Opracowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Podsumowanie

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu wrodzonej zdolności komórek macierzystych do pobierania wskazówek z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich do różnicowania się w wiele fenotypów. Niniejszy manuskrypt metodyczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, złożony z fibryny PEG i kolagenu, do jednoczesnego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej¹.

Streszczenie

Naturalne polimery z biegiem lat zyskały na znaczeniu ze względu na ich biokompatybilność gospodarza i zdolność do interakcji z komórkami in vitro i in vivo. Obszarem badań, który jest obiecujący w medycynie regeneracyjnej, jest kombinatoryczne wykorzystanie nowych biomateriałów i komórek macierzystych. Podstawową strategią w dziedzinie inżynierii tkankowej jest wykorzystanie trójwymiarowych rusztowań (np. bezkomórkowego macierzy zewnątrzkomórkowej, hydrożeli, mikro/nanocząstek) do kierowania funkcją komórki. Technologia ta rozwinęła się od odkrycia, że komórki potrzebują substratu, na którym mogą przylegać, namnażać się i wyrażać swój zróżnicowany fenotyp i funkcję komórkową ^2-3. Niedawno ustalono również, że komórki nie tylko wykorzystują te substraty do przylegania, ale także oddziałują i czerpią wskazówki z substratu macierzy (np. macierzy zewnątrzkomórkowej, ECM)⁴. Dlatego komórki i rusztowania mają wzajemne połączenie, które służy do kontrolowania rozwoju tkanek, organizacji i ostatecznej funkcji. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) to mezenchymalne, niehematopoetyczne komórki macierzyste obecne w tkance tłuszczowej, które mogą wykazywać zróżnicowanie wieloliniowe i służyć jako łatwo dostępne źródło komórek (tj. śródbłonka przednaczyniowego i perycytów). Nasza hipoteza jest taka, że komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być jednocześnie kierowane w stronę różnych fenotypów, po prostu kohodując je w dwuwarstwowych matrycach¹. Nasze laboratorium zajmuje się gojeniem ran skórnych. W tym celu stworzyliśmy pojedynczą matrycę kompozytową z naturalnych biomateriałów, fibryny, kolagenu i chitozanu, która może naśladować cechy i funkcje specyficznego dla skóry środowiska ECM gojenia się ran.

Protokół

1. Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) ^{1, 5}

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Wyizolować tłuszcz okołonerkowy i najądrza szczura i przemyć go sterylnym buforowanym roztworem soli Hanka (HBSS) zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), jak opisano wcześniej ⁵. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt, przepisami wykonawczymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz zgodnie z zasadami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowania.
2. Zmielić tkankę i przenieść 1-2 g do 25 ml HBSS zawierającego 1% FBS do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
3. Zebrać swobodnie unoszącą się warstwę tkanki tłuszczowej i przenieść do 125-mililitrowej kolby Erlenmeyera i potraktować 25 ml kolagenazy typu II (200 U/ml) w HBSS przez 45 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej (125 obr./min).
4. Ostrożnie usunąć frakcję ciekłą (poniżej warstwy oleju i tłuszczu) za pomocą pipetowania i przefiltrować ją sekwencyjnie przez nylonowy filtr siatkowy o średnicy 100 μm i 70 μm. Odwirować filtrat o stężeniu 500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i dwukrotnie przemyć osad 25 ml HBSS.
5. Zawiesić osad komórkowy w 50 ml pożywki wzrostowej (MesenPRO RS Basal Medium) uzupełnionej suplementem wzrostu MesenPRO RS, antybiotyko-przeciwgrzybiczym (100 U/ml penicyliny G, 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B) oraz 2 mM L-glutaminy i pipetować komórki do dwóch kolb T75 (25 ml / kolbę).
6. Hodować ASC w inkubatorze nawilżanym 5% CO₂ w temperaturze 37 °C (we wszystkich doświadczeniach stosuje się pasaż 2-4 ASC).

