Zastosowanie fMRI z wyzwaniem farmakologicznym w badaniach przedklinicznych: aplikacja do układu 5-HT

Podsumowanie

Celem tej techniki jest ocena funkcji neurotransmitera serotoniny (5-HT) u żywego, oddychającego swobodnie zwierzęcia z wykorzystaniem farmakologicznego obrazowania rezonansem magnetycznym (phMRI) oraz dożylnego podania fluoksetyny, będącej selektywnym inhibitorem zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI).

Streszczenie

Farmakologiczny rezonans magnetyczny (phMRI) to nowa i obiecująca metoda badania wpływu substancji na funkcje mózgu, która może ostatecznie posłużyć do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów neurobiologicznych leżących u podstaw działania leków oraz zaburzeń związanych z neuroprzekaźnikami, takich jak depresja i ADHD. Podobnie jak większość metod obrazowania (PET, SPECT, CT), stanowi ona postęp w nienajazywnym badaniu zaburzeń mózgu i związanej z nimi funkcji szlaków neuroprzekaźników z uwzględnieniem ogólnej łączności neuronalnej. Co więcej, phMRI stanowi idealne narzędzie do przełożenia wyników na badania kliniczne. MRI, mimo że w strategiach obrazowania molekularnego wciąż ustępuje PET i SPECT, ma ogromną zaletę w postaci wysokiej rozdzielczości przestrzennej oraz braku konieczności wstrzykiwania środka kontrastowego lub cząsteczek znakowanych radioaktywnie, co pozwala uniknąć powtarzalnej ekspozycji na promieniowanie jonizujące. Funkcjonalny rezonans magnetyczny (fMRI) jest szeroko stosowany w badaniach i praktyce klinicznej, gdzie zazwyczaj łączy się go z zadaniem psychomotorycznym. phMRI jest adaptacją fMRI umożliwiającą badanie konkretnego układu neuroprzekaźnikowego, np. serotoninowego (5-HT), w warunkach fizjologicznych lub patologicznych po aktywacji poprzez podanie specyficznego leku wyzwalającego.

Celem opisanej tutaj metody jest ocena funkcji 5-HT w mózgu zwierząt oddychających swobodnie. Poprzez stymulację układu 5-HT przy jednoczesnym pozyskiwaniu funkcjonalnych obrazów MR w czasie, można zwizualizować odpowiedź mózgu na tę stymulację. Wiele badań na zwierzętach wykazało już, że indukowane lekami zwiększenie pozakomórkowych poziomów np. 5-HT (środki uwalniające, selektywne blokery wychwytu zwrotnego itp.) wywołuje specyficzne dla danego regionu zmiany w sygnałach BOLD (blood oxygenation level dependent) w MRI (sygnał wynikający ze zmiany poziomów hemoglobiny utlenowanej/odutlenionej występującej podczas aktywacji mózgu poprzez zwiększenie dopływu krwi w celu dostarczenia tlenu i glukozy do aktywnych neuronów), co stanowi wskaźnik funkcji neuroprzekaźników. Wykazano również, że efekty te mogą być odwracane przez terapie zmniejszające dostępność 5-HT^16,13,18,7. U dorosłych szczurów opisano zmiany sygnału BOLD po ostrym podaniu SSRI w kilku regionach mózgu powiązanych z 5-HT, tj. obszarach korowych, hipokampie, podwzgórzu i wzgórzu^9,16,15. Stymulacja układu 5-HT i jego odpowiedź na tę stymulację mogą zatem służyć jako miara jego funkcji zarówno u zwierząt, jak i u ludzi^2,11.

