Opisano metody badania udziału tkanki chłonnej związanej z nosogardłem (NALT) w nosowych i systemicznych odpowiedziach immunologicznych myszy na szczepionki podawane donosowo. Przedstawiamy procedurę chirurgiczną służącą do stworzenia modelu mysiego zależnego od NALT oraz hodowle ex vivo wyizolowanej tkanki NALT.
Artykuł metodologiczny
Badanie roli tkanki limforetykularnej związanej z nosogardzielą (NALT) w odpowiedziach myszy na szczepionki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tkanki limforetykularne związane z nosogardzielą (NALT), występujące u ludzi, gryzoni i innych ssaków, przyczyniają się do odporności w zatokach nosowych1-3. NALT to dwie równoległe struktury w kształcie dzwona, zlokalizowane w przewodach nosowych powyżej podniebienia twardego, zazwyczaj uznawane za wtórne komponenty układu limfatycznego związanego z błonami śluzowymi4-6. W obrębie NALT znajdują się odrębne przedziały limfocytów B i T, przeplatane dendrytycznymi komórkami prezentującymi antygen4,7,8. Komórki te są otoczone warstwą komórek nabłonkowych z przeplatającymi się komórkami M, które odpowiadają za wychwytywanie antygenów z powierzchni błon śluzowych dróg oddechowych9,10. Naiwne limfocyty krążące przez NALT są przygotowane do odpowiedzi na pierwsze spotkania z patogenami układu oddechowego7. Podczas gdy NALT zanikają u ludzi do drugiego roku życia, pierścień Waldeyera i podobnie zbudowane organy limfatyczne utrzymują się przez całe życie6. W przeciwieństwie do ludzi, myszy zachowują NALT przez całe życie, co czyni je wygodnym modelem zwierzęcym do badania odpowiedzi immunologicznych rozpoczynających się w zatokach nosowych11.
Hodowle zawiesin pojedynczych komórek NALT nie są praktyczne ze względu na niską wydajność komórek jednojądrowych. Biologię NALT można jednak badać poprzez hodowlę ex vivo całego narządu, a metoda ta ma dodatkową zaletę w postaci zachowania naturalnej struktury tkanki. W przypadku badań in vivo modele z nokautem genetycznym wykazujące defekty ograniczone do NALT nie są obecnie dostępne ze względu na słabo rozpoznany szlak rozwojowy. Na przykład, choć myszy z nokautem limfotoksyny-α mają zanikłe NALT, w tych genetycznie zmodyfikowanych myszach zmienione są również kępki Peyera, obwodowe węzły chłonne, komórki dendrytyczne pęcherzykowe i inne tkanki limfatyczne12,13. Jako alternatywa dla myszy z nokautem genowym, ablacja chirurgiczna trwale usuwa NALT z dróg nosowych bez wpływu na inne tkanki. Powstały model mysi był wykorzystywany do ustalenia zależności między NALT a odpowiedziami immunologicznymi na szczepionki1,3. Seryjne pobieranie surowicy, śliny, płukanek nosowych i wydzielin z pochwy jest niezbędne do ustalenia podstaw odpowiedzi gospodarza na szczepienie, natomiast odpowiedzi immunologiczne pochodzące bezpośrednio z NALT można potwierdzić za pomocą hodowli tkankowej. Poniższe procedury opisują operacje, hodowlę tkanek i pobieranie próbek niezbędne do zbadania lokalnych i systemowych humoralnych odpowiedzi immunologicznych na szczepienie donosowe (IN).
Protokół
1. Pobieranie i hodowla NALT
- Uśmierć myszy zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. Należy unikać stosowania anestetyków wziewnych, które mogą wpływać na NALT. Przenieś myszy do aseptycznego stanowiska pracy lub komory bezpieczeństwa biologicznego. Usuń dolną szczękę myszy i oczyść obszar podniebienia twardego za pomocą gazików nasączonych alkoholem i jodyną.