2. Przygotowanie mikrosfer chitozanu (CSM)

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. CSM są przygotowywane w procesie emulgowania woda w oleju wraz z techniką koacerowania jonowego przy użyciu naszego poprzedniego protokołu ⁵. Zemulgować wodny roztwór chitozanu (6 ml chitozanu 3% w/v w 0,5 M kwasu octowego) w 100 ml mieszaniny fazy olejowej składającej się z oleju sojowego, n-oktanolu (1:2 v/v) i 5% emulgatora monooleinian sorbitanu (zakres 80), stosując jednocześnie mieszanie napowietrzne (1700 obr./min) i magnetyczne (1000 obr./min) w przeciwnych kierunkach. Ta podwójna metoda mieszania zapewnia, że micele utworzone wcześnie przed usieciowaniem mogą pozostać w roztworze i nie osiadać na dnie. Ponadto mieszadło magnetyczne pomaga w deagregacji chitozanu podczas tworzenia i sztywnienia miceli.
2. Mieszać mieszaninę, ciągle mieszając przez około 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnej emulsji typu woda w oleju. Rozpocznij sieciowanie jonowe z dodatkiem 1,5 ml 1% w/v wodorotlenku potasu w n-oktanolu co 15 minut przez 4 godziny (łącznie 24 ml)
3. Po zakończeniu reakcji sieciowania należy powoli zdekantować fazę olejową mieszaniny zawierającej CSM i natychmiast dodać 100 ml acetonu, roztwór stanie się mętny z powodu pozostałości oleju. Po 5 minutach zdekantować, dodać dodatkowe 100 ml acetonu i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia ponownie umyj koraliki acetonem przez pięć minut. Po wykonaniu tych seryjnych myć roztwór powinien stać się klarowny, jeśli nie, kontynuuj mycie, aż cały olej zostanie usunięty, a roztwór acetonu będzie klarowny.
4. Wysuszyć odzyskane kulki w eksykatorze próżniowym i przeanalizować bez dalszej obróbki. Za pomocą analizatora wielkości cząstek można określić średni rozmiar cząstek CSM, pole powierzchni na miligram oraz jednostkę objętości sześciennej.
5. W przypadku kolejnych eksperymentów należy trzykrotnie umyć CSM sterylną wodą w celu usunięcia resztek soli i wysterylizować, myjąc przez noc 5 ml absolutnego etanolu.

3. Określanie liczby wolnych grup aminowych w CSM

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Określ liczbę wolnych grup aminowych obecnych w CSM po sieciowaniu jonowym za pomocą testu kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) Bubnisa i Ofnera⁶. Inkubować 5 mg mikrosfer z 1 ml 0,5% roztworu TNBS w szklanej probówce o pojemności 50 ml przez 4 godziny w temperaturze 40 °C i hydrolizować z dodatkiem 3 ml 6N HCl w temperaturze 60 °C przez 2 godziny.
2. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i wyekstrahować wolny TNBS, dodając 5 ml wody dejonizowanej i 10 ml eteru etylowego.
3. Podgrzać 5 ml porcji fazy wodnej do temperatury 40 °C w łaźni wodnej przez 15 minut w celu odparowania pozostałości eteru, schłodzić do temperatury pokojowej i rozcieńczyć 15 ml wody.
4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 345 nm za pomocą spektrofotometru, używając roztworu TNBS bez chitozanu w stanie ślepej próby oraz chitozanu użytego do przygotowania CSM w celu określenia całkowitej liczby grup aminowych. Oszacuj liczbę wolnych grup aminowych CSM w stosunku do chitozanu.

4. Ładowanie ASC w CSM

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Zrównoważyć 5 mg wysterylizowanych CSM z sekcji 2.5 w sterylnym HBSS przez noc i dodać do wkładki do płytki do hodowli membranowej o wielkości porów 8 μm (płytka 24-dołkowa).
2. Po tym, jak CSM osiądą na membranie, ostrożnie zasysaj HBSS i dodaj 300 μl pożywki wzrostowej do wnętrza wkładki i 700 μl pożywki wzrostowej na zewnątrz wkładki.
3. Zawiesić ASC w odpowiednim stężeniu (1 ×^{10 4} do 4 × 10⁴) w 200 μl pożywki wzrostowej i wysiewać nasiona nad CSM wewnątrz wkładki płytki hodowlanej. Końcowa objętość podłoża we wkładzie hodowlanym, po wysianiu, wynosi 500 μL.
4. Inkubować ASC wysiewany na CSM przez 24 godziny w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.