Protokół

Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania MRI in vivo

1. Kanulacja chirurgiczna

1. Zanurz szczura (samiec szczura Wistar, 200-300 g) w anestezji przy użyciu izofluranu (5% indukcja, następnie redukcja do 1,5-2% w celu utrzymania znieczulenia podczas przygotowania zwierzęcia i skanowania) podawanego w powietrzu medycznym (21% O₂, BOC UK). Upewnij się, że zwierzę jest dobrze znieczulone i nie wykazuje reakcji na uciśnięcie palca u nogi. W tętnicę i żyłę udową wprowadza się kaniule odpowiednio do pomiaru gazometrii krwi i ciśnienia tętniczego oraz do podawania leku. Podczas procedury chirurgicznej temperatura ciała zwierzęcia jest monitorowana i utrzymywana za pomocą sondy rektalnej i koca grzewczego (Harvard apparatus).
2. Znieczulone zwierzę umieszcza się na podkładce grzewczej pod mikroskopem stereoskopowym w pozycji grzbietowej. Ogol obszar środkowy uda i przemyj skórę alkoholem. Wykonaj nacięcie skóry o długości 2 cm wzdłuż fałdy tworzącej połączenie brzucha i prawego uda. Wykonaj鈍ątą dyssekcję mięśni przywodzicieli, aby uwidocznić tętnicę udową, żyłę udową i nerw udowy. Ostrożnie odseparuj naczynia.
3. Delikatnie zawiąż jedwabną ligaturę całkowicie wokół dystalnego końca naczynia, a następnie zawiąż drugą ligaturę z połową węzła chirurgicznego luźno w miejscu proksymalnym. Pociągnij obie ligatury, aby zablokować przepływ krwi w pozostałej środkowej części naczynia wyeksponowanej między ligaturami. Wykonaj małe nacięcie obejmujące około jednej trzeciej obwodu naczynia w tej części, aby umożliwić wprowadzenie kaniuli PE-50 (średnica wewnętrzna 0,54 mm i zewnętrzna 0,96 mm w przypadku dorosłych samców szczurów, w przeciwnym razie ID 0,40 mm i ED 0,80 mm) do naczynia.
4. Kaniulę należy wprowadzić do naczynia na głębokość kilku mm (co najmniej 5). Po wprowadzeniu do światła naczynia przemyj je niewielką ilością soli fizjologicznej z heparyną (15 UI/ml), aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi. Proksymalna pętla jedwabna zostaje również całkowicie zawiązana, aby unieruchomić kaniulę. Powtórz tę procedurę dla drugiego naczynia. Sklej skórę za pomocą kleju tkankowego Vetbond Tissue Adhesive (3M UK plc, Bracknell, UK), gdy obie kaniule znajdą się na miejscu. Dokładne rozmieszczenie kaniul przedstawiono na Rysunku 1.
5. Umieść zwierzę w kompatybilnej z MR ramie stereotaktycznej (m2m Imaging Corp., USA) w pozycji brzusznej. Unieruchom głowę zwierzęcia za pomocą prętów usznych i pręta zębowego. W tym momencie zwierzę może zostać umieszczone w skanerze MRI w celu obrazowania. Zwierzę pozostaje pod narkozą i oddycha samodzielnie przez cały proces obrazowania.

2. Monitorowanie

Podczas całej procedury obrazowania należy stale monitorować kilka reakcji fizjologicznych i utrzymywać je na możliwie stałym poziomie. Jest to niezbędne, ponieważ reakcje te mogą ulegać znacznym zmianom w tym samym przedziale czasowym co sygnał phMRI i mogą również wpływać na analizowany sygnał. Jest to także istotne ze względu na to, że zwierzę zostanie umieszczone w magnesie, przez co pozostanie poza zasięgiem wzroku i nie będzie możliwe przeprowadzenie standardowych kontroli głębokości znieczulenia (np. odruch na uciśnięcie palca), co pozwala zapewnić odpowiedni stopień znieczulenia. Ponadto, ponieważ wiele leków zmienia parametry sercowo-naczyniowe, takie jak ciśnienie krwi, ich pomiar jest krytyczny, aby umożliwić uwzględnienie globalnych efektów fizjologicznych działania leku w danych phMRI. Warto również zapoznać się z sekcją 4 w celu sprawdzenia wartości bazowych oraz oczekiwanych reakcji na infuzję 5 mg/kg fluoksetyny.

1. Temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie 37 ± 1.5 °C za pomocą systemu ogrzewania ciepłym powietrzem (SA Instruments, New York, USA). Należy pamiętać, że obrazowanie MR może wpływać na pomiar temperatury; należy sprawdzić to na własnym systemie.
2. Monitoruj i zapisuj częstotliwość oddychania zwierzęcia, używając mankietu oddechowego sprzężonego z czujnikiem ciśnienia (SA Instruments, New York, USA).
3. Rejestruj inwazyjne ciśnienie tętnicze krwi za pomocą przetwornika ciśnienia (TSD104A, Biopac Systems Corp., USA) i okresowo pobieraj oraz analizuj próbki gazów krwi tętniczej (RapidLab, Siemens diagnostic) poprzez kaniulowaną tętnicę udową podczas obrazowania, aby monitorować tętnicze pCO₂ oraz ciśnienie parcjalne tlenu (pO₂).
4. Wykorzystaj kaniulowaną żyłę udową jako główną linię infuzyjną do podania preparatu farmakologicznego (roztwór fluoksetyny (w postaci chlorowodorku fluoksetyny z Sigma-Aldrich, UK), 5 mg/kg, rozpuszczony w soli fizjologicznej).

In vivo obrazowanie

Schematyczny rysunek układu eksperymentalnego fMRI przedstawiono na Rysunku 2.