- Używając skalpela z ostrzem nr 11 w uchwycie chirurgicznym, ostrożnie przetnij i wyciśnij podniebienie twarde, prowadząc cięcie wzdłuż wewnętrznego obrysu siekaczy i zębów trzonowych myszy.
- Delikatnie odchyl podniebienie pęsetą, uważając, aby go nie przerwać.
- Krok ten jest niezbędny w celu zmniejszenia kontaminacji kultur i jest przeznaczony do przetwarzania wielu próbek podniebienia. Umieść podniebienia w oddzielnych dołkach w pierwszej kolumnie sterylnej płytki 48-dołkowej, uprzednio wypełnionej 250 μL kompletnej pożywki hodowlanej (37 °C), składającej się z RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 μg/mL streptomycyny, 100 UI/mL penicyliny, 50 μg/mL gentamycyny i 1 μg/mL fungizone/amfoterycyny. Pożywka powinna być buforowana węglanami, jeśli podniebienia są hodowane w inkubatorze z 5% CO2/95% wilgotnego powietrza (37 °C), lub alternatywnie należy zastosować 10 mM HEPES pH 7.4 w przypadku hodowli bez CO2.
- Aby wypłukać podniebienia, przenieś je pęsetą do kolejnych dołków w rzędzie, ostrożnie opukując płytkę pomiędzy płukaniami, aż podniebienie zostanie poddane łącznie ośmiu płukaniom.
- Przenieś podniebienia do nowej sterylnej płytki 48-dołkowej zawierającej w dołkach 250 μL świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej (37 °C).
- Umieść płytki z podniebieniami w inkubatorze 37 °C na czas trwania badania.
- Pobieraj próbki do analizy poprzez aseptyczne przeniesienie 100 μL pożywki z dołków hodowlanych do probówek Eppendorf co 24 godziny, zastępując je 100 μL świeżej pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C.
- Wiruj próbki pożywek hodowlanych przy 380 x g przez 10 minut w 4 °C, aby osadzić zanieczyszczenia.
- Przenieś nadsącz z odwirowanej próbki do nowych probówek Eppendorf i przechowuj w -20 °C do momentu analizy.
- Antygenowo specyficzne IgG, IgM i IgA lub wydzielane cytokiny są mierzone w nadsączach z hodowli tkankowych za pomocą standardowych testów immunoenzymatycznych (ELISA).
2. Chirurgiczna ablacja NALT
- Odpowiednimi obiektami badawczymi są samice myszy BALB/c w wieku od 7 do 9 tygodni, choć dopuszczalne są również inne szczepy. Na trzy dni przed operacją należy podawać żelową mokrą karmę, aby przyzwyczaić mysz do zamiennika pokarmu i wody, który będzie podawany po zabiegu.
- Przed operacją należy podać do jamy ustnej jedną kroplę leku przeciwbólowego Metacam (1,5 mg/ml lub 0,05 mg/kropla).
- Myszy należy znieczulić zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC, na przykład mieszanką ketaminy, acepromazyny i ksylazyny (KAX), a na oczy nałożyć maść Puralube Vet, aby zapobiec ich wysychaniu. Należy unikać stosowania anestetyków inhalacyjnych, które mogą wpływać na NALT. Znieczulenie można potwierdzić brakiem reakcji odruchowej na delikatne uciśnięcie palców u stóp.
- Aby zapobiec potencjalnemu odwodnieniu myszy po operacji, należy podskórnie wstrzyknąć 1 mL soli fizjologicznej (0,9% sodium chloride injection USP) między łopatki za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 22-28 G. Należy również podać podskórnie między łopatki 0,1 mL preparatu Respiram za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 22-28 G, aby wspomóc prawidłową czynność oddechową w trakcie i po operacji.
- Podczas wszystkich kolejnych czynności należy zapewnić myszy wsparcie termiczne.
- Znieczuloną mysz należy ułożyć na plecach i za pomocą dwóch oddzielnych pętli nici chirurgicznej wokół górnych i dolnych siekaczy delikatnie rozewrzeć pysk, odsłaniając podniebienie twarde.