5. Określanie procentu obciążenia ASC i żywotności komórek w CSM

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Po inkubacji odpipetować CSM załadowany ASC do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, nie naruszając komórek, które migrowały do membrany wkładki.
2. Usunąć pozostałą pożywkę i dodać 250 μl świeżej pożywki wzrostowej do probówki.
3. Do każdej probówki dodać 25 μl roztworu bromku MTT [3-(4,5-dimetylotiozolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowego] (5 mg/ml) i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze z wilgotnością 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
4. Po inkubacji usunąć pożywkę, dodać 250 μl sultlenku dimetylu i wirować mieszaninę przez 2-5 minut, aby rozpuścić kompleks formazanu.
5. Odwirować CSM przy 2700 g przez 5 minut, odpipetować supernatant i określić jego absorbancję długości fali przy 570 nm i 630 nm za pomocą standardowego czytnika płytek, zgodnie ze specyfikacją producenta MTT.
6. Określ liczbę komórek skojarzoną z CSM w stosunku do wartości uzyskanych ze zdefiniowanych liczb ASC hodowanych w celu opracowania krzywej standardowej.

6. Przygotowanie i charakterystyka ASC-CSM zatopionego w żelach PEG-fibrynowych

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Hydrożel z glikolu polietylenowego (PEG) fibryny (PEG-fibryna) przygotowany przez Suggs i wsp.⁷ przez rozpuszczenie glikolu polietylenowego modyfikowanego glutaranem sukcynimidylu (PEG; 3400 Da) przy użyciu 4 ml soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS, pH 7,8) i przefiltrowanie wysterylizowane filtrem 0,22 μm tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozpuszczony PEG jest skuteczny w tej aplikacji tylko przez pierwsze 3-4 godziny.
2. Zmieszać 500 μl bulionu fibrynogenu (40 mg/ml w TBS, pH 7,8) i 250 μl materiału PEG w basenie hodowlanym na płytce 6-dołkowej i inkubować przez 20 minut w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Mieszanina ta ma stosunek stężeń molowych 1:10, SG-PEG-SG: fibrynogen.
3. Weź 250 μl ASC-CSM o stężeniu 5 mg CSM (≈ 2 ×^{10 4} komórek) i wymieszaj z pegylowanym roztworem fibrynogenu.
4. Natychmiast dodać 1 ml bulionu trombinowego (25 j./ml) i szybko rozetrzeć raz lub dwa razy pipetą. Po zmieszaniu trombiny z fibrynogenem PEG, natychmiast umieścić mieszaninę komórka-żel na 12-dołkowej płytce i inkubować w inkubatorze z wilgotnością 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić całkowite żelowanie. Ponieważ czas żelowania jest krótki, nie próbuj trzymać roztworu żelu w końcówce pipety dłużej niż 5 sekund. Pegylowany fibrynogen jest rozszczepiany przez trombinę i tworzy pegylowany hydrożel fibrynowy. W związku z tym końcowy produkt żelowy jest określany jako PEG-fibryna.
5. Przemyć żele PEG-fibryna dwukrotnie za pomocą HBSS i inkubować z minimalną ilością niezbędnych pożywek alfa (α-MEM) uzupełnionych 10% FBS w inkubatorze z wilgotnością 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
6. Obserwuj migrację komórek z CSM do żelu w okresie 11 dni przy użyciu standardowych technik mikroskopii świetlnej.

