Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.
Artykuł metodologiczny
Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wzrost i przebudowa sieci mikro naczyniowej są krytycznymi aspektami gojenia ran, stanu zapalnego, retinopatii cukrzycowej, wzrostu guzów oraz innych stanów chorobowych1, 2. Wzrost sieci jest powszechnie przypisywany angiogenezie, definiowanej jako powstawanie nowych naczyń z naczyń istniejących. Proces angiogenezy jest również bezpośrednio powiązany z arteriogenezą, definiowaną jako nabieranie przez naczynia włosowate otoczki z komórek peryvaskularnych oraz powiększanie naczyń. Oczywiste jest, że angiogeneza jest procesem złożonym i angażuje wielu uczestników na poziomie komórkowym i molekularnym3. Zrozumienie sposobu wzrostu sieci mikro naczyniowej wymaga zidentyfikowania dynamiki przestrzennej i czasowej w obrębie hierarchii sieci w trakcie przebiegu angiogenezy. Informacje te są kluczowe dla opracowania terapii mających na celu manipulowanie wzrostem naczyń.
Model eksterioryzacji opisany w niniejszym artykule stanowi prosty, powtarzalny model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Został on zaadaptowany z modeli gojenia ran w krezce szczura4-7 i stanowi alternatywę dla stymulowania angiogenezy w krezce poprzez wstrzyknięcia doszpikowe (i.p.) czynników proangiogennych8, 9. Model eksterioryzacji jest atrakcyjny, ponieważ wymaga minimalnej interwencji chirurgicznej i powoduje gwałtowny, powtarzalny wzrost liczby pączków kapilarnych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyniowej w stosunkowo krótkim czasie w tkance, która umożliwia dwuwymiarową wizualizację całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczych komórek. Stymulowany wzrost odzwierciedla naturalne odpowiedzi angiogenne w środowisku fizjologicznym, bez zakłóceń wywołanych przez obce cząsteczki angiogenne. Dzięki zastosowaniu metod znakowania immunohistochemicznego model ten okazał się niezwykle użyteczny w identyfikacji nowych zdarzeń komórkowych uczestniczących w angiogenezie. Badacze mogą łatwo korelować wskaźniki angiogenne w czasie przebudowy z dynamiką specyficzną dla danego etapu, taką jak zmiany fenotypowe komórek lub interakcje komórkowe4, 5, 7, 10, 11.
Protokół
1. Uwagi dotyczące przygotowania procedury chirurgicznej
- Przed operacją należy wysterylizować przybory i instrumenty chirurgiczne. Przybory wykorzystywane podczas sterylnego zabiegu chirurgicznego dla każdego szczura obejmują: 1 obrus chirurgiczny, który posłuży jako sterylna powierzchnia do rozmieszczenia instrumentów, jeden obrus z fabrycznie wyciętym otworem o wymiarach ok. 0,5 in x 1,5 in w centrum, który zostanie umieszczony na szczurze, oraz gazę. Wycięty otwór w obrusie zostanie dopasowany do nacięcia wykonanego u szczura. Instrumenty niezbędne do operacji obejmują: 1 standardową parę nożyczek do przecinania nici chirurgicznych, dwie pęsety oraz precyzyjny uchwyt do igieł do manipulowania i chwytania nici, a także skalpel z ostrzem. Powszechnie stosowane w naszym laboratorium narzędzia zostały wymienione w Tabeli specyficznych materiałów i narzędzi chirurgicznych. Ostateczny wybór narzędzi zależy jednak od preferencji eksperymentatora.
