Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Streszczenie

Wzrost i przebudowa sieci mikro naczyniowej są krytycznymi aspektami gojenia ran, stanu zapalnego, retinopatii cukrzycowej, wzrostu guzów oraz innych stanów chorobowych^{1, 2}. Wzrost sieci jest powszechnie przypisywany angiogenezie, definiowanej jako powstawanie nowych naczyń z naczyń istniejących. Proces angiogenezy jest również bezpośrednio powiązany z arteriogenezą, definiowaną jako nabieranie przez naczynia włosowate otoczki z komórek peryvaskularnych oraz powiększanie naczyń. Oczywiste jest, że angiogeneza jest procesem złożonym i angażuje wielu uczestników na poziomie komórkowym i molekularnym³. Zrozumienie sposobu wzrostu sieci mikro naczyniowej wymaga zidentyfikowania dynamiki przestrzennej i czasowej w obrębie hierarchii sieci w trakcie przebiegu angiogenezy. Informacje te są kluczowe dla opracowania terapii mających na celu manipulowanie wzrostem naczyń.

Model eksterioryzacji opisany w niniejszym artykule stanowi prosty, powtarzalny model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Został on zaadaptowany z modeli gojenia ran w krezce szczura^4-7 i stanowi alternatywę dla stymulowania angiogenezy w krezce poprzez wstrzyknięcia doszpikowe (i.p.) czynników proangiogennych^{8, 9}. Model eksterioryzacji jest atrakcyjny, ponieważ wymaga minimalnej interwencji chirurgicznej i powoduje gwałtowny, powtarzalny wzrost liczby pączków kapilarnych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyniowej w stosunkowo krótkim czasie w tkance, która umożliwia dwuwymiarową wizualizację całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczych komórek. Stymulowany wzrost odzwierciedla naturalne odpowiedzi angiogenne w środowisku fizjologicznym, bez zakłóceń wywołanych przez obce cząsteczki angiogenne. Dzięki zastosowaniu metod znakowania immunohistochemicznego model ten okazał się niezwykle użyteczny w identyfikacji nowych zdarzeń komórkowych uczestniczących w angiogenezie. Badacze mogą łatwo korelować wskaźniki angiogenne w czasie przebudowy z dynamiką specyficzną dla danego etapu, taką jak zmiany fenotypowe komórek lub interakcje komórkowe^{4, 5, 7, 10, 11}.