7. Przygotowanie i charakterystyka ASC-CSM zatopionego w żelach kolagenowych

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Zmieszać ASC-CSM (5 mg zawierające ≈ 2 × 10⁴ komórek) z kolagenem typu 1 (7,5 mg / ml) wyekstrahowanym ze ścięgien ogona szczura metodą Bornsteina⁸ i migotać po dostosowaniu pH do 6,8 za pomocą 2N NaOH.
2. Dodać fibrylowaną mieszaninę kolagenu-ASC-CSM do 12-dołkowej płytki i inkubować przez 30 minut w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
3. Po całkowitym migotaniu inkubować żele collagen-ASC-CSM przez okres do 11 dni w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
4. Obserwuj migrację komórek z CSM do żelu w ciągu 11 dni przy użyciu standardowych technik mikroskopowych.

8. Opracowanie dwuwarstwowych konstruktów żelu PEG-fibryna-(ASC-CSM)-kolagen

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Aby opracować konstrukcję dwuwarstwową, należy przygotować zarówno żel kolagenowy, jak i żel PEG-fibryna, jak opisano powyżej, z niewielkimi modyfikacjami. Krótko mówiąc, aby zbadać właściwości migracyjne i koindukcyjne pojedynczego źródła komórek macierzystych za pomocą dwóch biorusztowań, "umieszczenie" ASC-CSM między kolagenem a rusztowaniami PEG-fibryny za pomocą czteroetapowego procesu: 1) Załaduj ASC na CSM, 2) odlej fibrylowany żel kolagenowy i ułóż kulki ASC-CSM na żelu kolagenowym, 3) Rzuć żel PEG-fibryna na żel kolagenowy ASC-CSM i pozwól żelowi zestalić się, oraz 4) dodać pożywkę do dołka i włożyć do badania komórek in vitro lub wyjąć z wkładki w przypadku zastosowań in vivo (patrz ryc. 1).
2. Przygotować 1-mililitrową mieszaninę kolagenu typu 1 (7,5 mg/ml), jak opisano powyżej w 7.1, bez dodawania ASC-CSM do mieszaniny. Umieścić mieszaninę w 6-dołkowej wkładce do hodowli tkankowej (wielkość porów 8 μm) i inkubować przez 30 minut w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
3. Po całkowitym migotaniu nałożyć na powierzchnię kolagenu 5 mg ASC-CSM (10 000 komórek/mg) zawieszone w pożywkach hodowlanych (200 μl). Po ustabilizowaniu się mikrosfer na żelu, należy przygotować żel PEG-fibryna zgodnie z opisem w punkcie 6.0, bez dodawania ASC-CSM do mieszaniny, a następnie nałożyć pegylowany roztwór fibrynogenu/trombiny na warstwy kolagenu ASC-CSM. Do przygotowania żelu PEG-fibryna należy użyć 250 μl pożywki do hodowli komórkowych zamiast 250 μl pożywki zawierającej komórki.
4. Po zakończeniu inkubować konstrukty przez 30 minut w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 ,} aby uzyskać pełne żelowanie przed karmieniem konstruktu pożywką hodowlaną.
5. Po całkowitym zżelowaniu umieść 1 ml pożywki w górnej komorze nad konstruktem i 3 ml pożywki w dolnej komorze
.

9. Tworzenie rozwiązań magazynowych

Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

• Chlorek wapnia (40 mM): Stosować tylko CaCl 2,2H ₂O. Rozpuścić 588,4 mg CaCl_{2,2H 2}O w 100 ml wody dejonizowanej. Sterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm.
• Glikol polietylenowy: PEG jest wysoce reaktywny z tlenem i może ulec utlenieniu pod wpływem powietrza w pomieszczeniu. W związku z tym PEG powinien być przechowywany w atmosferze azotu (_N2). Dokładnie odważyć 32 mg w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml (przed użyciem należy oczyścić probówki roztworem N₂) i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Przed użyciem rozpuścić 32 mg PEG w 4 ml roztworu TBS.
  Poniższe roztwory muszą być świeże przed każdym eksperymentem.
  