- Za pomocą skalpela nr 11 należy wykonać nacięcie o długości około 3 mm wzdłuż linii środkowej podniebienia twardego w miejscu położenia NALT.
- Do nacięcia należy wprowadzić mikrokuretkę o rozmiarze 0,5 mm i delikatnie zeskrobać tkankę pod krawędziami, aby uszkodzić NALT.
- Nacięcie należy przyżegać w celu zatamowania krwawienia, używając prostej, cienkiej pętli w urządzeniu do kauteryzacji termicznej.
- Należy kontynuować wsparcie termiczne, dopóki mysz nie odzyska pełnej świadomości i aktywności.
- W razie potrzeby, aby zapobiec odwodnieniu, należy podawać myszy sól fizjologiczną podskórnie do trzech razy dziennie (1 mL na wstrzyknięcie między łopatki), a raz dziennie przez 3 dni po operacji podawać doustny lek przeciwbólowy. Odwodnienie należy oceniać, wykonując test fałdu skórnego w celu sprawdzenia turgoru skóry. Należy chwycić skórę i futro między łopatkami tak, aby utworzył się fałd. Jeśli skóra szybko wraca do pierwotnej pozycji, mysz nie jest odwodniona. Jeśli skóra pozostaje uniesiona i powoli wraca na miejsce, mysz znajduje się w stanie odwodnienia i wymaga podania soli fizjologicznej. Przez co najmniej trzy dni po operacji należy podawać mokrą karmę, aby zapewnić wystarczający czas na rekonwalescencję.
- Przed przystąpieniem do jakichkolwiek procedur eksperymentalnych należy obserwować myszy przez 8-10 dni, monitorując przyrost masy ciała. Słabe odzyskiwanie masy ciała zazwyczaj wskazuje na niepełne zagojenie podniebienia; takie myszy należy wykluczyć z dalszych badań.
3. Przygotowanie NALT do badania histologicznego i ocena powodzenia operacji NALT
- Powodzenie operacji NALT musi zostać potwierdzone histologicznie zgodnie z poniższym opisem. Po zakończeniu wszystkich badań eksperymentalnych przygotować myszy do pobrania tkanek czaszkowych, przeprowadzając eutanazję zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. Należy unikać stosowania anestetyków wziewnych, które mogą wpływać na NALT.
- Chwycić mysz za kark. Usunąć dolną szczękę z reszty czaszki, przecinając nożyczkami wyrostki kłykowe po obu stronach.
- Zaczynając od karku, usunąć skórę i futro z czaszki, powoli oddzierając i wycinając je w kierunku strony brzusznej czaszki.
- Ostrożnie usunąć skórę wokół obszaru nosa i odciąć skórę z czubka pyska, aby całkowicie ją usunąć.
- Oddzielić czaszkę od kręgów za pomocą nożyczek.
- Wprowadzić nożyczki do foramen magnum i przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej do połowy, aby umożliwić przenikanie formaliny do tkanek miękkich podczas utrwalania.
- Utrwalić czaszkę w 10% neutralnym buforowanym formalinie (NBF) przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
- W celu dekalcyfikacji umieścić próbkę i osobną kasetkę, owiniętą gazą, aby zapobiec stykaniu się Rexynu z kością, w butelce z mieszaniną kwasu mrówkowego. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie płukać stale pod bieżącą wodą przez około 20 minut.
- Przyciąć próbkę do przegrody nosowej i poza oczodołami za pomocą żyletki.
- Próbkę i kasetkę można przechowywać krótkoterminowo w 10% NBF.
- Umieścić próbkę w procesorze tkanek na nocne przetwarzanie. Ma to na celu usunięcie wody z próbki w przygotowaniu do zatapiania w parafinie.
- Wyjąć przetworzoną tkankę, zatopić w bloku parafiny z pyskiem skierowanym w dół i pozostawić do ostygnięcia.