Protokół

1. Uwagi dotyczące przygotowania procedury chirurgicznej

1. Przed zabiegiem wysterylizuj materiały i narzędzia chirurgiczne. Materiały używane do sterylnej procedury chirurgicznej dla każdego szczura obejmują: jedną sterylną obrusnicę rozłożoną jako powierzchnia do ułożenia narzędzi, jedną obrusnicę z wyciętym w centrum otworem o wymiarach około 0,5 in x 1,5 in do umieszczenia na szczurze oraz gazę. Wycięty otwór w obrusnicy musi pokrywać się z nacięciem wykonanym na szczurze. Narzędzia niezbędne do operacji to: jedna standardowa para nożyczek do przecinania materiału szewnego, dwie pęsety i precyzyjny uchwyt do igieł do manipulowania i chwytania nici, a także skalpel z ostrzem. W Tabeli Specyficznych Materiałów i Narzędzi Chirurgicznych wymieniliśmy powszechne narzędzia stosowane w naszym laboratorium. Ostateczny dobór narzędzi zależy jednak od preferencji eksperymentatora.
2. Przygotuj przestrzeń operacyjną. Umieść worek z 100 mL 0,9% sterylnej soli fizjologicznej pod mata grzewczym, aby zapewnić, że sól fizjologiczna stykająca się z tkanką krezki jest uprzednio ogrzana do temperatury około 37 °C. Jako alternatywę dla soli fizjologicznej można zastosować roztwór Ringera lub inny bufor fizjologiczny. Rozłóż wysterylizowane narzędzia i materiały chirurgiczne na sterylnej obrusnicy, aby zapewnić do nich łatwy dostęp podczas procedury eksterioryzacji. Będą również potrzebne sterylne patyczki z watką oraz odpowiednie 3 rodzaje nici chirurgicznych (4-0, 5-0 i 7-0). Upewnij się, że opakowania są wcześniej otwarte, aby materiały można było pobrać przy zachowaniu sterylności. Na koniec zdezynfekuj zmodyfikowany plastikowy stoлик poprzez zanurzenie go w 100% etanolu na co najmniej 5 minut. Stołek to płytka Petriego o średnicy 100 mm z wyciętym w centrum eliptycznym otworem (Rysunek 1). Do wykonania i, w razie potrzeby, poszerzenia otworu można użyć narzędzia Dremel. Po wykonaniu otworu krawędzie wyciętego plastiku należy wygładzić papierem ściernym o różnej ziarnistości. Następnie stołek jest myty, a na koniec do krawędzi otworu dodaje się obojętną glinę modelarską (kupioną w lokalnym sklepie plastycznym) lub silikonowy klej, aby uzyskać podwyższoną, gładką powierzchnię. Przed kontaktem z tkanką stołek musi zostać odpowiednio wypłukany sterylną solą fizjologiczną.
3. W tym modelu angiogenezy zazwyczaj stosujemy dorosłe samce szczurów Wistar (350 ± 25 g). Można stosować inne szczepy i wiek szczurów. W naszym laboratorium szczury są znieczulane poprzez wstrzyknięcie domięśniowe ketaminy (80 mg/kg m.c.), ksylazyny (8 mg/kg m.c.) oraz atropiny (0,08 mg/kg m.c.). Po około 5 minutach potwierdza się działanie znieczulenia i ogala skórę brzuszną szczura.

2. Model eksterioryzacji krezki szczura

1. Umieść znieczulonego szczura na plecach na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Podczas procedury chirurgicznej należy stosować techniki aseptyczne. Należy używać sterylnych rękawiczek i nie dopuszczać do kontaktu instrumentów oraz materiałów z powierzchniami niesterylnymi, z wyjątkiem tkanek szczura.
2. Oczyść obszar brzucha, przecierając go naprzemiennie sterylną gazą nasączoną 70% izopropanolem i jodyną.
3. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj małe (około 0,75 cala) nacięcie podłużne wzdłuż skóry, a następnie wzdłuż linea alba, około 1 cala poniżej mostka.
4. Nałóż wcześniej wycięte pole operacyjne na odcinek brzuszny tak, aby otwór pokrywał się z nacięciem.
5. Delikatnie wywieraj nacisk wokół nacięcia. Zazwyczaj spowoduje to wystawienie jelita cienkiego w stopniu wystarczającym do jego łatwej identyfikacji.
6. Używając aplikatorów z bawełnianą końcówką, delikatnie wyciągnij odcinek jelita cienkiego i zlokalizuj jelito kręte. W miarę wyciągania krezki, należy ją delikatnie rozłożyć na plastikowej podstawce (Rycina 2).
7. Zidentyfikuj 6-8 unaczynionych okien krezkowych. Okno krezkowe definiuje się jako cienką, półprzezroczystą błonę znajdującą się pomiędzy parami tętnic i żył zasilających jelito cienkie (Rycina 2).
8. Zapisz czas rozpoczęcia eksteryzacji. Pozostaw odcinek krezki wyeksponowany na zewnątrz przez 20 minut. Podczas okresu eksteryzacji używaj sterylnej strzykawki (5 mL), aby okresowo uzupełniać sól fizjologiczną w szalce Petriego, zapewniając, że tkanka pozostaje zanurzona i nie wysycha.
9. Podczas 20-minutowego czasu ekspozycji oznacz 2 centralnie położone okna krezkowe sterylną nicią chirurgiczną 7-0. Oznaczenia należy wykonać w obszarze tłuszczowym w pobliżu jelita.
10. Wprowadź wyeksponowany odcinek krezki z powrotem do jamy brzusznej.
11. Zamknij mięśnie brzucha za pomocą monofilamentowej nici chirurgicznej 5-0 szwem przerywanym.
12. Zamknij skórę za pomocą monofilamentowej nici chirurgicznej 4-0 szwem przerywanym.
13. Przetrzyj miejsce zszycia, przecierając je naprzemiennie sterylną gazą nasączoną 70% izopropanolem i jodyną.
14. Nałóż żel smarujący do oczu na oba oczy szczura. Celem nawilżenia oka jest zapobieganie wysychaniu rogówki podczas procedury chirurgicznej i rekonwalescencji. Żel smarujący należy nałożyć przed rozpoczęciem interwencji chirurgicznej. W razie potrzeby ponownie nałóż żel przed powrotem szczura do klatki w celu rekonwalescencji.

