Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Na przestrzeni lat polimery naturalne zyskały na znaczeniu ze względu na ich wysoką biokompatybilność oraz zdolność do oddziaływania z komórkami in vitro i in vivo. Obiecującym obszarem badań w medycynie regeneracyjnej jest kombinacyjne wykorzystanie nowoczesnych biomateriałów i komórek macierzystych. Fundamentalną strategią w inżynierii tkankowej jest stosowanie trójwymiarowych rusztowań (np. decelularyzowanej macierzy zewnątrzkomórkowej, hydrożeli, mikro/nanocząsteczek) w celu kierowania funkcjami komórek. Technologia ta ewoluowała po odkryciu, że komórki potrzebują podłoża, do którego mogą przylegać, na którym mogą proliferować oraz w którym mogą wyrażać swój zróżnicowany fenotyp i funkcję komórkową 2-3. W ostatnim czasie ustalono również, że komórki nie tylko wykorzystują te podłoża do adhezji, ale także wchodzą z nimi w interakcje i odbierają sygnały z podłoża macierzy (np. macierzy zewnątrzkomórkowej, ECM)4. Zatem komórki i rusztowania pozostają w relacji wzajemnej, która służy kontrolowaniu rozwoju, organizacji i ostatecznej funkcji tkanki. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) to mezenchymalne, niehematopoetyczne komórki macierzyste obecne w tkance tłuszczowej, które mogą wykazywać różnicowanie wieloliniowe i służyć jako łatwo dostępny zastrój komórek (tj. przednaczyniowych komórek śródbłonka i perycytów). Nasza hipoteza zakłada, że komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być jednocześnie kierowane w stronę różnych fenotypów poprzez ich prostą ko-kulturę w macierzach dwuwarstwowych1. Nasze laboratorium koncentruje się na gojeniu ran skóry. W tym celu stworzyliśmy pojedynczą macierz kompozytową z naturalnych biomateriałów – fibryny, kolagenu i chitozanu – która może naśladować charakterystykę i funkcje środowiska ECM specyficznego dla procesu gojenia ran skóry.
Protokół
1. Izolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASCs) 1, 5
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzano w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Wyizolować tkankę tłuszczową okojnerkową i nadjądrzową szczura i przemyć sterylnym roztworem soli buforowanej Hanksa (HBSS) zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zgodnie z wcześniejszym opisem 5. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt (Animal Welfare Act), wykonawczymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz zgodnie z zasadami zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals).
- Posiekać tkankę, przenieść 1-2 g do probówki 50-mL zawierającej 25 mL HBSS z 1% FBS i wirować przy 500 g przez 8 min w temperaturze pokojowej.
- Zebrać swobodnie pływającą warstwę tkanki tłuszczowej, przenieść ją do kolby Erlenmeyera o pojemności 125-mL i inkubować z 25 mL kolagenazy typu II (200 U/mL) w HBSS przez 45 min w 37 °C na wytrząsarce orbitalnej (125 rpm).
- Ostrożnie usunąć frakcję ciekłą (znajdującą się poniżej warstwy tłuszczowej i olejowej) za pomocą pipety i przefiltrować ją sekwencyjnie przez nylonowe filtry o oczkach 100- μm i 70- μm. Odwir również filtrat przy 500 g przez 10 min w temperaturze pokojowej, odessać nadsącz i dwukrotnie przemyć osad 25 mL HBSS.
- Resuspendować osad komórkowy w 50 mL pożywki wzrostowej (MesenPRO RS Basal Medium) uzupełnionej o MesenPRO RS Growth Supplement, antybiotyk-antymykotyk (100 U/mL penicyliny G, 100 μg/mL siarczanu streptomycyny i 0,25 μg/mL amfoterycyny B) oraz 2 mM L-glutaminy, a następnie przenieść komórki pipetą do dwóch kolb T75 (25 mL/kolba).
- Hodować ASC w inkubatorze z 5% CO2 i nawilżeniem w temperaturze 37 °C (we wszystkich eksperymentach wykorzystano ASC w pasażach 2-4).