• Roztwór TBS: (pH 7,75-7,77 w 25 °C; pH w temperaturze 25 °C jest bardzo krytyczne). Aby przygotować 15 ml roztworu TBS, ostrożnie rozpuść jedną tabletkę buforową w wysterylizowanej przez filtr wodzie dejonizowanej i dostosuj do wymaganego pH. Nie przechowuj roztworu podstawowego – za każdym razem przygotuj go na świeżo.
• Roztwór fibrynogenu: (40 mg/ml). Rozpuść fibrynogen w proszku w TBS, aby stężenie fibrynogenu wynosiło 40 mg/ml. Rozpuścić go przez noc za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C. Łatwiej jest rozpuścić całą 1-g ilość z wymaganą ilością TBS. Następnego dnia usunąć fibrynogen z temperatury 4 °C (zwykle mętnej) i pozostawić do ogrzania w łaźni wodnej do uzyskania jednorodnego roztworu. Na koniec przefiltruj fibrynogen za pomocą filtra 0,45 μm.
• Roztwór trombiny (25 jednostek/ml): Aby przygotować roztwór trombiny, odważyć wymaganą ilość i rozpuścić w przygotowanym 40 mM CaCl 2,2H ₂O. Zawsze dobrą praktyką jest użycie całej fiolki trombiny do przygotowania bulionu. Przykład: Rozpuścić butelkę z trombiną o stężeniu 5 kM w 200 mM CaCl_{2,2H 2}O, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.

10. Reprezentatywne wyniki

Ogólnym celem przedstawionej tutaj techniki jest pokazanie potencjału jednoczesnego, sterowanego matrycą różnicowania ASC na wiele fenotypów przy użyciu CSM jako nośnika dostawczego. Demonstrujemy strategię in vitro polegającą na dostarczaniu komórek macierzystych z CSM do dwuwarstwowego rusztowania kolagenowo-PEG-fibrynowego. Charakterystyka ASC osadzonego w tym rusztowaniu ujawniła, że CSM obciążone ASC mogą być jednocześnie "wciśnięte" pomiędzy warstwę kolagenu i fibryny PEG i w różny sposób pobierać wskazówki z obu środowisk zewnątrzkomórkowych, aby rozwijać się w nowych warunkach. Najpierw scharakteryzowaliśmy zdolność systemu modelowego do utrzymania żywotności komórek i zdolności migracyjnych. Kolagen wspierał zdolność ASC do utrzymywania ich "macierzystości", jak wykazano w ich ekspresji Stro-1 i morfologii podobnej do fibroblastów (Figura 2D i 2F). W przeciwieństwie do tego, fibryna PEG indukowała ASC do różnicowania się w kierunku fenotypu naczyniowego, co pokazuje ich morfologia struktury przypominająca rurkę, specyficzna dla komórek śródbłonka ekspresja czynnika von Willebranda (ryc. 2E i 2G) oraz specyficzna dla perycytów ekspresja NG2 i receptora beta płytkiego czynnika wzrostu (PDGFRβ) (dane nie pokazane). Co więcej, te obserwowane fenotypy wydawały się występować we wczesnym okresie hodowli i utrzymywały się przez 11 dni, jak pokazano na rycinie 3.

Tabele i rysunki

Korzyści z konstrukcji dwuwarstwowej:

• Samo rusztowanie bez komórek może pełnić funkcję rusztowania bioaktywnego.
• PEG-fibryna może indukować różnicowanie komórek macierzystych bez dodawania czynników wzrostu.
• Kolagen może pomóc w utrzymaniu fenotypu komórek macierzystych ASC.
• Konstrukt dwuwarstwowy może być używany jako aktywny substrat dla innych typów komórek do migracji i proliferacji (np. Komórki śródbłonka, fibroblasty, keratynocyty, komórki mięśni gładkich, perycyty).
• Może być stosowany z rusztowaniami inżynierii tkanek twardych, takimi jak hydroksyaptyt lub demineralizowana kość, w celu regeneracji tkanek twardych i miękkich.
• Może być wykorzystany do opracowania wielowarstwowego, zróżnicowanego konstruktu inżynierii tkankowej (takiego jak skórno-naczyniowy, naczyniowo-nabłonkowy, skórno-naczyniowo-hipodermalny itp.).
• Wykorzystuje źródło jednokomórkowe do jednoczesnego rozwoju przedziałów wielokomórkowych.
• Ma potencjał do integracji z tkanką gospodarza, ponieważ jest pochodzenia naturalnego.
• CSM w konstrukcji żelowej stanowi platformę, z której komórki mogą migrować.
• Chitozan, używany do przygotowania CSM, jest dobrze znanym aktywnym chemoatraktantem.
• Ogólna koncepcja zastosowana w tym protokole "różnicowania komórek macierzystych sterowanego matrycą" może być zastosowana do innych typów komórek macierzystych. Konieczne są jednak dalsze badania w celu określenia wykonalności różnicowania opartego na matrycy. Dwuwarstwowe rusztowanie żelowe może działać jako rezerwuar do dostarczania komórek w sposób ciągły i kontrolowany.
• Po rekonstrukcji żele można jeszcze rozdzielić na poszczególne składniki.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający ogólny cel i proces techniki. 1) Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są ładowane do mikrosfer chitozanu. 2) Kolagen jest następnie wlewany do 6-dołkowej wkładki, pH dostosowane do fibrylacji kolagenu, a wkładkę umieszcza się w komorze na 6-dołkową płytkę. Kulki CSM załadowane ASC są następnie nakładane na kolagen. 3) Pegylowany fibrynogen jest następnie wylewany na kolagen (ASC-CSM) i żelowany przez dodanie trombiny. 4) Końcowy dwuwarstwowy konstrukt można następnie usunąć z wkładki hodowlanej i wykorzystać do analizy in vitro lub in vivo.

Rysunek 2. Charakterystyka ASC hodowanego w matrycach 3D kolagenu i fibryny PEG. A) Mikrofotografia z kontrastem fazowym izolowanego ASC pasażowanego i utrzymywanego przy użyciu rutynowych technik 2-wymiarowej hodowli komórkowej. Mikrofotografie B, D i F przedstawiają ASC-CSM hodowany w 3-wymiarowym żelu kolagenowym; podczas gdy C, E i G wykazują ASC-CSM hodowany w 3-wymiarowym żelu PEG-fibryna, oba w 12 dniu. W B i C) pokazano ASC migrujące z dala od sfery CSM w obu typach rusztowań. Wydaje się, że ASC mają spłaszczoną, wrzecionowatą morfologię kolagenu (B), zachowując jednocześnie ekspresję markera komórek macierzystych Stro-1 (D; strzałka). Podczas hodowli w PEG-fibrynie, ASC wykazują więcej struktur przypominających rurki i są indukowane do ekspresji takich markerów komórek naczyniowych, jak czynnik von Willebranda (E). Transmisyjna mikroskopia elektronowa przedstawia typową morfologię wykazywaną przez ASC w każdym rusztowaniu. Wydaje się, że ASC w żelu kolagenowym mają mniejsze filopodia (fl) wystające z ciała komórki (F), podczas gdy ASC zazwyczaj tworzą struktury świetlne (oznaczone L) (G; strzałka).

Rysunek 3. Analiza morfologiczna ASC-CSM pomiędzy dwuwarstwami kolagenu i żelami PEG-fibryna. ASC-CSM "umieszczono" między kolagenem a żelami PEG-fibryna i utrzymywano w hodowli przez 11 dni. Lewa kolumna przedstawia ASC migrujące i proliferujące w macierzy kolagenowej i wydają się przybierać morfologię przypominającą wrzecionowatość. Prawa kolumna przedstawia ASC migrujące z CSM i tworzące struktury przypominające rurki w całym żelu PEG-fibryna.