3. Pobieranie i utrwalanie tkanek

1. W wybranym dniu po stymulacji znieczul i uśmierć szczura. W naszym laboratorium szczury są znieczulane poprzez wstrzyknięcie domięśniowe ketaminy (80 mg/kg b.w.), ksylazyny (8 mg/kg b.w.) oraz atropiny (0.8 mg/kg b.w.), a następnie uśmiercane poprzez wstrzyknięcie wewnątrzsercowe Beuthanasii. Beuthanasia jest roztworem pentobarbitalu sodu i fenytoiny, który można stosować do szybkiej i bezbolesnej eutanazji. Nasze laboratorium zazwyczaj wstrzykuje 0.1 - 0.2 ml na szczura.
2. Ponownie otwórz jamę brzuszną, delikatnie usuń jelito cienkie i zlokalizuj dwa zaznaczone okna.
3. Wytnij każde z wyeksponowanych okien krezkowych, używając pęsety i mikronożyczek. Pozostawienie brzegu tkanki tłuszczowej wokół każdego okna jest korzystne dla późniejszego rozłożenia tkanki na szkiełkach przedmiotowych. Natychmiast zanurz każde okno w PBS. Podczas wycinania staraj się nie przecinać par tętnica/żyła w obrębie tłuszczowego brzegu okien, aby zminimalizować ryzyko wypełnienia okien krwią. Unikaj również przecinania jelit, co mogłoby doprowadzić do kontaktu treści jelitowej z oknami.
4. Używając pęsety, rozłóż tkanki na naładowanych dodatnio szkiełkach przedmiotowych. Na jednym szkiełku można umieścić dwie próbki tkanki.
5. Pozostaw tkanki do częściowego wyschnięcia, a następnie za pomocą ostrza skalpela usuń nadmiar tłuszczu.
6. Tkanki są teraz gotowe do utrwalenia. Można zastosować typowe metody fiksacji. W naszym laboratorium zazwyczaj utrwalamy preparaty na szkiełkach w metanolu (-20 °C) przez 30 min. Pomyślne znakowanie przeprowadzano również na tkankach nieutrwalonych. Metody utrwalania mogą zależeć od stosowanego przeciwciała.