- Przygotuj przestrzeń operacyjną. Umieść worek z 100 mL 0,9% sterylnej soli fizjologicznej pod podkładką grzewczą, aby zapewnić, że sól fizjologiczna mająca kontakt z tkanką krezki była wstępnie ogrzana do temperatury około 37 °C. Jako alternatywę dla soli fizjologicznej można zastosować roztwór Ringera lub inny bufor fizjologiczny. Rozłóż wysterylizowane instrumenty i przybory chirurgiczne na sterylnym obrusie, aby zapewnić do nich łatwy dostęp podczas procedury eksterioryzacji. Będą również potrzebne sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką oraz odpowiednie 3 rodzaje nici chirurgicznych (4-0, 5-0 i 7-0). Upewnij się, że opakowania są wcześniej otwarte, aby materiały można było pobrać przy zachowaniu sterylności. Na koniec zdezynfekuj zmodyfikowany plastikowy stolik, zanurzając go w 100% etanolu na co najmniej 5 minut. Stolik jest to szalka Petriego o średnicy 100 mm z wyciętym w centrum eliptycznym otworem (Rycina 1). Do początkowego wykonania i, jeśli to konieczne, poszerzenia otworu można użyć narzędzia Dremel. Po wykonaniu otworu krawędzie wyciętego plastiku należy wygładzić za pomocą papieru ściernego o różnej ziarnistości. Następnie stolik należy umyć, a na koniec do krawędzi otworu dodać obojętną glinkę modelarską (kupioną w lokalnym sklepie plastycznym) lub klej silikonowy, aby uzyskać wypukłą, gładką powierzchnię. Przed kontaktem z tkanką stolik musi zostać odpowiednio przepłukany sterylną solą fizjologiczną.
- W tym modelu angiogenezy zazwyczaj stosujemy dorosłe samce szczurów Wistar (350 ± 25 g). Można stosować inne szczepy i wiek szczurów. W naszym laboratorium szczury są znieczulane poprzez wstrzyknięcie domięśniowe ketaminy (80 mg/kg b.w.), ksylazyny (8 mg/kg b.w.) i atropiny (0,08 mg/kg b.w.). Po około 5 min potwierdza się efekt znieczulenia i ogala skórę brzucha szczura.
2. Model eksterioryzacji krezki szczura
- Umieść znieczulonego szczura na plecach na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Podczas procedury chirurgicznej stosuje się techniki aseptyczne. Należy nosić sterylne rękawiczki i nie dopuszczać do kontaktu instrumentów oraz materiałów z powierzchniami niesterylnymi, z wyjątkiem tkanek szczura.
- Oczyść obszar brzucha, przecierając go naprzemiennie sterylną gazą nasączoną 70% izopropanolem oraz jodyną.
- Za pomocą ostrza skalpela wykonaj niewielkie (około 0,75 cala) nacięcie podłużne wzdłuż skóry, a następnie wzdłuż linea alba, około 1 cala poniżej mostka.
- Załóż wcześniej docięty obłożnik na obszar brzucha tak, aby otwór pokrywał się z nacięciem.
- Delikatnie wywrzyj nacisk wokół nacięcia. Zazwyczaj doprowadzi to do wystawienia jelita cienkiego w stopniu umożliwiającym jego łatwą identyfikację.
- Za pomocą aplikatorów z watowanym końcem delikatnie wyciągnij fragment jelita cienkiego i zlokalizuj jelito kręte. W miarę wyciągania krezki, należy ją delikatnie rozłożyć na plastikowej podstawce (Rycina 2).
- Zidentyfikuj 6–8 unaczynionych okien krezkowych. Okno krezkowe definiuje się jako cienką, półprzezroczystą błonę znajdującą się pomiędzy parami tętnic i żył zasilających jelito cienkie (Rycina 2).
- Zapisz czas rozpoczęcia eksterioryzacji. Pozostaw fragment krezki na zewnątrz przez 20 minut. W czasie eksterioryzacji używaj sterylnej strzykawki (5 mL), aby okresowo uzupełniać sól fizjologiczną w szalce Petriego, zapewniając zanurzenie tkanki i zapobiegając jej wysychaniu.
- Podczas 20-minutowego czasu ekspozycji oznacz 2 centralnie położone okna krezkowe sterylną nicią chirurgiczną 7-0. Oznaczenia należy wykonać w obszarze tłuszczowym w pobliżu jelita.
- Wprowadź eksterioryzowany fragment krezki z powrotem do jamy brzusznej.
- Zamknij mięśnie brzucha szwem monofilamentowym 5-0 w sposób przerywany.
- Zamknij skórę szwem monofilamentowym 4-0 w sposób przerywany.
- Przetrzyj miejsce zszycia, używając naprzemiennie sterylnej gazy nasączonej 70% izopropanolem oraz jodyną.
