Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek bezwodnika

Summary

W tym artykule przedstawiono metodę wysokoprzepustową syntezy oligosacharydów i ich przyłączania do powierzchni nanocząstek polibezwodnika do dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Abstract

Transdyscyplinarne podejścia obejmujące takie dziedziny jak projektowanie materiałów, nanotechnologia, chemia i immunologia muszą być wykorzystane do racjonalnego projektowania skutecznych nośników szczepionek. Platformy oparte na nanocząstkach mogą przedłużyć trwałość antygenów szczepionkowych, co może poprawić immunogenność szczepionki¹. Kilka polimerów biodegradowalnych badano jako nośniki szczepionek¹; W szczególności cząsteczki polibezwodnika wykazały zdolność do zapewniania trwałego uwalniania stabilnych antygenów białkowych oraz do aktywacji komórek prezentujących antygen i modulowania odpowiedzi immunologicznej^2-12.

Molekularny projekt tych nośników szczepionek musi uwzględniać racjonalny wybór właściwości polimeru, jak również włączenie odpowiednich środków celujących. Wysokowydajne, zautomatyzowane wytwarzanie ligandów celujących i funkcjonalizowanych cząstek jest potężnym narzędziem, które zwiększy zdolność do badania szerokiego zakresu właściwości i doprowadzi do zaprojektowania powtarzalnych urządzeń do podawania szczepionek.

Wykazano, że dodanie ligandów celujących, które mogą być rozpoznawane przez specyficzne receptory na komórkach odpornościowych, moduluje i dostosowuje odpowiedzi immunologiczne^10,11,13 Receptory lektyny typu C (CLR) są receptorami rozpoznawania wzorców (PRR), które rozpoznają węglowodany obecne na powierzchni patogenów. Stymulacja komórek odpornościowych za pomocą CLR pozwala na zwiększoną internalizację antygenu, a następnie prezentację do dalszej aktywacji limfocytów T^14,15. Dlatego cząsteczki węglowodanów odgrywają ważną rolę w badaniu odpowiedzi immunologicznych; Jednak stosowanie tych biomolekuł często cierpi z powodu braku dostępności strukturalnie dobrze zdefiniowanych i czystych węglowodanów. Platforma automatyzacji oparta na iteracyjnych reakcjach w fazie roztworu może umożliwić szybką i kontrolowaną syntezę tych syntetycznie trudnych cząsteczek przy użyciu znacznie niższych ilości bloków budulcowych niż tradycyjne metody fazy stałej^16,17.

Niniejszym przedstawiamy protokół automatycznej syntezy oligosacharydów w fazie roztworu, takich jak ligandy celujące na bazie mannozy z ekstrakcją fluorową do fazy stałej w celu pośredniego oczyszczania. Po opracowaniu zautomatyzowanych metod wytwarzania środka celującego na bazie węglowodanów, opisujemy metody ich mocowania na powierzchni nanocząstek polibezwodnika za pomocą zautomatyzowanego zestawu robotycznego obsługiwanego przez LabVIEW, jak opisano wcześniej¹⁰. Funkcjonalizacja powierzchni za pomocą węglowodanów wykazała skuteczność w ukierunkowaniu na CLR^10,11 i zwiększeniu przepustowości metody wytwarzania w celu odkrycia złożoności związanej z systemem wieloparametrycznym będzie miało wielką wartość (Rysunek 1a).