4. Immunomarkowanie tkanek

1. Tkanki można obecnie ogólnie znakować zgodnie z instrukcjami do poszczególnych przeciwciał dla immunohistochemii. Ze względu na nasze zainteresowanie identyfikacją roli pericytów naczyniowych podczas angiogenezy, w naszym laboratorium powszechnie stosuje się znakowanie komórek śródbłonkowych i okołonaczyniowych^{10, 12, 13}. Użytecznymi znacznikami do identyfikacji komórek śródbłonkowych w obrębie hierarchii sieci mikro naczyniowych są przeciwciało anty-PECAM lub lektyna BSI. Markery komórek okołonaczyniowych stosowane w tej tkance obejmują NG2, desminę, SM-α aktynę, PDFGRβ oraz β-tubulinę klasy III. Poniżej, w sekcji 3.3, wymieniliśmy protokoły dla kolorymetrycznego i fluorescencyjnego immunoznakowania PECAM.
2. Przed pierwszą inkubacją z przeciwciałem pierwotnym preparaty są suszone próżniowo w celu usunięcia nadmiaru roztworu buforu. Ponadto tkanki są wstępnie obrysowane pisakiem woskowym, aby zapobiec niekontrolowanemu odpływowi roztworów przeciwciał z obszaru tkanki. Wreszcie, po każdym etapie znakowania następują etapy płukania. W przypadku etapów płukania preparaty umieszcza się w słoikach do barwienia. Roztwór buforu wymienia się 3 razy w czasie trwania płukania.
3. Procedury znakowania przeciwciałami komórek śródbłonkowych:
   Kolorymetryczne znakowanie PECAM
   1. Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym: Nakropić około 100-200 µL roztworu przeciwciała pierwotnego (mysie monoklonalne biotynilowane przeciwciało CD31 w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na każdą tkankę; upewnić się, że cała tkanka jest pokryta roztworem przeciwciał. Inkubacja przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
   3. Inkubacja z przeciwciałem wtórnym: Nakropić roztwór przeciwciała wtórnego (roztwór VECTASTAIN Elite ABC z Vector Laboratories; roztwór wtórnego przeciwciała streptawidyna-peroksydaza) na tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   4. Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
   5. Inkubować tkanki z Vector Nova Red przez 15 minut. Następnie opłukać tkanki wodą.
   6. Montowanie preparatów: Zanurzyć preparaty w 95% etanolu 10 razy. Zanurzyć preparaty w 100% etanolu na 2 minuty. Zanurzyć preparaty w kolejnym roztworze 100% etanolu na 2 minuty. Następnie zanurzyć preparaty w kolejnych roztworach 100% ksylenu przez 2 minuty w każdym. Pozostawić do wyschnięcia i pokryć tkanki cienką warstwą VectaMount oraz szkiełkiem przykrywkowym.
   
   Fluorescencyjne znakowanie PECAM
   1. Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym: Nakropić około 100-200 µL roztworu przeciwciała pierwotnego (mysie monoklonalne biotynilowane przeciwciało CD31 w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na każdą tkankę; upewnić się, że cała tkanka jest pokryta roztworem przeciwciał. Inkubacja przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
   3. Inkubacja z przeciwciałem wtórnym: Nakropić roztwór przeciwciała wtórnego (Streptawidyna-CY3 w rozcieńczeniu 1:100 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   4. Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
   5. Montowanie preparatów: Nakropić na tkanki mieszaninę PBS z glicerolem w stosunku 50:50. Przykryć szkiełkiem przykrywkowym. Następnie użyć lakieru do paznokci, aby uszczelnić szczelinę między szkiełkiem przykrywkowym a preparatem.

5. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne obrazy tkanek krezówki szczura, znakowanych immunohistochemicznie pod kątem PECAM, przedstawiono na Rysunku 3. Znakowanie PECAM pozwala na identyfikację wszystkich typów naczyń w hierarchii przebudowywaną sieci mikro naczyniowych i może być wykorzystane do ilościowego określenia parametrów angiogennych w określonych punktach czasowych po stymulacji. Znakowanie PECAM umożliwia również rozróżnienie tętniczek od żyłek. Tętniczki doprowadzające charakteryzują się zazwyczaj mniejszą średnicą i wydłużoną morfologią komórek śródbłonka w porównaniu z odpowiadającymi im żyłkami (Rysunek 4). Kapilary i pąki kapilarne można zidentyfikować na podstawie średnicy naczynia oraz jego względnej pozycji w sieci. Typowe cechy przebudowywanych sieci obejmują zwiększone pączkowanie kapilar, gęstość naczyń, obszar unaczynienia oraz krętość żyłek. Ilościowe określenie różnych parametrów angiogennych pozwala zidentyfikować przebieg czasowy wzrostu sieci (Rysunek 5). Pączkowanie kapilar z istniejących naczyń osiąga szczyt między 3. a 5. dniem i powraca do poziomu niestymulowanego do 10. dnia. Po tym przejściowym wzroście pączkowania następują wzrosty gęstości naczyń oraz obszaru unaczynienia. Jako dowód przebudowy większych naczyń w tym modelu, w czasie trwania badania zwiększa się również liczba segmentów tętniczek i żyłek.