- Nałóż żel smarujący do oczu na oba oczy szczura. Celem smarowania oczu jest zapobieganie wysychaniu rogówki podczas procedury chirurgicznej i rekonwalescencji. Żel smarujący należy nałożyć przed rozpoczęciem interwencji chirurgicznej. W razie potrzeby ponownie nałóż żel przed powrotem szczura do klatki na czas rekonwalescencji.
3. Pobieranie i utrwalanie tkanek
- W wyznaczonym dniu po stymulacji znieczul i uśmierć szczura. W naszym laboratorium szczury są znieczulane poprzez wstrzyknięcie domięśniowe ketaminy (80 mg/kg b.w.), ksylazyny (8 mg/kg b.w.) oraz atropiny (0.8 mg/kg b.w.), a następnie uśmiercane poprzez wstrzyknięcie wewnątrzsercowe beuthanasii. Beuthanasia jest roztworem pentobarbitalu sodu i fenytoiny, który może być stosowany do szybkiej i bezbolesnej eutanazji. W naszym laboratorium zazwyczaj wstrzykuje się 0.1 - 0.2 ml na szczura.
- Ponownie otwórz jamę brzuszną, delikatnie wyjmij jelito cienkie i zlokalizuj dwa zaznaczone okna.
- Wytnij każde z wyewagowanych okien krezkowych, używając pęsety i mikronożyczek. Pozostawienie brzegu tkanki tłuszczowej wokół każdego okna jest korzystne dla późniejszego rozłożenia tkanki na szkiełkach mikroskopowych. Natychmiast zanurz każde okno w PBS. Podczas wycinania staraj się nie przecinać par tętnic i żył w obrębie tłuszczowego brzegu okien, aby zminimalizować ryzyko wypełnienia okien krwią. Unikaj również przecinania jelit, co mogłoby doprowadzić do kontaktu treści jelitowej z oknami.
- Użyj pęsety, aby rozłożyć tkanki na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych. Na jednym szkiełku można zamocować dwie tkanki.
- Pozostaw tkanki do częściowego wyschnięcia, a następnie za pomocą ostrza skalpela usuń nadmiar tłuszczu.
- Tkanki są teraz gotowe do utrwalenia. Można zastosować typowe metody utrwalania. W naszym laboratorium zazwyczaj utrwalamy preparaty na szkiełkach w metanolu (-20 °C) przez 30 min. Pomyślne znakowanie przeprowadzono również na tkankach nieutrwalonych. Metody utrwalania mogą zależeć od preferowanego przeciwciała.
4. Immunoznakowanie tkanek
- Tkanki można teraz zazwyczaj znakować zgodnie z instrukcjami dla danego przeciwciała do immunohistochemii. Ze względu na nasze zainteresowanie identyfikacją roli perycytów naczyniowych podczas angiogenezy, w naszym laboratorium powszechnie znakuje się komórki śródbłonka i komórki okołonaczyniowe10, 12, 13. Przydatnymi znacznikami do identyfikacji komórek śródbłonka w obrębie hierarchii sieci mikronaczyniowych są przeciwciało przeciwko PECAM lub lektyna BSI. Markery komórek okołonaczyniowych stosowane w tej tkance obejmują NG2, desminę, SM-α aktynę, PDFGRβ oraz β-tubulinę klasy III. Poniżej, w sekcji 3.3, przedstawiliśmy protokoły kolorymetrycznego i fluorescencyjnego znakowania immunochemicznego PECAM.
- Przed pierwszą inkubacją z przeciwciałem pierwotnym preparaty są suszone próżniowo w celu usunięcia nadmiaru roztworu buforowego. Ponadto tkanki są wstępnie obrysowywane woskowym pisakiem, aby zapobiec niekontrolowanemu odpływowi roztworów przeciwciał z obszaru tkanki. Na koniec każdy etap znakowania kończy się etapami płukania. Podczas płukania preparaty umieszcza się w naczyniach do barwienia. Roztwór buforowy jest wymieniany 3 razy w trakcie czasu trwania płukania.