- Wyciąć automatycznym mikrotomem przybliżone przekroje poprzeczne o grubości 15 μm, zbliżając się do przybliżonej lokalizacji NALT, a następnie kontynuować cięcie w sekcjach o grubości 5 μm w celu naniesienia na szkiełka w kąpieli wodnej o temperaturze 44,3 °C.
- Do oceny ablacji NALT należy zastosować barwienie histologiczne hematoksyliną i eozyną (H&E).
4. Pobieranie próbek biologicznych od myszy
4.1 Surowica
- Ostrożne podniesienie temperatury ciała za pomocą lampy grzewczej zwiększy przepływ krwi. Krew należy pobrać, wykonując nacięcie bocznej żyły ogonowej za pomocą skalpela chirurgicznego. Pozostawić krew, aby swobodnie ściekała do probówki Microtainer z separatorem serum.
- Miejsce nacięcia należy lekko ucisnąć materiałem chłonnym, takim jak gaza lub ręcznik, aby zatamować krwawienie.
- Krew pozostawić do skrzepnięcia w probówkach Microtainer na 30 minut, a następnie wirować w zakresie 6-15 x 1 000 g przez co najmniej 90 sekund.
- Oddzielone serum przenieść z probówki Microtainer do czystej probówki Eppendorf w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.
4.2 Ślina
- Trzymając znieczuloną mysz w pozycji pionowej, pipetować 20-30 μL sterylnego roztworu soli fosforanowej (PBS) pomiędzy policzek a linię dziąseł. Zebrać rozcieńczoną ślinę, kierując końcówkę pipety pomiędzy policzek a linię dziąseł.
- Przenieść rozcieńczoną ślinę do nowej probówki zawierającej 10 μL 2x inhibitora proteaz i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4.3 Wydzielina z nosa
- Poddać mysz eutanazji przed pobraniem wydzieliny z nosa, zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. Należy unikać stosowania anestetyków wziewnych, które mogą wpływać na NALT.
- Trzymając mysz w pozycji pionowej, ostrożnie pipetować 30 μL sterylnego PBS do jednego otworu nosowego i zebrać płukanie z drugiego otworu nosowego.
- Przenieść płukanie do nowej probówki zawierającej 10 μL 2x inhibitora proteaz i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4.4 Wydzielina pochwy
- Wprowadź końcówkę mikropipety do otworu sromu u uśpionej myszy, wypłucz pochwę 50 μL sterylnego PBS i pobierz cały płyn za pomocą mikropipety.
- Przenieś płyn z płukania do nowej probówki zawierającej 10 μL inhibitora proteaz 2x i przechowuj w temperaturze -20 °C.
5. Przeciwciała swoiste dla antygenu lub cytokiny w zebranych próbkach można zmierzyć za pomocą metody ELISA lub innej metody ilościowej.
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat etapów przetwarzania tkanki zawierającej NALT do analizy ex vivo. Na Rysunku 2 (A, B) pokazano wielkość podniebienia oraz miejsce nacięcia podczas operacji ablacji (A), oznaczone linią przerywaną. Lokalizacja NALT została wskazana strzałkami w obszarze przedtrzonowców na wyciętym i barwionym hematoksyliną podniebieniu na Rysunku 2 (C), co obrazuje równoległe tkanki.
Rycina 3 przedstawia etapy operacji uszkodzenia NALT, pokazując odsłonięcie podniebienia twardego w celu uzyskania dostępu do NALT (A, B), ablację (C) oraz końcową kauteryzację nacięcia (D). Przekrój poprzeczny obszaru zatok nosowych otaczających NALT przed operacją, wykonany metodą H & E, przedstawiono na Rycini 3E, natomiast obraz uszkodzenia NALT mikrokuretką bezpośrednio po operacji widoczny jest na Rycinie 3F. Po zapewnieniu odpowiedniego czasu na rekonwalescencję pooperacyjną nacięcia powinny być zamknięte, a jama nosowa pozbawiona NALT (Rycina 3G).