3. Parametry obrazowania

1. Po umieszczeniu zwierzęcia w skanerze i potwierdzeniu stabilnych reakcji fizjologicznych można rozpocząć obrazowanie. W naszych badaniach zastosowano system MRI dla małych zwierząt 4.7 T (Agilent technologies) z cylindryczną kwadraturową cewką nadawczo-odbiorczą RF o średnicy wewnętrznej 72 mm (m2m Imaging Corp., USA). Wykonaj obraz skautowy w trzech płaszczyznach, aby prawidłowo ustawić mózg w centrum pola widzenia MRI, oraz zastosuj lokalną korekcję shimowania (sekwencja fastmap), aby poprawić homogeniczność pola magnetycznego w obszarze mózgu.
2. Dla każdego zwierzęcia najpierw wykonaj anatomiczną wolumetrię obrazu ważonego T2 w celu rejestracji i segmentacji. Zastosowano sekwencję turbo spin echo z długością pociągu ech = 8; rozmiarem macierzy = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm²; z przeplataną akwizycją 30 sąsiadujących przekrojów czołowych o grubości 1 mm, z centrowaniem 8 mm głowicowo od tylnej krawędzi opuszki węchowej; liczba średnich = 4; TR/TE = 5112/60 ms.
3. Przed rozpoczęciem skanowania phMRI upewnij się, że reakcje fizjologiczne zwierzęcia są stałe. Do akwizycji serii czasowej zastosowano tę samą sekwencję turbo spin echo ważoną T2 z długością pociągu ech = 16; rozmiarem macierzy = 128 x 128; z przeplataną akwizycją 20 sąsiadujących przekrojów o grubości 1 mm, wycentrowanych w tej samej pozycji; TR/TE = 4915/60 ms. Łącznie pozyskano 32 punkty czasowe, przy czasie akwizycji 158 sec na wolumen serii czasowej i całkowitym czasie skanowania wynoszącym 84 min. Pierwszy wolumen służy jako „skan pozorny” (dummy scan) w celu zniwelowania efektów nasycenia T1 i nie jest wykorzystywany w analizie danych. Można również zastosować inne sekwencje fMRI, takie jak sekwencje gradientowego echa lub obrazowanie planarne (EPI). Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ocenić stabilność sygnału wybranej sekwencji.
4. Przed podaniem leku testowego wykonaj kilka wolumenów bazowych. Sugerujemy co najmniej 10 minut akwizycji bazowej w stabilnych warunkach. Rozpocznij infuzję dokładnie w tym samym czasie dla wszystkich zwierząt. W naszym protokole podawanie leku rozpoczęto wraz z 9. wolumenem (po około 21 min skanowania bazowego). Po infuzji akwizycję obrazów kontynuowano przez kolejne 60 minut (łącznie 32 wolumeny). Upewnij się, że okres po infuzji jest wystarczająco długi, aby zwizualizować zmiany oraz osiągnąć stan stacjonarny lub powrót sygnału do normy, w zależności od pytania badawczego i wybranego leku.
5. Po zakończeniu akwizycji obrazów wyjmij zwierzę ze skanera. Wykonaj końcowy pomiar gazometrii krwi, aby upewnić się co do stabilności parametrów gazowych krwi i umożliwić ocenę wpływu leku na podstawową fizjologię.

Przetwarzanie danych

4. Odpowiedzi fizjologiczne

Oczekiwane odpowiedzi fizjologiczne na wyzwanie zależą od wybranego leku. Poniżej podano ogólnie przyjęte wartości bazowe (dla dorosłych samców szczurów) oraz oczekiwane odpowiedzi po dożylnym wlewie fluoksetyny w dawce 5 mg/kg.

1. Częstość oddechów powinna być stabilna i wynosić 45-75 oddechów/minutę. Wyzwanie farmakologiczne fluoksetyną wywołuje krótki wzrost (15-20%) częstości oddechów.
2. Ciśnienie tętnicze powinno być stałe i mieścić się w zakresie 100-150 mmHg (Biopac Systems Corp., Goweta, USA). Podanie fluoksetyny indukuje krótki, ale gwałtowny spadek ciśnienia tętniczego o około 20%. Powinno ono powrócić do normy w ciągu 5-10 minut. Jest to przedstawione na Rysunku 3.
3. Wartości gazometrii krwi powinny być stabilne (pomiar przeprowadzić co najmniej dwukrotnie) i mieścić się w następujących zakresach przed rozpoczęciem skanowania phMRI: pCO₂ 35-45 mmHg; pO₂ 80-130 mmHg; pH 7,35-7,45. Wartości te należy zawsze sprawdzić ponownie po skanowaniu, aby upewnić się, że stan zwierzęcia pozostał stabilny oraz aby umożliwić ocenę wpływu leku na podstawowe parametry fizjologiczne. Wysokie wartości pCO₂ wywołają wazodylatację, co uniemożliwi zaobserwowanie zmian sygnału BOLD.
4. Przed rozpoczęciem skanowania phMRI należy upewnić się, że zwierzę znajduje się pod ciągłym i stałym poziomem znieczulenia (2±0,25%; wyższe poziomy mogą powodować depresję reaktywności naczyniowo-mózgowej, natomiast zbyt niska znieczulenie może prowadzić do ruchów zwierzęcia). Co ważne, należy unikać jakichkolwiek korekt w schemacie znieczulenia (np. % izofluranu i/lub przepływu gazu) podczas akwizycji obrazów funkcjonalnych, ponieważ mogłoby to również wpłynąć na sygnał BOLD.