- Procedury znakowania przeciwciałami komórek śródbłonka:
Kolorymetryczne znakowanie PECAM- Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym: Nanieść kroplowo około 100-200 µL roztworu przeciwciała pierwotnego (mysie monoklonalne biotynilowane przeciwciało CD31 w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na każdą tkankę; należy upewnić się, że cała tkanka jest pokryta roztworem przeciwciała. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
- Inkubacja z przeciwciałem wtórnym: Nanieść kroplowo roztwór przeciwciała wtórnego (roztwór VECTASTAIN Elite ABC z Vector Laboratories; roztwór wtórnego przeciwciała streptawidyna-peroksydaza) na tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
- Inkubować tkanki z Vector Nova Red przez 15 minut. Następnie opłukać tkanki wodą.
- Montowanie preparatów: Zanurzyć preparaty w 95% etanolu 10 razy. Zanurzyć preparaty w 100% etanolu na 2 min. Zanurzyć preparaty w kolejnym roztworze 100% etanolu na 2 min. Następnie zanurzać preparaty w kolejnych roztworach 100% ksylenu przez 2 minuty każdy. Pozostawić do wyschnięcia, a tkanki przykryć cienką warstwą VectaMount i szkiełkiem podstawowym.
Fluorescencyjne znakowanie PECAM- Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym: Nanieść kroplowo około 100-200 µL roztworu przeciwciała pierwotnego (mysie monoklonalne biotynilowane przeciwciało CD31 w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na każdą tkankę; należy upewnić się, że cała tkanka jest pokryta roztworem przeciwciała. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
- Inkubacja z przeciwciałem wtórnym: Nanieść kroplowo roztwór przeciwciała wtórnego (Streptawidyna-CY3 w rozcieńczeniu 1:100 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.
- Montowanie preparatów: Nanieść kroplowo mieszaninę PBS z glicerolem w stosunku 50:50 na tkanki. Przykryć szkiełkiem podstawowym. Następnie użyć lakieru do paznokci, aby uszczelnić szczelinę między szkiełkiem podstawowym a preparatem.
5. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne obrazy tkanek krezki szczura oznakowanych immunohistochemicznie pod kątem PECAM przedstawiono na Rysunku 3. Oznakowanie PECAM pozwala na identyfikację wszystkich typów naczyń w hierarchii przebudowywanych sieci mikro naczyniowych i może być wykorzystane do ilościowego określenia parametrów angiogennych w określonych punktach czasowych po stymulacji. Oznakowanie PECAM umożliwia również rozróżnienie tętniczek od żyłek. Tętniczki doprowadzające charakteryzują się zazwyczaj mniejszą średnicą i wydłużoną morfologią komórek śródbłonka w porównaniu z odpowiadającymi im żyłkami (Rysunek 4). Kapilary oraz pąki kapilarne można zidentyfikować na podstawie średnicy naczynia i jego względnego położenia w sieci. Typowe cechy przebudowywanych sieci obejmują zwiększone pączkowanie kapilar, gęstość naczyń, obszar unaczyniony oraz krętość żyłek. Ilościowe oznaczenie różnych parametrów angiogennych pozwala określić przebieg czasowy wzrostu sieci (Rysunek 5). Pączkowanie kapilar z istniejących naczyń osiąga szczyt między 3. a 5. dniem i powraca do poziomu niestymulowanego do 10. dnia. Po tym przejściowym wzroście pączkowania następują wzrosty gęstości naczyniowej i obszaru unaczynionego. Jako dowód na przebudowę większych naczyń w tym modelu, liczba segmentów tętniczek i żyłek również wzrasta w czasie trwania procesu.
W naszym laboratorium model ten był wykorzystywany do identyfikacji komórkowych zmian fenotypowych w określonych punktach czasowych podczas tego procesu przebudowy10, 11. Na przykład β-tubulina klasy III pozwala zidentyfikować perycyty wzdłuż naczyń angiogennych (Rycina 6). W tkankach niepobudzonych ekspresja β-tubuliny klasy III jest specyficzna dla nerwów. W przeciwieństwie do tego, podczas szczytu kiełkowania kapilar, β-tubulina klasy III jest eksprymowana przez komórki okołonaczyniowe. Tego rodzaju wynik podkreśla użyteczność tego prostego i solidnego modelu angiogennego w identyfikacji nowych typów komórek zaangażowanych w proces angiogenezy.