2. Przygotowanie mikrosfer chitosanowych (CSMs)
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- CSM przygotowuje się za pomocą procesu emulgowania woda-w-oleju wraz z techniką koaczerwacji jonowej zgodnie z naszym poprzednim protokołem 5. Emulgowano wodny roztwór chitosanu (6 mL 3% w/v chitosanu w 0,5 M kwasie octowym) w 100 mL mieszaniny fazy olejowej składającej się z oleju sojowego, n-oktanolu (1:2 v/v) i 5% emulgatora sorbitanu monooleinianu (span 80), stosując jednocześnie mieszadło mechaniczne (1700 rpm) i magnetyczne (1000 rpm) w przeciwnych kierunkach. Ta podwójna metoda mieszania zapewnia, że micele utworzone na wczesnym etapie, przed wystąpieniem sieciowania, pozostają w roztworze i nie osiadają na dnie. Ponadto magnetyczny pasek mieszający wspomaga rozagregowanie chitosanu podczas formowania i usztywniania miceli.
- Mieszaninę mieszano w sposób ciągły przez około 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnej emulsji woda-w-oleju. Sieciowanie jonowe zainicjowano poprzez dodawanie 1,5 mL 1% w/v wodorotlenku potasu w n-oktanolu co 15 min przez 4 h (łącznie 24 mL).
- Po zakończeniu reakcji sieciowania powoli odlano fazę olejową z mieszaniny zawierającej CSM i niezwłocznie dodano 100 mL acetonu; roztwór stał się mętny z powodu pozostałości oleju. Po 5 minutach odlano ciecz, dodano kolejne 100 mL acetonu i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia ponownie przemyto kule acetonem przez pięć minut. Po wykonaniu tych seryjnych przemywań roztwór powinien stać się klarowny; jeśli tak nie było, kontynuowano przemywanie aż do usunięcia całego oleju i uzyskania przejrzystego roztworu acetonu.
- Odzyskane sfery wysuszono w desykatorze próżniowym i przeanalizowano bez dalszej obróbki. Średnią wielkość cząstek CSM, powierzchnię właściwą na miligram oraz jednostkową objętość sześcianu można wyznaczyć za pomocą analizatora wielkości cząstek.
- Do kolejnych eksperymentów CSM przemyto trzykrotnie sterylną wodą w celu usunięcia pozostałości soli i wysterylizowano, przemywając przez noc 5 mL etanolu absolutnego.
3. Wyznaczanie liczby wolnych grup aminowych w CSM
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Wyznaczyć liczbę wolnych grup aminowych obecnych w CSM po sieciowaniu jonowym, stosując metodę analizy kwasem trinitrobenzenosulfonowym (TNBS) według Bubnisa i Ofnera6. Inkubować 5 mg mikrosfer z 1 mL 0,5% roztworu TNBS w probówce szklanej o pojemności 50 mL przez 4 h w temperaturze 40 °C, a następnie przeprowadzić hydrolizę poprzez dodanie 3 mL 6N HCl w temperaturze 60 °C przez 2 h.
- Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i wyekstrahować wolny TNBS, dodając 5 mL wody dejonizowanej oraz 10 mL eteru etylowego.
- Ogrzewać 5-mL alikwot fazy wodnej do 40 °C w łaźni wodnej przez 15 min w celu odparowania pozostałości eteru, schłodzić do temperatury pokojowej i rozcieńczyć 15 mL wody.
- Zmierzyć absorbancję przy 345 nm za pomocą spektrofotometru, używając roztworu TNBS bez chitozanu jako próbki ślepej oraz chitozanu użytego do przygotowania CSM w celu wyznaczenia całkowitej liczby grup aminowych. Oszacować liczbę wolnych grup aminowych w CSM w stosunku do chitozanu.
4. Ładowanie ASC do CSM
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Równoważyć 5 mg wysterylizowanych CSM z sekcji 2.5 w sterylnym HBSS przez noc, a następnie przenieść je na wkładkę do płytki hodowlanej z membraną o rozmiarze porów 8 μm (płytka 24-dołkowa).
- Po osadzeniu się CSM na membranie ostrożnie odessać HBSS, dodać 300 μL pożywki wzrostowej do wnętrza wkładki oraz 700 μL pożywki wzrostowej na zewnątrz wkładki.
- Resuspendować ASC w odpowiednim stężeniu (1 × 104 do 4 × 104) w 200 μL pożywki wzrostowej i wysiać na CSM wewnątrz wkładki do płytki hodowlanej. Końcowa objętość pożywki wewnątrz wkładki hodowlanej po wysianiu wynosi 500 μL.