5. Przetwarzanie wstępne danych MRI

W niniejszym materiale opisujemy kilka etapów wstępnego przetwarzania danych MR w celu ich optymalizacji pod kątem analizy statystycznej. Wymieniamy narzędzia wykorzystywane w naszym laboratorium, jednak dostępnych jest wiele innych rozwiązań.

5.1 Przygotowanie danych

1. Przekształć surowe obrazy do odpowiedniego formatu plików obsługiwanego przez preferowane oprogramowanie do analizy MRI (format NIfTI1.1 lub Analyze7.5 dla programów FSL). W internecie dostępnych jest kilka bezpłatnych programów do konwersji plików. W zależności od użytego skanera może być konieczne uprzednie stworzenie obrazu 3D (skan anatomiczny) lub 4D (skan phMRI) ze wszystkich oddzielnych przekrojów 2D. Można to zrobić za pomocą programu do przetwarzania obrazów, takiego jak ImageJ¹.
2. Aby zapewnić kompatybilność z algorytmami analizy zaprojektowanymi do pracy z danymi ludzkimi (np. programami FSL), rozmiar woksela musi zostać pomnożony przez współczynnik 10 (można to również zrobić na przykład w programie ImageJ). W naszym badaniu skutkowało to uzyskaniem rozmiaru woksela 3.91 x 3.91 x 10 mm³.
3. Wizualnie sprawdź obrazy pod kątem nieprawidłowości w orientacji, artefaktów oraz ruchów. Należy unikać wykorzystywania w analizach skanów z wyraźnymi artefaktami lub nadmiernymi ruchami, ponieważ zniekształcą one wyniki.
4. Orientacja wszystkich skanów powinna być podobna dla obrazów anatomicznych i funkcjonalnych oraz zgodna z użytym mózgiem referencyjnym. W naszym badaniu zastosowaliśmy stereotaktyczny szablon mózgu szczura opisany przez Schwarz¹⁴. Do reorientacji można użyć polecenia FSL fslswapdim.

5.2 Korekcja ruchu

1. Aby skorygować artefakty ruchowe w czterowymiarowej serii czasowej, użyliśmy narzędzia do korekcji ruchu McFlirt (Motion Correction using FMRIB's Linear Image Registration Tool, część biblioteki oprogramowania FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk/fsl). MCFLIRT to narzędzie do wewnątrzmodalnej korekcji ruchu zaprojektowane do analizy serii czasowych fMRI, oparte na technikach optymalizacji i rejestracji wykorzystywanych w FLIRT — w pełni zautomatyzowanym narzędziu do liniowej (afinicznej) międzymodalnej rejestracji obrazów mózgu. Zawsze należy sprawdzić, czy uzyskany wynik jest satysfakcjonujący.

5.3 Segmentacja mózgu

1. Usuń wszystkie tkanki inne niż mózg z obrazu całej głowy, zarówno dla serii czasowej 4D, jak i dla obrazu anatomicznego 3D. W tym celu zastosowano narzędzie BET z pakietu FSL (Brain Extraction Tool v. 2.1, część biblioteki oprogramowania FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk/fsl). Ustawienia domyślne zostały opracowane z myślą o ludzkich mózgach i nie są zatem optymalne dla mózgu szczura. Zastosowano następujące parametry: próg intensywności frakcyjnej f = 1.0; gradient pionowy progu intensywności frakcyjnej g = 0.1 oraz promień głowy (w mm) r = 175 dla większości zwierząt. W razie potrzeby wartości te można zoptymalizować dla każdego osobnika z osobna.

6. Analiza danych

Celem analizy statystycznej danych MR jest określenie w sposób statystycznie wiarygodny wokseli wykazujących dodatkową wariancję przypisywalną próbie z lekiem. W tym celu dostępne są różne podejścia metodologiczne, w tym liczne pakiety oprogramowania. Wybór metody zależy od dostępnego oprogramowania, wiedzy i doświadczenia w laboratorium oraz od konkretnego pytania badawczego. Poniżej przedstawiamy sugerowaną metodę stosowaną w naszym laboratorium.