Dyskusja

ASC są dobrze znane ze swojej łatwości izolacji i zdolności do różnicowania się w kierunku różnych typów komórek. Dzięki technikom opisanym w tym manuskrypcie jesteśmy w stanie wykorzystać plastyczność ASC poprzez wystawienie tych komórek na działanie wielu biomatryc jednocześnie. Gdy komórki migrują z podstawy CSM i wchodzą do otaczającego je środowiska zewnątrzkomórkowego, komórki pobierają wskazówki z rusztowania i mogą albo utrzymać "łodygę" (kolagen), albo zostać nakłonione do różnicowania się w kierunku typów komór...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	GIBCO, firmy Life Technologies	14175	Konsumpcyjny
hyklon	płodowej surowicy bydlęcej	SH30071.03	Materiał eksploatacyjny
Kolagenaza typu II	Sigma-Aldrich	C6685	Materiał eksploatacyjny
70-μ m Nylonowy filtr siatkowy	BD Biosciences	352350	Materiały eksploatacyjne
100-μ m Nylonowy filtr siatkowy	BD Biosciences	352360	Materiał eksploatacyjny
MesenPRO Growth Medium System	Invitrogen	12746-012	Materiał eksploatacyjny
L-glutamina	GIBCO, firmy Life Technologies	25030	Materiał eksploatacyjny
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C8106	Materiałowa
kolba do hodowli tkankowych T75	BD Nauki biologiczne	137787	Materiały eksploatacyjne
Chitozan	Sigma-Aldrich	448869	Materiały eksploatacyjne
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	320099	Materiały eksploatacyjne
N-oktanol	Acros Organics	150630025	Materiały eksploatacyjne
Mono-oleinian sorbitanu	Sigma-Aldrich	S6760	Materiały eksploatacyjne
Wodorotlenek potasu	Sigma-Aldrich	P1767	Materiał eksploatacyjny
aceton	Fisher Scientific	L-4859	Materiał eksploatacyjny
	etanolu Sigma-Aldrich	270741	Materiał eksploatacyjny
Kwas trinitro benzenosulfonowy	Sigma-Aldrich	P2297	Materiał eksploatacyjny
Kwas solny	Sigma-Aldrich	320331	Materiał eksploatacyjny
eteru etylowego	Sigma-Aldrich	472-484	Materiały eksploatacyjne
8-μ m Wkładki do kultur tkankowych	BD Biosciences	353097	Materiały eksploatacyjne
1,5 ml probówek do mikrowirówek	Fisher Scientific	05-408-129	Materiałowy
odczynnik MTT	Invitrogen	M6494	Materiał eksploatacyjny
dimetylosulfotlenku	Sigma-Aldrich	D8779	Zestaw
do etykietowania komórek Qtracker (Q Tracker 655)	Sondy molekularne, życie Technologie	Q2502PMP	Materiały eksploatacyjne
typu 1 Kolagen	Travigen	3447-020-01	Materiały eksploatacyjne
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S8045	Materiały
12-dołkowe Płytki do hodowli tkankowych	BD Biosciences	353043
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F3879	Materiałowa
trombina	Sigma-Aldrich	T6884	Materiał eksploatacyjny
benztriazolowa pochodna polietylenu	Sunbio	DE-034GS	Zużywalna
tabletka buforowa Tris (pH 7,6)	eksploatacyjna	Sigma-Aldrich	T5030
	Eppendorf	5417R	Sprzęt
Wytrząsarka orbitalna	Nowy Brunszwik Sprzęt
naukowy C24Nawilżany inkubator z powietrzem-5% CO2	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Model 370	Sprzęt
Mieszadło górne	IKA	Visc6000	Sprzęt
Mieszadło magnetyczne	Corning	PC-210	Sprzęt
Suszownik próżniowy	-		Sprzęt
Analizator wielkości cząstek	Instrumenty Malvern STP2000	Sprzęt Spraytec
Kąpiel wodna	Fisher Scientific	Isotemp210	sprzęt
Spektrofotometr	Beckman Coulter Inc.	Sprzęt do spektrofotometru Beckman Coulter DU 800UV / widzialnego
Diagger Vortex	Diagger	3030a
Sprzęt Czytnik mikropłytek	Urządzenia molekularne	Sprzęt SpectraMax M2
Mikroskop świetlny / fluorescencyjny	Olympus Corporation	IX71	Sprzęt
konfokalny	Olympus Corporation	FV-500 Skaning laserowy konfokalny Sprzęt mikroskopowy
Skaningowy mikroskop elektronowy	Carl Zeiss, Inc.	Leo 435 VP	Sprzęt
Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL	JEOL 1230	Sprzęt