- Inkubować ASC wysiane na CSM przez 24 h w inkubatorze z 5% CO2 i odpowiednią wilgotnością w temperaturze 37 °C.
5. Wyznaczanie procentowego obciążenia ASC i żywotności komórek w CSM
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzano w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Po inkubacji przenieś za pomocą pipety CSM obciążone ASC do sterylnej probówki do mikrocentryfugówki o pojemności 1,5 mL, nie naruszając komórek, które zmigrowały do membrany wkładki.
- Usuń pozostałą pożywkę i dodaj do probówki 250 μL świeżej pożywki wzrostowej.
- Do każdej probówki dodaj 25 μL roztworu MTT [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliumu] (5 mg/mL) i inkubuj przez 4 h w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji usuń pożywkę, dodaj 250 μL dimetylosulfoksydu i mieszaj mieszaninę na wortexie przez 2-5 min w celu rozpuszczenia kompleksu formazanu.
- Odwiruj CSM przy 2700 g przez 5 min, odpipetuj supernatant i wyznacz jego absorbancję przy długości fali 570 nm i 630 nm przy użyciu standardowego czytnika płytek, zgodnie ze specyfikacją producenta MTT.
- Wyznacz liczbę komórek związanych z CSM w odniesieniu do wartości uzyskanych z określonych liczb ASC hodowanych w celu opracowania krzywej standardowej.
6. Przygotowanie i charakterystyka ASC-CSM zatopionych w żelach PEG-fibrynowych
Uwaga: Wszystkie procedury były wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Hydrożel z glikolu polietylenowego i fibryny (PEG-fibryna) przygotowany według metody Suggs et al.7 poprzez rozpuszczenie glikolu polietylenowego modyfikowanego glutaraniem succynimidylowym (PEG; 3400 Da) w 4 mL soli buforowej z TRIS (TBS, pH 7.8), a następnie sterylizację przez filtr o rozmiarze 0,22-μm bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozpuszczony PEG jest skuteczny w tej aplikacji jedynie przez pierwsze 3-4 godziny.
- W studniczce płytki 6-dołkowej wymieszać 500 μl roztworu zapasowego fibrynogenu (40 mg/mL w TBS, pH 7.8) oraz 250 μl roztworu zapasowego PEG i inkubować przez 20 minut w inkubatorze z wilgotnym powietrzem, przy 37 °C i 5% CO2. Mieszanina ta stanowi stosunek stężeń molowych 1:10 SG-PEG-SG:fibrynogen.
- Pobrać 250 μl ASC-CSM o stężeniu 5 mg CSM (≈ 2 × 104 komórek) i wymieszać z roztworem pegylowanego fibrynogenu.
- Natychmiast dodać 1 ml roztworu zapasowego trombiny (25U/mL) i szybko wymieszać raz lub dwa razy za pomocą pipety. Po wymieszaniu trombiny z PEG-fibrynogenem niezwłocznie przenieść mieszaninę komórkowo-żelową do płytki 12-dołkowej i inkubować w inkubatorze z wilgotnym powietrzem, przy 37 °C i 5% CO2 przez 10 min, aby umożliwić pełną żelację. Ze względu na krótki czas żelacji nie należy pozostawiać roztworu żelu w końcówce pipety przez więcej niż 5 sekund. Pegylowany fibrynogen jest rozcinany przez trombinę, co prowadzi do powstania pegylowanego hydrożelu fibrynowego; końcowy produkt żelowy określany jest jako PEG-fibryna.
- Żele PEG-fibrynowe przemyć dwukrotnie HBSS i inkubować w minimalnym medium esencjalnym alfa (α-MEM) uzupełnionym o 10% FBS w inkubatorze z wilgotnym powietrzem, przy 37 °C i 5% CO2.
- Obserwować migrację komórek z CSM do żelu przez okres 11 dni, korzystając ze standardowych technik mikroskopii świetlnej.
7. Przygotowanie i charakterystyka ASC-CSM osadzonych w żelach kolagenowych
Uwaga: Wszystkie procedury były przeprowadzane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Wymieszać ASC-CSM (5 mg zawierające ≈ 2 × 104 komórek) z kolagenem typu 1 (7,5 mg/mL) wyekstrahowanym z ścięgien ogona szczura zgodnie z metodą Bornsteina8 i przeprowadzić fibrylację po dostosowaniu pH do 6,8 za pomocą 2N NaOH.