6.1

1. Przed analizą danych MRI należy określić uogólniony model liniowy (GLM), do którego dopasowane zostaną dane. Może to być prosty model prostokątny typu włącz/wyłącz (wyłączony dla stanu przed podaniem leku i włączony dla stanu po infuzji leku) lub specyficzny model oparty na danych. Do wyznaczenia modelu GLM opartego na danych wykorzystaliśmy program Stimulate²¹.
2. Przeprowadź test t-Studenta dla dwóch prób (na przykład w programie Stimulate) dla wszystkich objętości bazowych w porównaniu do wszystkich objętości po próbie prowokacyjnej. Opcjonalnie można pominąć pierwszą objętość (lub pierwsze objętości) oraz objętość, podczas której podawana jest próbka, ponieważ mogą one nie reprezentować obrazowania w stanie stacjonarnym. Następnie odróżnij wszystkie voxele, w których zmiana względem wartości bazowej przekroczyła określoną wartość procentową. W naszej analizie uwzględniliśmy wszystkie voxele ze zmianą przekraczającą 1%.
3. Następnie oblicz średnią przebiegu czasowego dla wszystkich tych voxeli, co pozwoli uzyskać wstępny obraz kształtu modelu. W ten sposób można określić, czy próba prowokacyjna 1) wywołuje efekt natychmiastowy czy opóźniony, 2) czy i kiedy efekt osiąga plateau i/lub szczyt oraz 3) czy i kiedy efekt ponownie spada w czasie trwania skanowania. Przykłady przedstawiono na Rysunku 4A i 4B.

6.2

Kolejnym krokiem jest statystyczne przetestowanie surowego obrazu czasowego 4D każdego zwierzęcia pod kątem wcześniej opracowanego modelu GLM. W tym celu wykorzystano program FEAT z pakietu FSL (FMRI Expert Analysis Tool, v5.98)^17,24. Dostępne są jednak również inne narzędzia do analizy fMRI. W narzędziu analitycznym należy skonfigurować analizę pierwszego poziomu. Wymaga to wykonania następujących kroków:

1. Upewnij się, że dla każdego zwierzęcia zastosowano te same ustawienia. Można zdecydować o usunięciu pierwszych (dwóch) wolumenów przed analizą, ponieważ w tym punkcie stan stacjonarny obrazowania może nie być jeszcze osiągnięty. Ustaw TR; jest to czas (w sekundach) pomiędzy początkiem każdego kolejnego wolumenu. Ponieważ badane są efekty, które mogą trwać przez cały czas skanowania, nie ma potrzeby ustawiania filtru górnoprzepustowego lub dolnoprzepustowego.
2. Wygładź przestrzennie dane, aby zredukować szum i poprawić stosunek sygnału do szumu (SNR). Wybrano jądro FWHM o szerokości 8 mm.
3. Następnie uruchom wybrany model GLM na swoich danych. Jest to główna zmienna objaśniająca (EV), tzn. kształt fali, w odniesieniu do którego testowane są dane. Model GLM wyznaczony na podstawie naszych własnych danych przedstawiono na Rysunku 4C. Istnieje również możliwość dodania dodatkowych zmiennych zakłócających (EV), takich jak parametry ruchu, szum niskoczęstotliwościowy (dryft skanera), a nawet parametry fizjologiczne, takie jak ciśnienie krwi, aby usunąć ogólne fizjologiczne efekty działania leku.
   W ramach FEAT: użyj wybielania FILM (FILM prewhitening). Dodaj pochodną czasową. W karcie Contrasts & F-tests skonfiguruj kontrast. Aby przekształcić pojedynczą zmienną EV w obraz statystyki Z, ustaw wartość kontrastu na 1. Pozwoli to uzyskać wszystkie woksele, w których przebieg czasowy może być znacząco wyjaśniony przez GLM. Ustawienie wartości na -1 pozwoli uzyskać aktywację negatywną.
   
4. Po przeprowadzeniu wstępnego testu statystycznego, otrzymany obraz statystyczny musi zostać poddany progowaniu, aby wskazać, które woksele lub klastry wokseli są aktywne na danym poziomie istotności. Ze względu na dużą liczbę testowanych wokseli mózgu konieczna jest korekta dla wielokrotnych porównań. Program FSL FEAT wykorzystuje zautomatyzowaną korektę wielokrotnych porównań opartą na klastrach, bazującą na teorii GRF (Gaussian Random Field)²⁵.
5. Na koniec dane powinny zostać znormalizowane przestrzennie do obrazu referencyjnego w celu przeprowadzenia statystyki grupowej. Najpierw zarejestruj dane funkcjonalne do anatomicznego obrazu mózgu zwierzęcia z usuniętą tkanką poza mózgiem, a następnie do obrazu referencyjnego. Jako mózg referencyjny wykorzystano stereotaktyczny szablon mózgu szczura opisany przez Schwarz¹⁴.
6. Po tym kroku analizy pierwszego poziomu dla wszystkich zwierząt mogą zostać połączone w analizach statystycznych wyższego poziomu (grupowych). Jest to ściśle zależne od projektu badania i pytań badawczych.

6.3

Następnie analizy pierwszego poziomu dla wszystkich zwierząt można połączyć w analizach statystycznych wyższego poziomu (grupowych). Zależy to w znacznym stopniu od projektu badania oraz stawianych pytań badawczych.