Typowe wyniki eksperymentalne uzyskane przy użyciu tych technik przedstawiono na Rysunku 4, porównując nadsączki z hodowli tkankowych i próbki biologiczne z badania nad szczepionką podjednostkową przeciwko gronkowcowi (STEBVax). Myszy otrzymały STEBVax drogą donosową (IN) lub dosytnieniową (IP). Szczepionka została sformułowana z adiuwantem aktywującym szlak receptora Toll-podobnego 43,14, a grupom kontrolnym podano wyłącznie sól fizjologiczną lub szczepionkę bez adiuwantu. Hodowle NALT uzyskane z grup eksperymentalnych wydzielały do pożywki swoiste dla antygenu immunoglobuliny, które można było zmierzyć za pomocą testu ELISA. W tym przykładzie (Rysunek 4A) wyniki wskazują, że największe ilości IgA były uwalniane przez NALT uzyskane od myszy szczepionych donosowo szczepionką podjednostkową w połączeniu z adiuwantem.
Próbki biologiczne (takie jak surowica, ślina, wydzieliny z nosa, wydzieliny z pochwy) pobrane od myszy kontrolnych lub pozbawionych NALT można wykorzystać do profilowania odpowiedzi immunologicznej in vivo na antygeny nosowe w celu porównania z wynikami hodowli tkankowych. Na Rysunku 4B odpowiedzi IgA i IgG na szczepienie donosowe były znacznie obniżone w przypadku braku funkcjonalnej tkanki NALT. Poziomy swoistych dla antygenu IgA były zazwyczaj wyższe niż IgG w wydzielinach błon śluzowych (ślina, płukanie nosa) u myszy zaszczepionych.
Rycina 1. Schemat pobierania NALT i hodowli ex vivo.
Rysunek 2. Wizualizacja podniebienia myszy z zaznaczeniem położenia NALT oraz nacięcia chirurgicznego. Wielkość i lokalizacja górnego podniebienia z nacięciem chirurgicznym zaznaczonym linią przerywaną (A); wycięte górne podniebienie (B) lub barwione hematoksyliną (C) w celu uwidocznienia równoległego NALT w obszarze przedtrzonkowym podniebienia (zbarwione na ciemnofioletowo po stronie przedniej podniebienia). NALT wskazano strzałkami.
Rycina 3. Chirurgiczne przerwanie NALT. Kluczowe etapy operacji przerwania NALT: widok podgrzbietowy podniebienia górnego myszy przed operacją (A); nacięcie w linii środkowej podniebienia górnego w celu uzyskania dostępu do NALT (B); wprowadzenie mikrokyrety przez nacięcie w linii środkowej w celu naruszenia integralności struktury NALT (C); kauteryzacja nacięcia po zakończeniu operacji (D). Obrazy mikroskopowe jam nosowych, barwienie H&E, przed operacją (E); bezpośrednio po operacji (F); oraz mysz z pomyślnie zagojoną raną, pozbawiona NALT (G).
Rycina 4. Przeciwciała specyficzne dla szczepionki z hodowli NALT, śliny i wydzieliny z nosa pobranych od szczepionych myszy. Myszy kontrolne z usuniętą tkanką NALT lub myszy prawidłowe zostały zaszczepione drogą donosową (IN) lub dosytroniczną (IP) STEBVax, a następnie pobrano próbki biologiczne. Poziomy przeciwciał w próbkach wykonanych w trzech powtórzeniach zmierzono za pomocą testu ELISA. (A) Tkankę NALT usunięto z myszy kontrolnych (brak manipulacji chirurgicznych) i poddano hodowli w celu zbadania odpowiedzi przeciwciał. Odpowiedź IgA specyficzna dla szczepionki w hodowli dla myszy szczepionych drogą IN była statystycznie różna od grupy kontrolnej (test t Studenta, p ≤ 0.01, w porównaniu do braku adiuwantu lub braku szczepionki). (B) Usunięcie NALT znacznie zredukowało specyficzne odpowiedzi przeciwciał po szczepieniu drogą IN. Wystąpiły istotne różnice między poziomami specyficznych przeciwciał w grupach NALT- i NALT+ (brak operacji lub operacja kontrolna) we wszystkich porównaniach z wyjątkiem wyników dla IgG w ślinie (test t Studenta, p≤ 0.05).