W naszym laboratorium model ten był wykorzystywany do identyfikacji komórkowych zmian fenotypowych w określonych punktach czasowych procesu przebudowy^{10, 11}. Na przykład, β-tubulina klasy III pozwala zidentyfikować perycyty wzdłuż naczyń angiogennych (Rysunek 6). W tkankach niepobudzonych ekspresja β-tubuliny klasy III jest specyficzna dla nerwów. Z kolei w szczytowej fazie kiełkowania naczyń kapilarnych β-tubulina klasy III jest ekspresowana przez komórki naczyniowe. Tego rodzaju wynik podkreśla przydatność tego prostego i solidnego modelu angiogennego w identyfikacji nowych typów komórek biorących udział w procesie angiogenezy.

Rysunek 1. Zdjęcia plastikowej platformy przed i po modyfikacji. Platforma przed modyfikacją to szalka Petriego o średnicy 100 mm. Modyfikacje obejmują wycięcie eliptycznego otworu w centrum oraz późniejsze nałożenie plasteliny lub kleju silikonowego na krawędź otworu w celu utworzenia wypukłej, gładkiej powierzchni. Powierzchnia ta stanowi wewnętrzną granicę, która ułatwia superfuzję zewnętrznych okien krezkowych. Pasek skali wynosi 1 cm.

Rysunek 2. Obraz eksterioryzowanego obszaru krezki jelitowej. Okna krezkowe definiuje się jako cienkie, półprzezroczyste błony znajdujące się pomiędzy parami tętnic i żył odżywiających jelito cienkie. W czasie eksterioryzacji obszar krezki jest rozłożony i zanurzony w soli fizjologicznej w zmodyfikowanej płytce Petriego. Obojętna żółta glina modelarska zapewnia gładką powierzchnię, przez którą krezka jest przeciągana przez wcześniej wycięty otwór. Pasek skali odpowiada 1 cm.

Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy sieci mikro naczyniowych krezki z tkanek niestymulowanych oraz tkanek 3 i 10 dni po eksterioryzacji krezki. Barwienie PECAM pozwoliło zidentyfikować hierarchię sieci mikro naczyniowych, w tym tętniczki (A), żyłki (V) oraz kapilary (C). Po stymulacji sieci mikro naczyniowe wykazały zwiększenie pączkowania kapilar (groty strzałek) oraz gęstość naczyń. Pasek skali wynosi 100 μm.

Rycina 4. Reprezentatywne obrazy par tętniczek/żyłek w sieciach mikronaczyniowych krezki dorosłego szczura. Na obu obrazach tętniczki (A) można odróżnić od żyłek (V) na podstawie mniejszej średnicy względnej oraz wydłużonej morfologii komórek śródbłonka. Paski skali wynoszą 20 μm.

Rysunek 5. Reprezentatywna kwantyfikacja wskaźników angiogennych w czasie wzrostu mikroznaczyniowego po eksternalizacji krezki. A) Powierzchnia naczyń na powierzchnię tkanki. B) Liczba pączków kapilarnych na powierzchnię naczyń. C) Całkowita długość naczyń na powierzchnię naczyń. *oznacza istotną różnicę w porównaniu z grupą niepobudzoną. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z następującym po niej testem Dunna (p < 0.05). UN oznacza grupę niepobudzoną.

Rycina 6. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne sieci mikronaczyniowych krezowej z tkanek niestymulowanych oraz tkanek w 3. i 10. dobie po eksterioryzacji krezówki. Immunofluorescencyjne znakowanie PECAM (czerwone) identyfikuje komórki śródbłonka, a znakowanie β-tubuliną klasy III (zielone) identyfikuje nerwy (groty strzałek) oraz komórki okołynaczyniowe (strzałki). Komórki okołynaczyniowe przejściowo zwiększają ekspresję β-tubuliny klasy III podczas pączkowania kapilar. W niestymulowanych sieciach mikronaczyniowych β-tubulina klasy III jest specyficzna dla nerwów i nie identyfikuje komórek okołynaczyniowych. W 3. dobie po stymulacji β-tubulina klasy III dodatnio znakuje komórki okołynaczyniowe wzdłuż mikronaczyni. Do 10. doby wzorzec ekspresji β-tubuliny klasy III zaczyna wracać do stanu charakterystycznego dla tkanek niestymulowanych. Pasek skali wynosi 50 μm.