Protocol

1. Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów

1. Przed zautomatyzowaną syntezą dimannozydu na stole laboratoryjnym syntetyzuje się odpowiednio chroniony donor cukru, zazwyczaj trichloroacetimidian, oraz akceptor, głównie alkohol alkenylowo-fluorawy.
2. Napisany jest program do automatycznej syntezy dimannozydu. Schematyczne przedstawienie podstawowej procedury automatycznej przedstawiono na rysunku 2. W programie zapewnia się, że przed dodaniem promotora mieszaninę dawcy i akceptora miesza się przez co najmniej 30 minut.
3. Roztwory syntetycznego donora, akceptora i trimetylosililostrifluorometanosulfonianu wytwarza się w dichlorometanie. Toluen i dichlorometan są najczęściej stosowane w reakcjach glikozylacji.
4. Przygotuj również roztwory odczynników do deochrony tymczasowych grup ochronnych w 80% metanolu i 100% metanolu.
5. Przed rozpoczęciem programu należy upewnić się, że wilgotność względna w pomieszczeniu w komorze automatyki wynosi 30% lub mniej. Wysoka wilgotność jest szkodliwa dla reakcji glikozylacji.
6. Po uruchomieniu programu ramię robota przenosi kolejno roztwory dawcy i akceptora do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszaninę miesza się przez 30 minut.
7. Następnie ramię robota przenosi 0,2 do 0,3 ekwiwalentu trimetylosililotrifluorometanosulfonianu do mieszaniny, zwykle w temperaturze pokojowej, chociaż można osiągnąć niższe temperatury, takie jak -20 °C. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 30 minut.
8. Po 30 minutach reakcję zatrzymuje się i usuwa małą porcję w celu monitorowania postępu reakcji. Jeśli reakcja nie zostanie zakończona, może być kontynuowana, a ostatecznie wymagany czas może zostać zmodyfikowany.
9. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną przenosi się do wkładów do ekstrakcji fluorową do fazy stałej (FSPE) zawierających żel krzemionkowy modyfikowany C₈F₁₇ w celu oczyszczenia.
10. Wkłady są najpierw myte 80% mieszaniną metanolu i wody (8 ml), aby pozbyć się frakcji niefluorowej.
11. Następnie wkłady są myte 100% metanolem, aby uzyskać pożądany produkt oznaczony fluorem. Jeśli wymagane jest dodatkowe oczyszczanie, maszynę można zatrzymać, a produkt (produkty) reakcji usunąć w celu oczyszczenia za pomocą dodatkowych środków.
12. Po cyklu oczyszczania ramię robota dozuje metan sodu do fiolki reakcyjnej. Reakcję miesza się przez 2 godziny. Jeśli reakcja nie zostanie zakończona, może być ponownie kontynuowana przez dłuższy czas, a ostatecznie zaprogramowany wymagany czas może zostać zmodyfikowany.
13. Po zakończeniu reakcji produkt jest oczyszczany przez FSPE, a następnie poddawany rozpuszczeniu w bezwodnym toluenie, a następnie odparowywany w celu usunięcia resztek wody.
14. Następnie cykl (od kroku 6 do 13) powtarza się, aż do uzyskania pożądanej długości łańcucha dla cząsteczki docelowej.
15. Chroniony produkt uzyskany w wyniku automatyzacji jest następnie dalej oczyszczany i w pełni charakteryzowany za pomocą technik takich jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Całkowita deprotekcja (usunięcie wszystkich pozostałych grup ochronnych) końcowej cząsteczki docelowej jest następnie z reguły wykonywana poza platformą automatyzacji, ponieważ zwykle obejmuje wybuchowy wodór gazowy i pallad. Ostatni etap deochrony został przeprowadzony na stole poza platformą automatyzacji. Pierwszym etapem była ozonoliza wiązania podwójnego w znaczniku fluorowym, a następnie utlenianie wytworzonego aldehydu do kwasu karboksylowego. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej. Ostatnim etapem była deprotekcja grup eteru benzylowego poprzez uwodornienie katalizowane palladem. Produkt został przepuszczony przez podkładkę celitową w celu pozbycia się palladu, aby uzyskać czysty produkt końcowy.