Dyskusja
Przedstawiliśmy zbiorcze metody opracowania modelu zwierzęcego, pobierania próbek biologicznych oraz testy służące do badania odpowiedzi immunologicznych związanych z NALT1-4. Podczas wykonywania tych metod należy wziąć pod uwagę dodatkowe czynniki. Należy stosować standardowe techniki sterylne podczas operacji i hodowli tkankowej. Ryzyko kontaminacji zostanie zredukowane dzięki zastosowaniu kombinacji środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych podczas izolacji i hodowli, a także poprzez utrzymywanie sterylności narzędzi, obszaru roboczego i zdezynfekowanych płytek. Próbki śliny, płukania nosa i podobne próbki wydzielin śluzowych powinny zostać sprawdzone pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia krwią, ponieważ przeciwciała surowicze występują zazwyczaj w wyższych stężeniach. Ponadto wydzieliny śluzowe powinny być jedynie lekko rozcieńczone do analizy, ponieważ w tych próbkach obecne są niższe stężenia przeciwciał w porównaniu do surowicy.
Myszy muszą być utrzymywane w cieple bezpośrednio po operacji, aby zapobiec potencjalnej hipotermii wywołanej przez znieczulenie. Podczas rekonwalescencji pooperacyjnej należy na zmianę układać odpoczywające myszy na bokach, aby zminimalizować ryzyko nieregularnego oddychania. Procedura chirurgiczna jest bardziej efektywna, gdy zadania te wykonuje trzy osoby: jedna przeprowadzająca operację, jedna pomagająca w utrzymaniu otwartego pyska oraz jedna zapewniająca opiekę pooperacyjną podczas wybudzania się myszy z narkozy.
Po zakończeniu wszystkich procedur eksperymentalnych lub badań konieczne jest przeprowadzenie barwienia H&E przekrojów poprzecznych czaszki, aby zweryfikować powodzenie operacji u każdej myszy. Możliwe wyniki operacji to: całkowita i obustronna ablacja NALT, niepełna ablacja lub nienaruszony NALT. Ponieważ nie wszystkie operacje zakończą się całkowitą utratą NALT, zwierzęta z resztkowym lub nienaruszonym NALT mogą służyć jako kontrole wewnętrzne. Innym potencjalnym wynikiem jest brak całkowitego zagojenia podniebienia, co pozostawia otwór łączący jamę nosową z jamą ustną. Niepełne zagojenie podniebienia spowoduje niską masę ciała i zahamowanie wzrostu, a takie osobniki powinny zostać wykluczone z badań.