- Przenieść sfibrilowaną mieszaninę kolagenu i ASC-CSM do płytki 12-dołkowej i inkubować przez 30 min w inkubatorze z 5% CO2 i wilgotnym powietrzem w temperaturze 37 °C.
- Po całkowitej fibrylacji inkubować żele kolagenowo-ASC-CSM do 11 dni w inkubatorze z 5% CO2 i wilgotnym powietrzem w temperaturze 37 °C.
- Obserwować migrację komórek z CSM do żelu w okresie 11 dni, stosując standardowe techniki mikroskopowe.
8. Opracowanie dwuwarstwowych konstruktów żelu PEG-fibryna-(ASC-CSM)-kolagen
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
- Aby opracować konstrukcję dwuwarstwową, przygotuj żele kolagenowe i PEG-fibrynowe zgodnie z powyższym opisem, z niewielkimi modyfikacjami. Krótko mówiąc, aby zbadać właściwości migracyjne i koindukcyjne pojedynczego źródła komórek macierzystych przy użyciu dwóch bioszkieletów, umieść ASC-CSM w strukturze „kanapki” pomiędzy rusztowaniem kolagenowym a PEG-fibrynowym, stosując następujący czterostopniowy proces: 1) załaduj ASC na CSM, 2) odlej żel z fibryl化した kolagenu i ułóż kuleczki ASC-CSM na żelu kolagenowym, 3) odlej żel PEG-fibrynowy na warstwach ASC-CSM-kolagenu i poczekaj do utwardzenia żelu oraz 4) dodaj pożywkę do dołka i wstaw do badań in vitro lub wyjmij z insertu do zastosowań in vivo (patrz Rysunek 1).
- Przygotuj 1 mL mieszaniny kolagenu typu 1 (7,5 mg/mL) zgodnie z opisem w punkcie 7.1, nie dodając do mieszaniny ASC-CSM. Umieść mieszaninę w insercie do hodowli tkankowej z 6 dołkami (rozmiar porów 8 μm) i inkubuj przez 30 min w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po całkowitej fibrylacji nanieś na powierzchnię kolagenu 5 mg ASC-CSM (10 000 komórek/mg) zawieszonych w pożywce hodowlanej (200 μl). Po osadzeniu się mikrosfer na żelu, przygotuj żel PEG-fibrynowy zgodnie z opisem w sekcji 6.0, nie dodając ASC-CSM do mieszaniny, a następnie nanieś roztwór PEGylonego fibrynogenu/trombiny na warstwy ASC-CSM-kolagenu. Podczas przygotowywania żelu PEG-fibrynowego użyj 250 μl pożywki do hodowli komórkowej zamiast 250 μl pożywki zawierającej komórki.
- Po zakończeniu inkubuj konstrukcje przez 30 min w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2, aby uzyskać pełną żelację przed dodaniem do konstrukcji pożywki hodowlanej.
- Po całkowitej żelacji wlej 1 mL pożywki do górnej komory nad konstrukcją oraz 3 mL pożywki do komory dolnej.
9. Przygotowywanie roztworów stokowych
Uwaga: Wszystkie procedury były wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Roztwór zapasowy chlorku wapnia (40 mM): Należy używać wyłącznie CaCl2.2H2O. Rozpuścić 588,4 mg CaCl2.2H2O w 100 ml wody dejonizowanej. Sterylizować za pomocą filtra 0,22-μm.
- Glikol polietylenowy: PEG jest wysoce reaktywny w obecności tlenu i może ulec utlenieniu po kontakcie z powietrzem pokojowym. W związku z tym PEG należy przechowywać w atmosferze azotu (N2). Odważyć dokładnie 32 mg do probówki do wirowania o pojemności 2 ml (należy upewnić się, że probówki zostały przepłukane N2 przed użyciem) i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Przed użyciem rozpuścić 32 mg PEG w 4 mL roztworu TBS.
Poniższe roztwory muszą być przygotowane na świeżo przed każdym eksperymentem.
- Roztwór TBS: (pH 7,75-7,77 przy 25 °C; wartość pH przy 25 °C jest bardzo istotna). Aby przygotować 15 ml roztworu TBS, ostrożnie rozpuścić jedną tabletkę buforową w sterylnej filtrowanej wodzie dejonizowanej i dostosować do wymaganego pH. Nie należy przechowywać roztworu zapasowego — należy go przygotowywać na świeżo za każdym razem.