Rysunek 7. Obrazy potwierdzające możliwość śledzenia wcześniej znakowanych, miejscowo aplikowanych komórek podczas wzrostu sieci mikronaczyniowej stymulowanej przez eksterioryzację krezki. Komórki podawano metodą superfuzyjną przez okna krezkowe podczas 20-minutowego okresu eksterioryzacji. 1 dzień po operacji zaobserwowano komórki znakowane DiI (czerwone) w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co mikronaczynia PECAM-dodatnie (zielone). A, B) Przykłady komórek szpiku kostnego znakowanych DiI wykazujących morfologię zaokrągloną i wydłużoną. W niektórych przypadkach (strzałki) komórki były wydłużone wzdłuż mikronaczyni. C) Przykład skupiska mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych DiI w pobliżu końcówki pączka kapilarnego (strzałka). Paski skali wynoszą 50 μm (A) oraz 20 μm (B, C).

Dyskusja

Model eksterioryzacji został opisany w 2006 roku i jest adaptacją wcześniejszych modeli angiogenezy w krezce szczura opartych na urazie mechanicznym^4-7; daje on wyniki podobne do dobrze ugruntowanych modeli z iniekcją do. (i.p.), które wykorzystują krezkę szczura⁹. Wykazano eksperymentalnie, że 20-minutowy czas eksterioryzacji wywołuje silną odpowiedź angiogenną. Choć okres ten można modyfikować, pozwala on na miejscowe stosowanie inhibitorów angiogenezy⁴ w badaniach mechanistycznych oraz bezpośrednie wprowadzanie egzogennych komórek w celu badania linii komórkowych. Wykonalność inkorporacji komórek do przebudowującej się tkanki krezki została potwierdzona w wstępnych badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium z użyciem uprzednio znakowanych komórek szpiku kostnego oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (Rycina 7), a także poprzez sukcesy w badaniu losów ludzkich komórek stropowych pochodzenia tłuszczowego po iniekcji do.¹⁴. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy ten model do identyfikacji zmian fenotypowych perycytów w czasie trwania odpowiedzi angiogennej¹⁰ oraz do oceny potencjału angiogennego w warunkach patologicznych, takich jak nadciśnienie tętnicze¹². Odpowiedź angiogenną oraz zmiany fenotypu komórek związane z tym modelem można zaobserwować również w innych modelach angiogenezy w krezce szczura, w tym podczas przewlekłej ekspozycji na hipoksję^{10, 11}.

