczas ekspansji komórkowej. Jednak ta metoda kokultury jest pracochłonna, wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu i skutkuje niską czystością hESC4. Wiele laboratoriów próbowało zminimalizować liczbę komórek zasilających w kulturach hESC (np. poprzez zastosowanie naczyń powlekanych macierzą lub innych typów komórek zasilających5-8). Te zmodyfikowane systemy hodowli wykazały pewien potencjał, ale nie zastąpiły standardowej metody hodowli hESCs z wykorzystaniem embrionalnych fibroblastów mysich traktowanych mitycyną C w celu opóźnienia niepożądanej spontanicznej różnicowania kultur hESC. W związku z tym komórki zasilające użyte podczas ekspansji hESC powinny zostać usunięte podczas eksperymentów nad różnicowaniem. Chociaż dostępnych jest kilka technik oczyszczania kolonii hESC z komórek zasilających (FACS, MACS lub zastosowanie wektorów opornych na leki), techniki te są pracochłonne, kosztowne i/lub niszczące dla hESC. Celem niniejszego projektu było opracowanie metody oczyszczania umożliwiającej pozyskanie czystszej populacji hESCs. Zaobserwowaliśmy, że w konfluencyjnej kulturze hESC populację MEF można usunąć za pomocą prostego i szybkiego odessania warstwy MEF. Usunięcie to zależy od kilku czynników, w tym od bocznego wiązania komórka-komórka MEF, które wykazują mniejsze powinowactwo wiązania do styrenowego naczynia hodowlanego, oraz od zdolności kolonii komórek macierzystych do wypierania fibroblastów na zewnątrz podczas tworzenia własnej „niszy”. Następnie badano ekspresję SSEA-4, Oct3/4 oraz Tra 1-81 w hESC do 10 dni po usunięciu MEF, aby zapewnić utrzymanie pluripotencji. Co więcej, kolonie hESC były w stanie nadal rosnąć, tworząc większe formacje po usunięciu MEF, co zapewniło dodatkowy etap ekspansji hESC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mysich embrionalnych komórek karmicielskich

  1. MEF użyte do kokultury z hESC powinny zostać wcześniej poddane naświetlaniu lub traktowaniu mitomycyną C, aby zapobiec ich podziałom.
  2. Na dwie godziny przed wysianiem MEF, pokryj każdą 60 mm szalkę hodowlaną traktowaną plazmą 2 ml 0,05% żelatyny.
  3. Rozmroź fiolkę z potraktowanymi MEF i wysiej w zagęszczeniu ~20 000 komórek/cm2.
  4. Pozostaw komórki do przyczepienia na noc.

2. Współwysiew hESC na MEF

  1. Nowe kolonie można inicjować z kultur kriokonserwowanych lub poprzez pasażowanie bieżących kultur na nowe płytki pokryte MEF, zgodnie z poniższą procedurą.
  2. Płytkę zawierającą duże kolonie hESC przeznaczone do pasażowania przemyć 1 raz 3 ml podgrzanego 1x PBS.
  3. Dodać 3 ml roztworu kolagenazy IV/PBS (1 mg/ml) i inkubować przez 5-10 min w 37 °C. (Uwaga: Komórki nie oddzielą się od siebie ani nie zwinią w kulki, co ma miejsce w przypadku stosowania trypsyny).
  4. Gdy komórki wciąż znajdują się w kolagenazie, krawędzią końcówki pipety 5 ml narysować na koloniach wzór w kratkę, rozbijając je na małe skupiska komórek.
  5. Używając końca końcówki pipety (trzymanej prostopadle do płytki hodowlanej), zeskrobać dno płytki hodowlanej, odrywając wszystkie komórki od powierzchni.
  6. Przenieść komórki do probówki Falcon i wirować przy (1000 rpm) przez 5 min.
  7. Po wirowaniu odessać medium, pozostawiając pellet komórkowy w probówce Falcon.
  8. Odessać medium MEF z komórek MEF wysianych dzień wcześniej.
  9. Przesiać komórki w stosunku 1:3 z płytki wyjściowej i podkarmić 3 ml medium hESC.

3. Usuwanie MEF z kokultury

Uwaga: Hodowle ludzkich ESC muszą być o wysokiej gęstości, zazwyczaj między 10 a 14 dniem hodowli.

  1. Umieść końcówkę pipety aspiracyjnej przy krawędzi płytki i pozwól, aby siła ssania delikatnie uniosła krawędź warstwy MEF.
  2. Odsaj cały pożywkę z naczynia, pozwól końcówce uchwycić warstwę komórek i powoli przesuń ją łukowatym ruchem nad płytką. Uwaga: Warstwa komórek może zatkać końcówkę pipety, ale nie stanowi to problemu, ponieważ nie powinno to przeszkodzić w ręcznym odciągnięciu warstwy z powierzchni płytki hodowlanej. Jeśli komórki przykleją się do końcówki aspiratora, można wykorzystać krawędź naczynia hodowlanego, aby rozbić warstwę komórek w celu całkowitej aspiracji.
  3. Niezwłocznie uzupełnij pożywkę dla hESC i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.