- Roztwóry fibrynogenu: (40 mg/ml). Rozpuścić proszek fibrynogenu w TBS, tak aby uzyskać stężenie fibrynogenu 40 mg/ml. Rozpuszczać przez noc przy użyciu mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C. Łatwiej jest rozpuścić całą ilość 1 g w odpowiedniej ilości TBS. Następnego dnia wyjąć fibrynogen z temperatury 4 °C (zwykle jest zmętniały) i ogrzewać w kąpieli wodnej do uzyskania jednorodnego roztworu. Na koniec przefiltrować fibrynogen przez filtr 0,45-μm w celu sterylizacji.
- Roztwór trombiny (25 Units/ml): Aby przygotować roztwór trombiny, odważyć wymaganą ilość i rozpuścić w przygotowanym 40 mM CaCl2.2H2O. Zawsze dobrą praktyką jest wykorzystanie całej zawartości fiolki trombiny do przygotowania roztworu zapasowego. Przykład: rozpuścić butelkę zawierającą 5 kU trombiny w 200 mM CaCl2.2H2O, podzielić na aلیکwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
10. Reprezentatywne wyniki
Ogólnym celem zaprezentowanej tutaj techniki jest wykazanie potencjału jednoczesnego, sterowanego przez macierz różnicowania ASC w wiele fenotypów z wykorzystaniem CSM jako nośnika. Przedstawiamy strategię in vitro dostarczania komórek macierzystych z CSM do dwuwarstwowego rusztowania kolagenowo-PEG-fibrynowego. Charakterystyka ASC osadzonych w tym rusztowaniu wykazała, że załadowane komórkami ASC CSM mogą być „umieszczone pomiędzy” warstwą kolagenu i PEG-fibryny, jednocześnie i w różny sposób reagując na oba środowiska pozakomórkowe, aby rozwijać się w nowych warunkach. W pierwszej kolejności oceniliśmy zdolność systemu modelowego do utrzymania żywotności komórek oraz ich potencjału migracyjnego. Kolagen wspierał zdolność ASC do zachowania ich „stammowości”, co potwierdzono poprzez ekspresję Stro-1 oraz morfologię przypominającą fibroblasty (Rysunek 2D i 2F). Z kolei PEG-fibryna indukowała różnicowanie ASC w kierunku fenotypu naczyniowego, co wykazano poprzez morfologię struktur rurkowatych, specyficzną dla komórek śródbłonka ekspresję czynnika von Willebranda (Rysunek 2E i 2G) oraz specyficzną dla pericytów ekspresję NG2 i receptora beta czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRβ) (dane nie przedstawiono). Co więcej, zaobserwowane fenotypy pojawiły się wcześnie w hodowli i były utrzymywane przez 11 dni, co przedstawiono na Rysunku 3.
Tabele i Ryciny
Zalety konstrukcji dwuwarstwowej:
- Sama rusztowanie, bez komórek, może pełnić funkcję rusztowania bioaktywnego.
- PEG-fibryna może indukować różnicowanie komórek macierzystych bez konieczności dodawania czynników wzrostu.
- Kolagen może wspomagać utrzymanie fenotypu komórek macierzystych w przypadku ASC.
- Konstrukcja dwuwarstwowa może służyć jako aktywne podłoże dla migracji i proliferacji innych typów komórek (np. komórek śródbłonka, fibroblastów, keratynocytów, komórek mięśni gładkich, perycytów).
- Można ją stosować z rusztowaniami do inżynierii tkanek twardych, takimi jak hydroksyapatyt lub zdemineralizowana kość, w celu regeneracji tkanek twardych i miękkich.
- Można jej użyć do opracowania wielowarstwowej, zróżnicowanej konstrukcji inżynierii tkankowej (np. skórno-naczyniowej, naczyniowo-nabłonkowej, skórno-naczyniowo-podskórnej itp.).
- Wykorzystuje pojedyncze źródło komórek do jednoczesnego wytwarzania wielokomórkowych przedziałów.
- Ze względu na naturalne pochodzenie posiada potencjał do integracji z tkanką gospodarza.