Ograniczeniem modelu eksterioryzacji jest fakt, że dokładne mechanizmy wyzwalające angiogenezę nie są znane. Eksterioryzacja krezki została powiązana z degranulacją komórek tucznych i zwiększonym poziomem histaminy⁶, jednak wymagane są dalsze badania, aby uzyskać więcej informacji. Bodziec angiogenny jest bez wątpienia wieloczynnikowy, wywołując silną odpowiedź przebudowy w całej hierarchii sieci mikronaczyniowej. Choć nieznane mechanizmy pozostają głównym punktem krytyki tego modelu, jego powtarzalność i prostota czynią go atrakcyjnym do identyfikacji dynamiki komórkowej zaangażowanej w naturalnie złożony proces kiełkowania naczyń włosowatych. Powtarzalność modelu została potwierdzona poprzez porównywalne parametry angiogenne w czasie wzrostu sieci mikronaczyniowej u wielu szczepów szczurów (samców Wistar i samic Sprague-Dawley) w wcześniej opublikowanych badaniach z naszego laboratorium^{10, 12}. Ponieważ większość tkanek krezki dorosłych szczurów jest unaczyniona, model ten pozwala również na zbadanie wielu tkanek u jednego zwierzęcia. Niestety, model ten nie znajduje oczywistego zastosowania w genetycznych modelach mysich, ponieważ okna krezkowe u myszy wykazują mniejsze naturalne unaczynienie i, w naszym doświadczeniu, zazwyczaj brakuje w nich obserwowalnych sieci rozgałęzień. Przyszłe zastosowania obejmują badanie funkcjonalności naczyń podczas angiogenezy przy użyciu mikroskopii intravitalnej w określonych punktach czasowych oraz badanie związanej z tym dynamiki komórkowej uczestniczącej w limfangiogenezie i neurogenezie. Chociaż stopień naturalnego unaczynienia w obrębie okna krezkowego wydaje się być w przybliżeniu proporcjonalny do wieku, obserwowaliśmy rozgałęzione sieci mikronaczyniowe u samców szczurów Wistar w wieku zaledwie 4-5 tygodni. Obserwacje te sugerują, że model eksterioryzacji mógłby zostać zastosowany również do porównywania różnic angiogennych w zależności od wieku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obłożenie chirurgiczne	Cardinal Health	4012	12"x12" sterylne owijki Bio-Shield Regular
Mikronóżce Noyes	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5677	Mikronóżce sprężynowe do sekcji Noyes; proste, końcówki ostra-tępa; krawędź tnąca 13mm; szerokość końcówki 0.25mm, całkowita długość 4 1/2"
Pinceta Graefe	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135	Mikropinceta do sekcji; ząbkowana; lekko zakrzywiona; szerokość końcówki 0.8mm; długość 4"
Pinceta Graefe	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	Mikropinceta do sekcji; ząbkowana, prosta; szerokość końcówki 0.8mm; długość 4"
Sznur chirurgiczny 4-0	Ethicon Inc.	699G	(1.5 metric) sznur nylonowy ETHILON, czarny monofilament
Sznur chirurgiczny 5-0	Ethicon Inc.	8556	(1.0 metric) sznur polipropylenowy PROLENE, niebieski monofilament
Sznur chirurgiczny 7-0	Ethicon Inc.	1647G	(0.5 metric) sznur nylonowy ETHILON, czarny monofilament
Mikroportań Castroviejo	Fine Science Tools	12060-02	Szerokość końcówki:0.6mm Długość zacisku:5mm Długość:9cm Końcówka prosta
Portań Castroviejo	Fine Science Tools	12565-14	Kształt końcówki:prosta Szerokość końcówki:1.5mm Długość zacisku:10mm Nożyczki:nie Blokada:tak Długość:14cm Ząbkowanie:tak
Rękojeść skalpela	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-9843	Rękojeść skalpela, #3; pełna; długość 4"
Sterylne ostrze chirurgiczne	Cincinnati Surgical	0110	Stal nierdzewna; rozmiar 10
Szalka Petriego	Fisher Scientific	08-757-13	Z fazowanym brzegiem, z pokrywką
Tabela specyficznych materiałów i narzędzi chirurgicznych.
Beuthanasia	Merck & Co.	MWI #: 011168	Składnik aktywny: na 100mL, 390 mg pentobarbalsodu, 50mg fenytoiny sodowej
Ketamina	Fort Dodge Animal Health	MWI #: 000680	Kateset 100 mg/ml
Ksylazyna	Lloyd, Inc.	MWI #: 009307	Anased 100 mg/ml (zamówiono z MWI Veterinary Supply)
Sól fizjologiczna	Hospira Inc.	94-217-JT
PBS	Sigma-Aldrich	011M8207
Saponina	Sigma-Aldrich	BCBB4080
PECAM (CD31)	BD Biosciences	553371
Streptawidyna-CY3	Jackson ImmunoResearch	016-160-084
BSA	Jackson ImmunoResearch	096555
VECTASTAIN Elite ABC	Vector Laboratories	PK-6100
Vector Nova Red	Vector Laboratories	SK-4800
VectaMount	Vector Laboratories	H-500
Tabela specyficznych odczynników