6.4

Reakcje fizjologiczne na lek mogą zostać powiązane lub skorelowane z sygnałem MR, jeśli jest to pożądane. Patrz również sekcja 6.2.3 dotyczącą dodawania zmiennych towarzyszących (confound EV's).

7. Reprezentatywne wyniki

Po podaniu leku próbnego (5 mg/kg i.v. fluoksetyny) do układu naczyniowego powinna wystąpić wyraźna odpowiedź fizjologiczna w postaci wzrostu częstości oddechów oraz spadku ciśnienia tętniczego. Reakcje te normalizują się średnio w ciągu 5-10 min. Na Rysunku 3 ten spadek ciśnienia krwi jest wyraźnie widoczny.

Średni przebieg czasowy sygnału powinien wykazywać stosunkowo stabilną linię bazową oraz wyraźny efekt wyzwalacza. Najlepiej, aby w sygnale nie występował dryf niezależny od wyzwalacza. Reprezentatywny przykład średniego przebiegu czasowego sygnału przedstawiono na Rysunku 5A. Artefakty, takie jak depresja/niewydolność oddechowa lub zmiany w anestezji, są często wyraźnie widoczne w sygnale. Depresja oddechowa negatywnie wpłynie na sygnał w całym mózgu, co można zobaczyć na Rysunku 5B.

Po analizie pierwszego poziomu oczekiwany wzorzec aktywacji powinien być głównie dodatni i zlokalizowany jedynie w określonych obszarach (tj. w obszarach korowych, hipokampie, podwzgórzu i wzgórzu; patrz Rysunek 6A). Jeśli cały mózg wykazuje brak aktywacji, często jest to oznaka zbyt głębokiej anestezji i/lub niedoboru tlenu podczas skanowania. Przykład tego zjawiska przedstawiono na Rysunku 6B.

Rysunek 1. Lokalizacja wprowadzenia kaniul do tętnicy i żyły udowej.

Rysunek 2. Schematyczna reprezentacja konfiguracji MRI; cały sprzęt musi być nieferromagnetyczny i jest podłączony do systemu modułowego, który umożliwia bramkowaną akwizycję obrazów, zapobiegając zakłóceniom wynikającym z ruchu spowodowanego oddychaniem i/lub biciem serca. Temperatura ciała jest również regulowana za pomocą modułu grzewczego w celu monitorowania i kontroli temperatury zwierzęcia podczas obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 3. Reprezentatywny przykład danych dotyczących ciśnienia krwi. Bezpośrednio po rozpoczęciu wlewu (czerwony pasek) widoczny jest wyraźny spadek ciśnienia krwi. Wartości prawidłowe zostają ponownie osiągnięte w ciągu 10 min po podaniu substancji testowej.

Rysunek 4. A) Oczekiwany wzorzec aktywacji z wykorzystaniem programu do analizy MRI Stimulate (kolor czerwony oznacza aktywację dodatnią, kolor niebieski oznacza aktywację ujemną). B) Średni przebieg czasowy wszystkich aktywowanych wokseli (zmiana ≥1% względem poziomu bazowego) u wszystkich zwierząt. C) Przykład wynikowego modelu GLM w FSL/FEAT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.

Rysunek 5.

1. Przykład aktywacji pozytywnej. Przebieg czasowy w aktywowanych wokselach (czerwone) w przybliżeniu odpowiada kształtowi modelu GLM. Infuzja leku rozpoczęła się około 8. punktu czasowego.
2. Przykład aktywacji negatywnej w całym mózgu po zbyt głębokiej anestezji. Przebieg czasowy w negatywnie aktywowanych wokselach (niebieskie) wykazuje ogólny spadek sygnału i nie jest widoczny efekt próby.

Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 6.

1. Oczekiwany wzorzec aktywacji po analizie pierwszego poziomu. Aktywacja skupisk wokseli (od czerwonego do żółtego), wyłącznie w określonych obszarach mózgu.
2. Przykład „złego” wzorca aktywacji. Negatywna aktywacja całego mózgu (niebieska) u tego samego zwierzęcia, co na Rysunku 5B.

Dyskusja

fMRI dla 5-HT jest obiecującym narzędziem do oceny funkcji neurotransmiterów u zwierząt in vivo. Pozwala ono na wizualizację reakcji mózgu na wyzwanie 5-HT za pomocą funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym. MRI posiada ogromną zaletę w postaci wysokiej rozdzielczości przestrzennej i nie wymaga wstrzykiwania środków kontrastowych ani cząsteczek znakowanych radioaktywnie, co pozwala uniknąć powtarzalnej ekspozycji na promieniowanie jonizujące. Technika ta ma zastosowanie zarówno u ludzi, jak i u zwierząt, dlatego jest bardzo odpowiednia do badań translacyjnych nad systemami neurotransmiterów i zaburzeniami psychiatrycznymi. Jej zastosowanie nie ogranicza się oczywiście tylko do szlaku 5-HT i była już szeroko wykorzystywana do oceny efektów leków dopaminergicznych zarówno u zwierząt^5,15, jak i u ludzi²².