Rycina 1. Zdjęcia plastikowej podstawy przed i po modyfikacji. Podstawa przed modyfikacją to szalka Petriego o średnicy 100 mm. Modyfikacje obejmują wycięcie eliptycznego otworu w centrum oraz późniejsze nałożenie plasteliny lub silikonowego kleju na krawędź otworu w celu utworzenia podniesionej, gładkiej powierzchni. Powierzchnia ta stanowi wewnętrzną granicę, która ułatwia superfuzję zewnętrznych okien krezkowych. Pasek skali wynosi 1 cm.
Rycina 2. Obraz zewnętrznionego obszaru krezkowego. Okna krezkowe definiuje się jako cienkie, półprzezroczyste błony znajdujące się pomiędzy parami tętnic i żył odżywiających jelito cienkie. Podczas czasu zewnętrznienia obszar krezkowy jest rozłożony i zanurzony w soli fizjologicznej w zmodyfikowanej szalce Petriego. Obojętna żółta glina modelarska zapewnia gładką powierzchnię, przez którą krezka jest przeciągana przez wcześniej wycięty otwór. Pasek skali wynosi 1 cm.
Rycina 3. Reprezentatywne obrazy sieci mikronaczyniowych krezki z tkanek niepobudzonych oraz tkanek w 3. i 10. dniu po eksterioryzacji krezki. Marker PECAM pozwolił zidentyfikować hierarchię sieci mikronaczyniowych, w tym arteriole (A), wenule (V) i kapilary (C). Po stymulacji w sieciach mikronaczyniowych zaobserwowano zwiększenie wypustkowania kapilar (groty strzałek) oraz gęstości naczyń. Pasek skali oznacza 100 μm.
Rycina 4. Reprezentatywne obrazy par tętniczek/żyłek w sieciach mikronaczyniowych krezki dorosłego szczura. Na obu obrazach tętniczki (A) można odróżnić od żyłek (V) na podstawie mniejszej średnicy względnej oraz wydłużonej morfologii komórek śródbłonka. Paski skali wynoszą 20 μm.
Rycina 5. Reprezentatywna kwantyfikacja parametrów angiogennych w czasie wzrostu mikronaczyniowego po eksterioryzacji krezki. A) Powierzchnia naczyniowa w przeliczeniu na powierzchnię tkanki. B) Liczba pąków kapilarnych w przeliczeniu na powierzchnię naczyniową. C) Całkowita długość naczyniowa w przeliczeniu na powierzchnię naczyniową. *oznacza istotną różnicę w porównaniu z grupą niepobudzoną. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (One-Way ANOVA) z następującym po niej testem Dunna. (p < 0.05). UN oznacza grupę niepobudzoną.
Rycina 6. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne mikrokrążenia krezkowego z tkanek niepobudzonych oraz tkanek 3 i 10 dni po eksterioryzacji krezki. Immunofluorescencyjne znakowanie PECAM (czerwone) identyfikuje komórki śródbłonka, a znakowanie β-tubuliną klasy III (zielone) identyfikuje nerwy (groty strzałek) i komórki okołonaczyniowe (strzałki). Komórki okołonaczyniowe przejściowo zwiększają ekspresję β-tubuliny klasy III podczas kiełkowania naczyń włosowatych. W niepobudzonych sieciach mikrokrążenia β-tubulina klasy III jest specyficzna dla nerwów i nie identyfikuje komórek okołonaczyniowych. 3 dni po stymulacji β-tubulina klasy III pozytywnie znakuje komórki okołonaczyniowe wzdłuż mikronaczyń. Do 10. dnia wzorzec ekspresji β-tubuliny klasy III zaczyna powracać do stanu niepobudzonego. Pasek skali to 50 μm.