2. Wysokoprzepustowa funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek

1. Wysokoprzepustowa synteza polimerów i wytwarzanie nanocząstek odbywa się zgodnie z tym samym protokołem i konfiguracją robotyczną opisaną przez Petersena i wsp. ¹⁹. Systemy kopolimerowe stosowane do wytwarzania cząstek oparte są na kwasie sebacynowym (SA) i 1,6-bis(para-karboksyfenoksy)heksanie (CPH) oraz 1,8-bis(para-karboksyfenoksy)-3,6-dioksaoktanie (CPTEG) i CPH. Schematyczne przedstawienie zastosowanego zrobotyzowanego aparatu do osadzania przedstawiono na rysunku 1b.
2. Po wytworzeniu nanocząstek, uchwyt zawierający rurki z biblioteką nanocząstek jest ponownie podłączany do stopnia siłownika liniowego.
3. W celu przyłączenia węglowodanów do powierzchni cząstek polibezwodnika przeprowadza się reakcję sprzęgania aminowo-karboksylową ²⁰ składającą się z dwóch następujących po sobie reakcji.
4. W pierwszej reakcji strzykawkę w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej napełnia się 10 równoważnikami (równaniami) (odpowiednikami średniego molowego stężenia kwasu karboksylowego na powierzchni cząstek) chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodimidu (EDC) i 10 etylenodiaminy w roztworze wodnym, podczas gdy strzykawkę w drugiej programowalnej pompie strzykawkowej napełnia się 12 eq. N-hydroksysukcynimidu (NHS) w roztworze wodnym.
5. Za pomocą programu LabVIEW zawiesiny odczynników są deponowane w bibliotece nanocząstek*.
6. Następnie każda próbka jest poddawana sonikacji (30 s przy 40 Hz), a uchwyt probówki jest odłączany od platformy robotycznej.
7. Zawiesiny nanocząstek inkubuje się przez 9 godzin** ze stałą rotacją w temperaturze 4 °C.
8. Po upływie czasu reakcji probówki są odwirowywane (12000 x g przez 5 min) i zawracane do stanowiska zrobotyzowanego w celu wykonania dwóch etapów mycia.
9. Do mycia strzykawka pozostaje pusta i załadowana do pierwszej programowalnej pompy strzykawkowej, podczas gdy strzykawka w drugiej pompie strzykawkowej jest napełniana zimną wodą. Supernatant z każdej probówki jest pobierany do pustej strzykawki, a druga pompa osadza zimną wodę.
10. Homogenizację zawiesiny nanocząstek przeprowadza się zgodnie z opisem w kroku 2.6. Probówki są następnie odwirowywane (12000 x g przez 5 minut) i przeprowadza się drugi etap płukania zgodnie z opisem w kroku 2.9.
11. W drugiej reakcji stosuje się dwa etapy osadzania. W pierwszym etapie osadzania 12 eq. EDC jest ładowanych jedną pompą, a 12 eq. NHS jest ładowanych drugą pompą.
12. Drugi etap osadzania obejmuje 10 eq określonego sacharydu na pierwszej i drugiej pompie (tj. galaktozy, laktozy lub di-mannozy)*** oraz trzecie pompowanie z 10 eq kwasu glikolowego (stosowanego jako kontrola****).
13. Zawiesiny nanocząstek homogenizuje się w sposób opisany w kroku 2.6 i inkubuje przez 9 godzin ze stałą rotacją w temperaturze 4 °C.
14. Po zakończeniu czasu reakcji przeprowadza się etap płukania zgodnie z opisem w krokach 2.8, 2.9 i 2.10.
15. Funkcjonalizowaną bibliotekę nanocząstek umieszcza się następnie w komorze próżniowej do wyschnięcia na co najmniej 2 godziny.
16. Funkcjonalizowane nanocząstki są następnie charakteryzowane za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów i wysokoprzepustowego testu fenolowo-siarkowego w celu określenia odpowiednio składu powierzchni i stężenia sacharydu. Skaningowa mikroskopia elektronowa i dynamiczne rozpraszanie światła są wykorzystywane do określania wielkości cząstek, rozkładu wielkości i ładunku powierzchniowego.

Uwagi: *Objętości osadzania różnią się w zależności od masy nanocząsteczek zawartych w każdej probówce.
**Czas reakcji dla pierwszej i drugiej reakcji można zmienić, aby dostosować końcowe stężenie sacharydu.
Każdy sacharyd jest umieszczany w probówkach w zależności od pożądanej grupy.
W specyficznej reakcji zastosowanej w tym badaniu do przyłączania węglowodanów, kwas glikolowy jest stosowany jako kontrola łącznika, ponieważ odchronione sacharydy mają już tę cząsteczkę kowalencyjnie połączoną, co pozwala na dalsze przyłączanie do powierzchni nanocząstek.