Niemniej jednak, phMRI u małych zwierząt pozostaje wyzwaniem, co zostało już wskazane w artykułach przeglądowych Martina i Sibsona¹¹ oraz Stewarda²⁰. Jednym z tych wyzwań jest utrzymanie stabilnych parametrów fizjologicznych podczas akwizycji obrazów. Większość środków znieczulających może zmieniać funkcje układu sercowo-naczyniowego, a ponieważ phMRI jest krytycznie zależne od parametrów sercowo-naczyniowych i hemodynamicznych, niezbędne jest zapewnienie, aby wszelkie zmiany hemodynamiczne wynikały wyłącznie z podania badanego leku. Dlatego też kluczowe jest, aby poziomy pCO₂ pozostawały stałe podczas akwizycji bazowej. Wentylacja mechaniczna może pomóc w zapewnieniu stabilności fizjologicznej i jest często stosowana w tego typu eksperymentach. Wybraliśmy jednak zwierzęta oddychające swobodnie, aby pozostawić możliwość przeprowadzenia badań podłużnych w przyszłości. Zamiast tego, intensywnie monitorowaliśmy (i korygowaliśmy) częstotliwość oddychania oraz wartości gazów krwi, aby zapewnić stabilność fizjologiczną w normach przed rozpoczęciem skanowania funkcjonalnego, a tym samym zachować stabilną reaktywność naczyniową i sygnał T2*/T2. Literatura dotycząca wpływu znieczuleń ogólnych na hemodynamiczne i metaboliczne parametry mózgu jest obszerna²⁰ i wykracza poza zakres niniejszego opracowania. W tym konkretnym protokole zdecydowaliśmy się na znieczulenie gazowe przy użyciu ±2% izofluranu, ponieważ w przypadku anestetyków inhalacyjnych można szybko i łatwo kontrolować głębokość znieczulenia. Jest to istotne w naszej konfiguracji, aby zapewnić stabilne poziomy pCO₂ w zakresie normy przed rozpoczęciem akwizycji obrazów. Izofluran jest obecnie najczęściej stosowanym anestetykiem inhalacyjnym i pozwala na szybką indukcję oraz wybudzenie, co jest ważne w badaniach podłużnych. Powoduje on również minimalną depresję układu sercowo-naczyniowego i oddechowego oraz indukuje dobrą relaksację mięśni szkieletowych.

Po drugie, dożylne podawanie trudnych leków jest bardziej skomplikowane u małych zwierząt niż u ludzi. Operacja niezbędna do kaniulacji tętnicy i żyły udowej wymaga dobrze wyszkolonego i doświadczonego personelu. Ze względu na te inwazyjne procedury metoda ta jest obecnie stosowana głównie w badaniach terminalnych. Jednak nieinwazyjne monitorowanie homeostazy krwi oraz wstrzykiwanie do żyły ogonowej mogłyby zostać wykorzystane w badaniach podłużnych²³.

Ponadto istnieją pewne bardziej ogólne ograniczenia tej techniki, które nie są specyficzne dla zwierzęcego phMRI. Dodatkowo, jak wskazali Martin i Sibson¹¹, potencjalnym czynnikiem zakłócającym we wszystkich badaniach fMRI jest założenie, że zmiany w aktywności mózgu wywołane bodźcem odzwierciedlają zmiany aktywności neuronalnej, a nie obwodowe efekty systemowe. Zwłaszcza w głębszych strukturach mózgu wciąż istnieje stosunkowo słabe zrozumienie sprzężenia neuronaczyniowego (relacji między zmianami aktywności neuronalnej a zmianami hemodynamicznymi). Badania typu przeprowadzonego przez Logothetisa ¹⁰ w celu określenia sprzężenia neuronaczyniowego w korze nie zostały jeszcze przeprowadzone w innych częściach mózgu. Nie wiadomo zatem, co wzrost sygnału BOLD w ważnych strukturach, takich jak prążkowie czy ciało migdałowate, mówi nam o aktywności neuronalnej. W tej chwili możemy jedynie stwierdzić, że obszar mózgu reaguje na dany bodziec i że w zależności od zastosowanego leczenia i/lub warunków możemy monitorować istotne zmiany reaktywności mózgu. Można to w dużej mierze zweryfikować, analizując zarówno dane MRI, jak i odpowiedzi fizjologiczne. Ogólny wzorzec aktywacji mózgu powinien być specyficzny dla regionu i ograniczony do obszarów o wysokiej innowacji 5-HT (w tym przypadku), a nie być ogólną odpowiedzią naczyniową. Oczekiwany jest również inny profil czasowy zmian naczyniowych i hemodynamicznych. Podczas gdy zmiany ciśnienia krwi powracają do wartości bazowych w ciągu kilku minut, efekt leku na aktywację BOLD w przypadku fluoksetyny jest widoczny do końca akwizycji obrazu i odpowiada znanym właściwościom farmakokinetycznym tego leku. Wreszcie, odpowiedzi fizjologiczne wszystkich zwierząt powinny być podobne, aby umożliwić porównania międzyosobnicze. Niemniej jednak wiadomo, że istnieje neurogenna regulacja lokalnego przepływu krwi przez 5-HT⁴. W związku z tym nie można wykluczyć, że lokalne zmiany sygnału BOLD mogą wynikać ze zmian naczyniowych spowodowanych uwalnianiem 5-HT w pobliżu naczyń. Chociaż efekty te nie są związane z lokalną aktywacją neuronalną i mogą być zatem uznane za wyniki fałszywie dodatnie, stanowią one również wskaźnik ogólnej specyficznej funkcji układu 5-HT (patrz również³).