Rysunek 7. Obrazy potwierdzające możliwość śledzenia uprzednio znakowanych komórek aplikowanych miejscowo podczas wzrostu sieci mikronaczyniowej stymulowanej przez eksterioryzację krezki. Komórki podawano metodą superfuzji przez okna krezkowe podczas 20-minutowego okresu eksterioryzacji. 1 dzień po operacji zaobserwowano komórki znakowane DiI (czerwone) w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co mikronaczynia dodatnie pod kątem PECAM (zielone). A, B) Przykłady komórek szpiku kostnego znakowanych DiI wykazujących morfologię obłą i wydłużoną. W niektórych przypadkach (strzałki) komórki były wydłużone wzdłuż mikronaczyni. C) Przykład skupiska mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych DiI w pobliżu wierzchołka pąka kapilarnego (strzałka). Paski skali wynoszą 50 μm (A) oraz 20 μm (B, C).
Dyskusja
Model eksterioryzacji został opisany w 2006 roku i jest adaptacją wcześniejszych modeli angiogenezy w krezce szczura opartych na urazie mechanicznym4-7; daje on wyniki podobne do dobrze ugruntowanych modeli z iniekcją do. (i.p.), które wykorzystują krezkę szczura9. Wykazano eksperymentalnie, że 20-minutowy czas eksterioryzacji wywołuje silną odpowiedź angiogenną. Choć okres ten można modyfikować, pozwala on na miejscowe stosowanie inhibitorów angiogenezy4 w badaniach mechanistycznych oraz bezpośrednie wprowadzanie egzogennych komórek w celu badania linii komórkowych. Wykonalność inkorporacji komórek do przebudowującej się tkanki krezki została potwierdzona w wstępnych badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium z użyciem uprzednio znakowanych komórek szpiku kostnego oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (Rycina 7), a także poprzez sukcesy w badaniu losów ludzkich komórek stropowych pochodzenia tłuszczowego po iniekcji do.14. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy ten model do identyfikacji zmian fenotypowych perycytów w czasie trwania odpowiedzi angiogennej10 oraz do oceny potencjału angiogennego w warunkach patologicznych, takich jak nadciśnienie tętnicze12. Odpowiedź angiogenną oraz zmiany fenotypu komórek związane z tym modelem można zaobserwować również w innych modelach angiogenezy w krezce szczura, w tym podczas przewlekłej ekspozycji na hipoksję10, 11.
Ograniczeniem modelu eksterioryzacji jest fakt, że dokładne mechanizmy wyzwalające angiogenezę nie są znane. Eksterioryzacja krezki została powiązana z degranulacją komórek tucznych i zwiększonym poziomem histaminy6, jednak wymagane są dalsze badania, aby uzyskać więcej informacji. Bodziec angiogenny jest bez wątpienia wieloczynnikowy, wywołując silną odpowiedź przebudowy w całej hierarchii sieci mikronaczyniowej. Choć nieznane mechanizmy pozostają głównym punktem krytyki tego modelu, jego powtarzalność i prostota czynią go atrakcyjnym do identyfikacji dynamiki komórkowej zaangażowanej w naturalnie złożony proces kiełkowania naczyń włosowatych. Powtarzalność modelu została potwierdzona poprzez porównywalne parametry angiogenne w czasie wzrostu sieci mikronaczyniowej u wielu szczepów szczurów (samców Wistar i samic Sprague-Dawley) w wcześniej opublikowanych badaniach z naszego laboratorium10, 12. Ponieważ większość tkanek krezki dorosłych szczurów jest unaczyniona, model ten pozwala również na zbadanie wielu tkanek u jednego zwierzęcia. Niestety, model ten nie znajduje oczywistego zastosowania w genetycznych modelach mysich, ponieważ okna krezkowe u myszy wykazują mniejsze naturalne unaczynienie i, w naszym doświadczeniu, zazwyczaj brakuje w nich obserwowalnych sieci rozgałęzień. Przyszłe zastosowania obejmują badanie funkcjonalności naczyń podczas angiogenezy przy użyciu mikroskopii intravitalnej w określonych punktach czasowych oraz badanie związanej z tym dynamiki komórkowej uczestniczącej w limfangiogenezie i neurogenezie. Chociaż stopień naturalnego unaczynienia w obrębie okna krezkowego wydaje się być w przybliżeniu proporcjonalny do wieku, obserwowaliśmy rozgałęzione sieci mikronaczyniowe u samców szczurów Wistar w wieku zaledwie 4-5 tygodni. Obserwacje te sugerują, że model eksterioryzacji mógłby zostać zastosowany również do porównywania różnic angiogennych w zależności od wieku.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Board of Regents of the State of Louisiana LEQSF(2009-12)-RD-A-19 (PI: W.L. Murfee) oraz Tulane Hypertension and Renal Center of Excellence finansowane z grantu NIH P20RR017659-08 (PI: L. Gabriel Navar).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Obłożenie chirurgiczne | Cardinal Health | 4012 | 12"x12" sterylne owijki Bio-Shield Regular |