3. Reprezentatywne wyniki

W pełni chroniony dimannozyd pokazany na rysunku 2 został zsyntetyzowany przy użyciu platformy automatyzacji. Zsyntetyzowany związek scharakteryzowano ^{za pomocą 1}H NMR w spektrometrze VXR 400 MHz z użyciem CDCl₃ jako rozpuszczalnika. Widmo NMR pokazano na rysunku 3.

Wykorzystując opisaną tutaj wysokoprzepustowość wytwarzania nanocząsteczek nanocząstek polibezwodnika, pomyślnie przeprowadzono przyłączanie dimannozy, laktozy i galaktozy ^{10, 11}. Korzystając z tej konfiguracji, zidentyfikowano optymalne warunki reakcji (tj. temperaturę i czas reakcji) w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalizacji i morfologii nanocząstek. Gdy reakcję przeprowadzono w temperaturze 4 °C zamiast w temperaturze pokojowej, za pomocą SEM zaobserwowano zmniejszenie agregacji nanocząstek (dane nie pokazano). W tabeli 1 przedstawiono reprezentatywne wyniki charakterystyki funkcjonalizowanych nanocząstek 50:50 CPTEG:CPH z di-mannozą lub laktozą, syntetyzowanych w temperaturze 4 °C. Dane wskazują na niewielki wzrost średniej średnicy nanocząstek ze względu na funkcjonalizację. Podczas gdy niefunkcjonalizowane nanocząstki miały ujemny potencjał zeta wynoszący ok. -20 mV, funkcjonalizowane cząstki wykazywały dodatnią wartość potencjału zeta, wykazując udaną funkcjonalizację powierzchni nanocząstki. Laktoza i dimannoza są cukrami neutralnymi; Jednak wolne grupy aminowe z łącznika etylenodiaminy wykorzystywanego do przyłączania sacharydów mogą być odpowiedzialne za dodatni potencjał zeta.

Czas reakcji to kolejna zmienna, która może wpływać zarówno na końcową morfologię nanocząstek, jak i na osiągnięty stopień przyłączenia cukru. Dostosowując czas reakcji, końcowe stężenie cukru przyczepione do powierzchni nanocząstek można kontrolować, jak pokazano na rysunku 4A. Zgodnie z oczekiwaniami stężenie dimannozy na powierzchni nanocząstek CPTEG:CPH w proporcji 50:50 wzrastało wraz z całkowitym czasem reakcji i osiągnęło maksimum po 18 godzinach. Nanocząstki funkcjonalizowane z całkowitym czasem reakcji wynoszącym 24 godziny wykorzystano do oceny ich zdolności do celowania w CLR na komórkach dendrytycznych (DC) pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Cytometrię przepływową zastosowano do oceny ekspresji dwóch receptorów CL (tj. CIRE (CD209, DC-SIGN) i receptora mannozy (CD206)) po stymulacji niefunkcjonalizowanymi nanocząstkami oraz nanocząstkami funkcjonalizowanymi laktozą i di-mannozą (Figura 4B). Wyższą ekspresję obu receptorów, która wskazuje na skuteczne celowanie, uzyskano, gdy komórki stymulowano zarówno nanocząstkami funkcjonalizowanymi laktozą, jak i di-mannozą. Jednak cząstki funkcjonalizowane di-mannozą wykazywały wyższy poziom ekspresji, co wskazuje na specyficzność tego liganda dla badanych receptorów.