4. Reprezentatywne wyniki

Końcowym wynikiem procesu usuwania MEF są niewielkie, niezakłócone kolonie hESC (Rysunek 1D), zdolne do znacznej ekspansji w bardzo duże kolonie (Rysunek 2) przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji markerów pluripotencji SSEA-4, Oct 4 i Tra 1-81 (Rysunek 3).

Stem cell colony growth, microscope image, cellular differentiation analysis, biological research.
Rysunek 1. Morfologia kolonii ESC przed i po usunięciu MEF. Kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w A) dzień 1 i B) drugi dzień po wysianiu na naczynia hodowlane. C) Wysoka gęstość Kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (H7) otoczone przez MEF. Dwie kolonie hESC zostały obrysowane czerwonymi przerywanymi liniami. D) Po usunięciu MEF za pomocą opisanego techniki aspiracji, otrzymujemy wyizolowaną kolonię hESC z bardzo niewielką liczbą MEF otaczających nienaruszoną kolonię.

Wzrost komórek w ciągu 10 dni; obraz mikroskopowy ekspansji kolonii komórek; eksperyment time-lapse.
Rycina 2. Ekspansja kolonii ESC 10 dni po usunięciu MEF. Oryginalna kolonia hESC bezpośrednio po usunięciu MEF (lewa strona) rozrasta się w bardzo dużą kolonię (prawa strona) o średnicy około 800 μm, powiększenie 10x. Należy zauważyć, że oryginalna kolonia została zobrazowana przy tym samym powiększeniu (10x), co kolonia złożona.

Obrazy mikroskopowe komórek macierzystych wykazujące barwienie DAPI, SSEA-4, Oct3/4, Tra-1-81, Flk-1 i DDR2.
Rycina 3. Immunobarwienie kolonii hESC pozbawionych MEF. Identyfikacja immunofluorescencyjna kolonii do 10 dni po usunięciu MEF wykazuje, że kolonie utrzymują ekspresję markerów pluripotencji, co potwierdzają barwienia na Oct 3/4, SSEA-4 i Tra-1-81. Ponadto kolonie hESC nie wykazują różnicowania w kierunku mezodermalnym, na co wskazuje brak ekspresji Flk-1. A, E, I i M) to obrazy w świetle przechodzącym kolonii barwionych immunofluorescencyjnie, odpowiednio przy powiększeniu 20x, 10x, 10x i 2x. B, F, J i N) pokazują jądra komórkowe – komórki barwione DAPI w koloniach barwionych immunofluorescencyjnie, odpowiednio przy powiększeniu 20x, 10x, 10x i 2x. C-D) pokazują wyłącznie ekspresję markera ludzkich komórek macierzystych SSEA-4 oraz obraz złożony, 20x. G-H) pokazują wyłącznie ekspresję markera ludzkich komórek macierzystych Oct 3/4 oraz obraz złożony, 10x. K-L) pokazują wyłącznie ekspresję markera ludzkich komórek macierzystych Tra 1-81 oraz obraz złożony, 10x. M-P) Ostatni rząd obrazów przedstawia kolonię wykazującą typowe gładkie krawędzie widoczne przy tym powiększeniu, 2x; kolonie te nie wykazywały ekspresji O) Flk-1, wczesnego markera różnicowania mezodermy, ani nie P) zawierały fibroblastów, co potwierdza brak barwienia DDR2.

Wideo uzupełniające. Usuwanie fibroblastów poprzez aspirację warstwy. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda przedstawiona w niniejszym manuskrypcie oferuje szybką i mniej kosztowną alternatywę dla eliminacji komórek żerujących fibroblastów z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Skuteczne usunięcie fibroblastów zależy od powstania ściśle zlanej monowarstwy tych komórek, która rozwija się w dłuższych hodowlach komórek macierzystych. Po 7–10 dniach rosnące kolonie hESC będą wypychać fibroblasty żerujące na zewnątrz, tworząc coraz gęstszą monowarstwę fibroblastów pomiędzy koloniami. Silne połączenia międzyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była finansowana z grantu New Faculty Award II przyznanego przez California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1) oraz National Research Award finansowanego przez NIH (F32-HL104924)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DDR2Santa Curz7555Marker fibroblastów
DapiCalbiochem268298Marker jąder komórkowych
SSEA-4MilliporeMAB4304Marker ludzkich hESC
Oct 3/4 Santa Cruz9081Marker ludzkich hESC
Flk-1 BD Pharma555307Marker wczesnego różnicowania
Tra-1-81AcrisAM20377AF4-SMarker ludzkich hESC
Tabela 1. Tabela specyficznych odczynników użytych do immunobarwienia hESC.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
  5. Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
  6. Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
  7. McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
  8. Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  9. Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
  10. Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie embrionalne kom rki macierzysteembrionalne fibroblasty mysieusuwanie kom rek od ywczychpuryfikacja kom rek macierzystychhodowle o wysokiej g sto citechnika aspiracjimarkery pluripotencjibarwienie immunofluorescencyjnetrawienie kolagenazekspansja hodowli kom rkowych

Powiązane artykuły