| Mikronóżce Noyes | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5677 | Mikronóżce sprężynowe do sekcji Noyes; proste, końcówki ostra-tępa; krawędź tnąca 13mm; szerokość końcówki 0.25mm, całkowita długość 4 1/2" |
| Pinceta Graefe | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | Mikropinceta do sekcji; ząbkowana; lekko zakrzywiona; szerokość końcówki 0.8mm; długość 4" |
| Pinceta Graefe | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | Mikropinceta do sekcji; ząbkowana, prosta; szerokość końcówki 0.8mm; długość 4" |
| Sznur chirurgiczny 4-0 | Ethicon Inc. | 699G | (1.5 metric) sznur nylonowy ETHILON, czarny monofilament |
| Sznur chirurgiczny 5-0 | Ethicon Inc. | 8556 | (1.0 metric) sznur polipropylenowy PROLENE, niebieski monofilament |
| Sznur chirurgiczny 7-0 | Ethicon Inc. | 1647G | (0.5 metric) sznur nylonowy ETHILON, czarny monofilament |
| Mikroportań Castroviejo | Fine Science Tools | 12060-02 | Szerokość końcówki:0.6mm Długość zacisku:5mm Długość:9cm Końcówka prosta |
| Portań Castroviejo | Fine Science Tools | 12565-14 | Kształt końcówki:prosta Szerokość końcówki:1.5mm Długość zacisku:10mm Nożyczki:nie Blokada:tak Długość:14cm Ząbkowanie:tak |
| Rękojeść skalpela | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | Rękojeść skalpela, #3; pełna; długość 4" |
| Sterylne ostrze chirurgiczne | Cincinnati Surgical | 0110 | Stal nierdzewna; rozmiar 10 |
| Szalka Petriego | Fisher Scientific | 08-757-13 | Z fazowanym brzegiem, z pokrywką |
| Tabela specyficznych materiałów i narzędzi chirurgicznych. | |||
| Beuthanasia | Merck & Co. | MWI #: 011168 | Składnik aktywny: na 100mL, 390 mg pentobarbalsodu, 50mg fenytoiny sodowej |
| Ketamina | Fort Dodge Animal Health | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Ksylazyna | Lloyd, Inc. | MWI #: 009307 | Anased 100 mg/ml (zamówiono z MWI Veterinary Supply) |
| Sól fizjologiczna | Hospira Inc. | 94-217-JT | |
| PBS | Sigma-Aldrich | 011M8207 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | BCBB4080 | |
| PECAM (CD31) | BD Biosciences | 553371 | |
| Streptawidyna-CY3 | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 096555 | |
| VECTASTAIN Elite ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Vector Nova Red | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| VectaMount | Vector Laboratories | H-500 | |
| Tabela specyficznych odczynników |
Bibliografia
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, 249-257 (2000).
- le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. Angiogenesis and hypertension. J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).
- Peirce, S. M., Skalak, T. C. Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis. Microcirculation. 10, 99-111 (2003).
- Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo. J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).
- Ponce, A. M., Price, R. J. Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo. Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).
- Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery. Agents Actions. 33, 371-377 (1991).
- Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling. Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
- Norrby, K. C. Rat Mesentery Angiogenesis Assay. J. Vis. Exp. (52), e3078(2011).
- Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling. Microcirculation. 13, 261-273 (2006).
- Stapor, C. P., Murfee, L. W. Identification of class III β-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells. Microvascular Research. , Forthcoming (2011).
- Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats. Microcirculation. , (2011).
- Robichaux, J. L. Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery. Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).
- Amos, P. J. IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype. Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).
Przedruki i uprawnienia