- CSM w obrębie konstrukcji żelowej stanowi platformę, z której komórki mogą migrować.
- Chitozan, używany do przygotowania CSM, jest dobrze znanym aktywnym chemoatraktorem.
- Ogólna koncepcja „różnicowania komórek macierzystych sterowanego przez macierz” zastosowana w tym protokole może zostać odniesiona do innych typów komórek macierzystych. Jednakże wymagane są dalsze badania w celu ustalenia wykonalności różnicowania sterowanego przez macierz. Dwuwarstwowe rusztowanie żelowe może pełnić funkcję rezerwuaru do uwalniania komórek w sposób przedłużony i kontrolowany.
- Po rekonstrukcji żele można nadal rozdzielić na poszczególne komponenty.
Rysunek 1. Schemat przedstawiający ogólny cel i przebieg techniki. 1) Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASCs) są ładowane na mikrosfery chitozanowe. 2) Kolagen jest następnie wlewany do wkładki 6-dołkowej, pH jest dostosowywane w celu fibrylacji kolagenu, a wkładka umieszczana w komorze płytki 6-dołkowej. Następnie sfery CSM z załadowanymi komórkami ASC są nakładane warstwami na kolagen. 3) Następnie PEGylowany fibrynogen jest wlewany na kolagen (ASC-CSM) i żelowany poprzez dodanie trombiny. 4) Końcowy dwuwarstwowy konstrukt może zostać wówczas usunięty z wkładki hodowlanej i wykorzystany do analiz in vitro lub in vivo.
Rycina 2. Charakterystyka ASC hodowanych w trójwymiarowych macierzach kolagenowych i PEG-fibrynowych. A) Mikrofotografia w kontraście fazowym wyizolowanych ASC pasażowanych i utrzymywanych przy użyciu rutynowych technik dwuwymiarowej hodowli komórkowej. Mikrofotografie B, D i F przedstawiają ASC-CSM hodowane w trójwymiarowym żelu kolagenowym, natomiast C, E i G pokazują ASC-CSM hodowane w trójwymiarowym żelu PEG-fibrynowym, obie grupy w 12. dniu. Na zdjęciach B i C) przedstawiono ASC migrujące z sfery CSM w obu typach rusztowań. ASC w kolagenie (B) wykazują spłaszczoną, wrzecionowatą morfologię, zachowując jednocześnie ekspresję markera komórek macierzystych Stro-1 (D; strzałka). W hodowli w PEG-fibrynie ASC tworzą struktury bardziej przypominające rurki i wykazują indukowaną ekspresję markerów komórek naczyniowych, takich jak czynnik von Willebranda (E). Transmisyjna mikroskopia elektronowa przedstawia typową morfologię ASC w każdym z rusztowań. ASC w żelu kolagenowym wykazują mniejsze filopodia (fl) wychodzące z ciała komórki (F), podczas gdy ASC typowo tworzyły struktury z lumenem (oznaczone L) (G; strzałka).
Rycina 3. Analiza morfologiczna ASC-CSM pomiędzy warstwami żeli kolagenowych i PEG-fibrynowych. ASC-CSM zostały „zamknięte” pomiędzy żelami kolagenowymi a PEG-fibrynowymi i utrzymywane w hodowli przez 11 dni. Lewa kolumna przedstawia komórki ASC migrujące i proliferujące wewnątrz macierzy kolagenowej, które wydają się przybierać morfologię wrzecionowatą. Prawa kolumna przedstawia komórki ASC migrujące z dala od CSM i tworzące struktury rurkowate w całym żelu PEG-fibrynowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Komórki macierzyste pochodzenia tłuszczowego (ASCs) są znane z łatwości izolacji oraz zdolności do różnicowania się w różne typy komórek. Dzięki technikom opisanym w niniejszym manuskrypcie jesteśmy w stanie wykorzystać plastyczność ASCs poprzez jednoczesne eksponowanie tych komórek na wiele biomatryc. W miarę jak komórki migrują z podstawy CSM i wnikają do otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego, otrzymują sygnały z rusztowania i mogą albo zachować „macierzystość” (kolagen), albo zostać ukierunkowane na różnicowanie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak konkurencyjnych interesów finansowych.