Kluczowe kroki tej techniki polegają zatem na szerokim monitorowaniu reakcji fizjologicznych oraz upewnieniu się, że stan fizjologiczny zwierzęcia jest stabilny przed i w trakcie akwizycji obrazów. Warunki skanera powinny być również jak najstabilniejsze i identyczne dla każdego zwierzęcia. Stabilność sygnału sekwencji należy sprawdzić i potwierdzić przed rozpoczęciem eksperymentu. Ponadto należy upewnić się, że moc statystyczna jest zawsze wystarczająco duża, nawet w przypadku małych grup badawczych. W celu uzyskania dobrego przeglądu kwestii eksperymentalnych dotyczących phMRI u zwierząt w ogóle, zobacz Steward ²⁰, a w celu zapoznania się z dodatkowym przykładem protokołu eksperymentalnego dla fMRI farmakologicznego u szczurów i myszy, zobacz Ferrari⁵.

Możliwe modyfikacje opisanej tutaj techniki są liczne. Można by:

1. zastosowanie innego leku do próby prowokacyjnej 5-HT, takiego jak inne SSRI lub (ant)agoniści receptorów 5-HT^16,13,18,7, a nawet podwójnej próby prowokacyjnej w celu ujawnienia podstawowych mechanizmów działania leku^6,19;
2. wykorzystanie innego układu eksperymentalnego, takiego jak inny schemat znieczulenia, wentylacja mechaniczna, kontrastowe środki wypełniające łożysko naczyniowe zamiast BOLD¹⁵, badania podłużne (zwierzę musi pozostać żywe, więc niemożliwe są inwazyjne pomiary ciśnienia krwi/gazometryczne lub wentylacja mechaniczna) lub nawet kombinacje z innymi (inwazyjnymi) metodami, takimi jak rejestracja aktywności neuronalnej za pomocą elektrod kompatybilnych z MR¹⁰ lub badania PET/SPECT⁴;
3. zastosowanie innych metod analizy danych MRI, takich jak metoda „p-block” McKie¹² lub analiza łączności funkcjonalnej¹⁵.

Wybór konkretnych rozwiązań w konfiguracji eksperymentalnej w dużym stopniu zależy od możliwości i doświadczenia dostępnego w laboratorium oraz od rodzaju pytania badawczego, na które chcą Państwo odpowiedzieć.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izofluran	Abbott Laboratories	No B506	Mieszać z powietrzem medycznym
Powietrze medyczne	BOC Healthcare
Mata grzewcza	Harvard Apparatus	507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Ligatura jedwabna	Harvard Apparatus	2-0 black braided silk non-absorbable Nr kat. 51-7631
Kaniula PE-50	Scientific Laboratory Supplies LTD	Portex Tubing PE 0.58x0.96mm	ID 0.58 OD 0.96 mm
Heparyna sodowa	Leo Laboratories	Heparyna sodowa 1000IU/ml	15 U/ml
Klej tkankowy Vetbond	3M	MVetbond Tissue Adhesive
System monitorowania	SA Instruments	http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system	Monitorowanie oddychania i temperatury
Przetwornik ciśnienia	Biopac Systems, Inc.	BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW	Monitorowanie ciśnienia krwi
Analizator gazów krwi RapidLab	Siemens AG	RAPIDLab 248/348 Systems
Skaner zwierzęcy 4.7T	Agilent Technologies		częstotliwość 4.7T 199.845 MHz
Stereotaktyczne podłoże kompatybilne z MR	m2m Imaging Corp	Podłoże dla szczurów: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Cewka	m2m Imaging Corp	Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Wodorochlorek fluoksetyny	Sigma-Aldrich	F-132	5mg/kg w soli fizjologicznej