Rodzaj nanocząstek Średnia średnica cząstek (nm) Średni potencjał ζ cząstek (mV) Niefunkcjonalizowane 162 ± 43 -20 ± 0,6 laktoza 235 ± 34 26 ± 2.4 Di-mannoza 243 ± 32 30 ± 4,2

Tabela 1. Charakterystyka nanocząstek. Niefunkcjonalizowane i sfunkcjonalizowane charakteryzowały się quasi-elastycznym rozpraszaniem światła i pomiarami potencjału zeta. Dane dotyczące wielkości cząstek reprezentują średnią wartość ±odchylenia standardowego (SD) danych dotyczących dynamicznego rozpraszania światła zebranych w trzech niezależnych eksperymentach. Dane dotyczące potencjału Zeta reprezentują średnią wartość ± SD z trzech niezależnych odczytów. Zmiana znaku potencjału zeta pokazuje, że cukier był efektywnie sprzężony z powierzchnią nanocząstek 50:50 CPTEG:CPH.

Rysunek 1. (A) Graficzne przedstawienie podejścia stosowanego w zakresie funkcjonalizacji węglowodanów nanocząstek polibezwodnika oraz przykład funkcjonalizowanych bibliotek nanocząstek, które można zaprojektować przy użyciu opisanego podejścia wysokoprzepustowego. (B) Schematyczne przedstawienie zautomatyzowanego aparatu do osadzania wykorzystywanego do funkcjonalizacji cząstek, który składa się z (i) trzech pomp NE 1000; (ii) stopień robotyczny zintegrowany z dwoma siłownikami (Zaber): jeden do ruchu w kierunku x, a drugi do ruchu w kierunku y; (iii) drugi stopień robotyczny z dwoma przylegającymi do siebie stojakami (odpowiednimi dla probówek i kuwet) składającymi się z trzech siłowników, po jednym dla każdego kierunku (x, y i z). Pompy i łącznie pięć siłowników są połączone szeregowo. Siłowniki i pompy obsługiwane są przez komputer za pomocą oprogramowania LabVIEW. Ten diagram nie jest skalowalny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Graficzne przedstawienie automatycznej iteracyjnej syntezy węglowodanów na przykładzie mannozy.

Rysunek 3. ¹H NMR chronionego dimannozydu.

Rysunek 4. oraz Wpływ czasu reakcji na stężenie powierzchniowe nanocząstek sacharydu. W przedstawionych danych nanocząstki CPTEG:CPH w proporcji 50:50 funkcjonalizowano dimannozą w różnych czasach reakcji, a reakcję prowadzono w temperaturze 4 °C. Pokazano błąd średni i standardowy dwóch niezależnych eksperymentów funkcjonalizacji. (B) Nanocząstki funkcjonalizowane laktozą i di-mannozą skutecznie celują w DC-SIGN (CIRE, CD209) i receptor mannozy (CD206) na komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego, jak wykazano przez zwiększoną ekspresję tych dwóch markerów po stymulacji funkcjonalizowanymi nanocząstkami 50:50 CPTEG: CPH w porównaniu z ekspresją uzyskaną z niefunkcjonalizowanymi cząstkami.

Discussion

Skuteczność węglowodanów jako czynników docelowych w celu kierowania interakcji nanocząstek do komórek odpornościowych została już wcześniej wykazana ^{10, 11}. Wcześniejsze badania w naszych laboratoriach wykazały, że określone cukry przyłączone do nanocząstek polibezwodnika są w stanie celować w różne CLR na komórkach prezentujących antygen (APC), zwiększając w ten sposób aktywację komórek odpornościowych, co może być ważne dla dalszej aktywacji limfocytów T ^{10, 11}. Jednak, aby osiągnąć optymalne uki...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zmotoryzowany stolik XYZ: 3x T-LSM050A, skok 50 mm na oś	Zaber Technologies	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 Pojedyncza pompa strzykawkowa	New Era Systemy pomp	NE-1000
Pyrex* Vista* Bezkołnierzowe szklane probówki hodowlane wielokrotnego użytku	Corning	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed Technologies
LabVIEW	National Instrumenty	776671-35
SGE Strzykawki gazoszczelne, Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
XL-2000 Sonicator	Qsonica	Q55
Rotator mini-rurkowy	Fisher Scientific	05-450-127