Badanie odpowiedzi na szczepionkę w pierwszej kolejności w modelu mysim posłuży do ustalenia roli NALT w zamierzonym wyniku badania (odpowiedź przeciwciał, przeżywalność itp.). Chirurgiczne usunięcie NALT ułatwia określenie wkładu dróg nosowych w odporność miejscową i systemową. Opisane tutaj podejście chirurgiczne jest najbardziej bezpośrednią metodą uzyskania modelu mysiego pozbawionego NALT. Doniesiono, że niektóre wybrane modele myszy z nokautem nie posiadają NALT, jednak zwierzęta te wykazują również niedobory cytokin lub chemokin niezbędnych do rozwoju innych wtórnych tkanek limfatycznych i mogą posiadać dodatkowe wady12,13. Co więcej, metody opisane w niniejszej pracy zostały opracowane w celu zbadania kilku aspektów odpowiedzi immunologicznej powstającej w obrębie jam nosowych. Nasze wyniki eksperymentalne opierają się na badaniach z wykorzystaniem całego podniebienia twardego myszy do hodowli tkankowej, choć możliwe jest zastosowanie przekrojów. Wreszcie, model hodowlany NALT jest użyteczny do przeprowadzania eksperymentów w całości w hodowli tkankowej.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wsparcie zapewniła firma Becton Dickinson Technologies. Poglądy wyrażone w niniejszym opracowaniu są opiniami autorów i nie mają na celu odzwierciedlenia oficjalnej polityki rządu USA. Badania zostały przeprowadzone zgodnie z ustawą Animal Welfare Act oraz innymi federalnymi statutami i przepisami dotyczącymi zwierząt i eksperymentów z udziałem zwierząt, a także zgodnie z zasadami określonymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, 1996. Placówka, w której przeprowadzono te badania, posiada pełną akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylne chirurgiczne ostrza ze stali nierdzewnej, nr 11 | Miltex | 4-311 | |
| Rękojeść skalpela, nr 3 | Miltex | 4-7 | |
| 48-dołkowe płytki do hodowli komórkowej | Costar | 3548 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana ciepłem | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Stężenie końcowe: 10% objętościowo w pośrodku hodowlanym |
| Siarczan streptomycyny | Sigma | S9137 | Stężenie końcowe: 100 μg/mL |
| Penicylina | Sigma | P7794 | Stężenie końcowe: 100 UI/mL |
| Gentamycyna | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Stężenie końcowe: 50 μg/mL |
| Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Stężenie końcowe: 1 μg/mL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Stężenie końcowe: 10 mM |
| Probówki do mikrocentryfugi Eppendorf | Eppendorf | 022364111 | |
| Mokra karma dla myszy Nutra-gel o smaku wiśniowym | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | Jedna kropla zawiesiny doustnej 1,5 mg/mL |
| Ketamina | Pfizer | 00856440301 | Stężenie końcowe: 6,06 mg/mL |
| Acepromazyna | Vedco | VEDC207 | Stężenie końcowe: 0,061 mg/mL |
| Ksylazyna | Lloyd | 4811 | Stężenie końcowe: 0,667 mg/mL |
| Maść weterynaryjna Puralube Vet | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
| 0,9% roztwór wstrzykiwalny chlorku sodu USP | Baxter | 2B1302 | |
| Mikrokureta 0,5 mm | Roboz | RS-6350 | |
| Urządzenie do kauteryzacji termicznej | Geiger | 150-S/150A-S | |
| Końcówka zamienna TCU, pętla prosta, cienka | Geiger | 214 | |
| Nożyczki chirurgiczne | |||
| 10% neutralny bufor formaliny | Sigma | HT501128 | |
| Kwas mrówkowy | Fisher | A119P-4 | Wymieszać 426 mL kwasu mrówkowego z 1047 mL wody z kranu, a następnie dodać 45 mL Rexyn 101 (H) |
| Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
| Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
| Mikrotom obrotowy | Leica | RM2255 | |
| Hematoksylina Mayera | Sigma | MHS16-500ML | |
| Hematoksylina Gilla nr 1 | Sigma | GHS116 | |
| Eozyna B | Sigma | 2853 | |
| Mikroprobówka z separatorem surowicy Microtainer | BD Medical | 365956 | |
| Bufor fosforanowy (PBS) | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 | ||
| Koktajl inhibitorów proteaz, bez EDTA | Thermo Scientific | 78415 |
Bibliografia
- Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes. J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).
- W, A. Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).
- Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue. Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).
- Asanuma, H. Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue. J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).
- Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).
- Debertin, A. S. Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children. Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).
- Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site. J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).
- Zuercher, A. W. Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses. J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).
- Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus. J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).
- Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium. Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).
- Wu, A. W., Russell, M. W. Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system. Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).
- Harmsen, A. Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent. J. Immunol. 168, 986-990 (2002).
- Rangel-Moreno, J. Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue. J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).
- Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome. Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).
Przedruki i uprawnienia