Zastrzeżenia
Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako oficjalne ani odzwierciedlające poglądy Departamentu Obrony lub rządu USA. Autorzy są pracownikami rządu USA, a niniejsza praca została przygotowana w ramach ich oficjalnych obowiązków. Wszystkie prace były wspierane przez U.S. Army Medical Research and Materiel Command. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem recenzowanym i zatwierdzonym przez Institutional Review Board przy U.S. Army Medical Research and Materiel Command oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem.
Podziękowania
S.N. otrzymał wsparcie w ramach stypendium podoktorskiego z Pittsburgh Tissue Engineering Initiative. D.O.Z. jest wspierany przez grant przyznany przez The Geneva Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Produkt zużywalny |
| Płodowe serum bydlęce | Hyclone | SH30071.03 | Produkt zużywalny |
| Kollagenaza typu II | Sigma-Aldrich | C6685 | Produkt zużywalny |
| Filtr nylonowy 70-μm | BD Biosciences | 352350 | Produkt zużywalny |
| Filtr nylonowy 100-μm | BD Biosciences | 352360 | Produkt zużywalny |
| System pożywki wzrostowej MesenPRO | Invitrogen | 12746-012 | Produkt zużywalny |
| L-glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Produkt zużywalny |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | Produkt zużywalny |
| Kolba do hodowli tkanek T75 | BD Biosciences | 137787 | Produkt zużywalny |
| Chitozan | Sigma-Aldrich | 448869 | Produkt zużywalny |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich | 320099 | Produkt zużywalny |
| N-oktanol | Acros Organics | 150630025 | Produkt zużywalny |
| Sorbitanu monooleinian | Sigma-Aldrich | S6760 | Produkt zużywalny |
| Wodorotlenek potasu | Sigma-Aldrich | P1767 | Produkt zużywalny |
| Aceton | Fisher Scientific | L-4859 | Produkt zużywalny |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Produkt zużywalny |
| Kwas trinitrobenzenosulfonowy | Sigma-Aldrich | P2297 | Produkt zużywalny |
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | 320331 | Produkt zużywalny |
| Eter etylowy | Sigma-Aldrich | 472-484 | Produkt zużywalny |
| Wkładki do płytek do hodowli tkanek 8-μm | BD Biosciences | 353097 | Produkt zużywalny |
| Probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | Produkt zużywalny |
| Odczynnik MTT | Invitrogen | M6494 | Produkt zużywalny |
| Dimetylosulfoksygen | Sigma-Aldrich | D8779 | Produkt zużywalny |
| Zestaw do znakowania komórek Qtracker (Q Tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Produkt zużywalny |
| Kolagen typu 1 | Travigen | 3447-020-01 | Produkt zużywalny |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S8045 | Produkt zużywalny |
| 12-dołkowe płytki do hodowli tkanek | BD Biosciences | 353043 | Produkt zużywalny |
| Fibrynogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Produkt zużywalny |
| Trombina | Sigma-Aldrich | T6884 | Produkt zużywalny |
| Pochodna benztriazolu polietylenu | Sunbio | DE-034GS | Produkt zużywalny |
| Tabletka buforu Tris (pH 7,6) | Sigma-Aldrich | T5030 | Produkt zużywalny |
| Wirówka | Eppendorf | 5417R | Sprzęt |
| Mieszadło orbitalne | New Brunswick Scienctific | C24 | Sprzęt |
| Inkubator nawilżany z powietrzem i 5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Sprzęt |
| Mieszadło mechaniczne | IKA | Visc6000 | Sprzęt |
| Mieszadło magnetyczne | Corning | PC-210 | Sprzęt |
| Desykator próżniowy | – | – | Sprzęt |
| Analizator wielkości cząstek | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Sprzęt |
| Kąpiel wodna | Fisher Scientific | Isotemp210 | Sprzęt |
| Spektrofotometr | Beckman Coulter Inc. | Spektrofotometr UV/Vis Beckman Coulter DU 800 | Sprzęt |
| Vortex | Diagger | 3030a | Sprzęt |
| Czytnik mikro płytek | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Sprzęt |
| Mikroskop świetlny/fluorescencyjny | Olympus Corporation | IX71 | Sprzęt |
| Mikroskop konfokalny | Olympus Corporation | Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny FV-500 | Sprzęt |
| Skaningowy mikroskop elektronowy | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Sprzęt |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | JEOL | JEOL 1230 | Sprzęt |
Bibliografia
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. , (2008).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
- Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
