Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Podsumowanie

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Streszczenie

W celu racjonalnego projektowania skutecznych nośników szczepionek konieczne jest zastosowanie podejść transdyscyplinarnych, obejmujących takie dziedziny jak projektowanie materiałów, nanotechnologia, chemia i immunologia. Platformy oparte na nanocząsteczkach mogą przedłużać obecność antygenów szczepionkowych, co może poprawić immunogenność szczepionki¹. Badano szereg polimerów biodegradowalnych jako nośniki do dostarczania szczepionek¹; w szczególności cząstki polianhydrydowe wykazały zdolność do zapewnienia przedłużonego uwalniania stabilnych antygenów białkowych oraz do aktywacji komórek prezentujących antygen i modulowania odpowiedzi immunologicznej^2-12.

Projekt molekularny tych nośników szczepionek musi integrować racjonalny dobór właściwości polimerów oraz włączenie odpowiednich czynników celujących. Wysokoprzepustowa zautomatyzowana synteza ligandów celujących i funkcjonalizowanych cząsteczek jest potężnym narzędziem, które zwiększy możliwość badania szerokiego zakresu właściwości i doprowadzi do opracowania powtarzalnych urządzeń do dostarczania szczepionek.

Wykazano, że dodanie ligandów celujących, zdolnych do bycia rozpoznawanymi przez specyficzne receptory na komórkach odpornościowych, pozwala na modulowanie i dostosowywanie odpowiedzi immunologicznych^10,11,13. Receptory lektynowe typu C (CLRs) są receptorami rozpoznającymi wzorce (PRRs), które rozpoznają węglowodany obecne na powierzchni patogenów. Stymulacja komórek odpornościowych za pośrednictwem CLRs umożliwia zwiększoną internalizację antygenu i jego późniejszą prezentację w celu dalszej aktywacji limfocytów T^14,15. W związku z tym cząsteczki węglowodanowe odgrywają istotną rolę w badaniu odpowiedzi immunologicznych; jednakże zastosowanie tych biomolekuł często utrudnia brak dostępności strukturalnie dobrze zdefiniowanych i czystych węglowodanów. Platforma automatyzacyjna oparta na iteracyjnych reakcjach w fazie ciekłej może umożliwić szybką i kontrolowaną syntezę tych trudnych syntetycznie cząsteczek przy użyciu znacznie mniejszych ilości bloków budulcowych niż tradycyjne metody w fazie stałej^16,17.

W niniejszym pracy przedstawiamy protokół zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów w fazie ciekłej, takich jak ligandów celujących opartych na mannozie, z wykorzystaniem fluoryzowanej ekstrakcji w fazie stałej do oczyszczania produktów pośrednich. Po opracowaniu zautomatyzowanych metod otrzymywania czynnika celującego opartego na węglowodanach, opisujemy metody ich przytwierdzania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydowych przy użyciu zautomatyzowanego zestawu robotycznego sterowanego programem LabVIEW, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰. Funkcjonalizacja powierzchni węglowodanami wykazała skuteczność w celowaniu w CLR^10,11, a zwiększenie wydajności metody wytwarzania w celu odkrycia złożoności związanych z systemem wieloparametrycznym będzie miało dużą wartość (Rycyna 1a).

Protokół

1. Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów

1. Przed automatyczną syntezą dimannosydy, na stanowisku laboratoryjnym syntetyzuje się odpowiednio chronionego donora cukru, zazwyczaj trichloroacetymidyanu, oraz akceptora, głównie alkenylowego alkoholu fluorowego.
2. Tworzony jest program dla automatycznej syntezy dimannosydy. Schematyczna reprezentacja podstawowej procedury automatycznej przedstawiona jest na Rysunku 2. W programie zapewnia się, aby przed dodaniem promotora mieszanina donora i akceptora była mieszana przez co najmniej 30 min.
3. Roztwory syntetycznego donora, akceptora oraz trifluorometanosulfonianu trimetylosililu przygotowuje się w dichlorometanie. Do reakcji glikozylacji najczęściej stosuje się toluen i dichlorometan.
4. Należy również przygotować roztwory odczynników do usuwania tymczasowych grup ochronnych w 80% metanolu i 100% metanolu.
5. Przed uruchomieniem programu należy upewnić się, że wilgotność względna w pomieszczeniu w komorze automatyzacji wynosi 30% lub mniej. Wysoka wilgotność jest niekorzystna dla reakcji glikozylacji.
6. Po uruchomieniu programu ramię robotyczne sekwencyjnie przenosi roztwory donora i akceptora do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszanina jest mieszana przez 30 min.
7. Następnie ramię robotyczne przenosi od 0,2 do 0,3 ekwiwalentów trifluorometanosulfonianu trimetylosililu do mieszaniny, zazwyczaj w temperaturze pokojowej, choć można osiągnąć niższe temperatury, np. -20 °C. Mieszanina reakcyjna jest mieszana przez 30 min.
8. Po 30 min reakcję zatrzymuje się i pobiera niewielką alikwotę w celu monitorowania postępu reakcji. Jeśli reakcja nie dobiegła końca, można ją kontynuować, a ostatecznie zmodyfikować wymagany czas.
9. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną przenosi się do kartridży do fluorowej ekstrakcji w fazie stałej (FSPE) zawierających żel krzemionkowy modyfikowany C₈F₁₇ w celu oczyszczania.
10. Kartridże są najpierw płukane 80% mieszaniną metanol-woda (8 mL), aby usunąć frakcję niefluorową.
11. Następnie kartridże płucze się 100% metanolem, aby uzyskać pożądany produkt z etykietą fluorową. Jeśli wymagane jest dodatkowe oczyszczanie, można zatrzymać urządzenie i usunąć produkt(y) reakcji w celu oczyszczenia innymi metodami.
12. Po cyklu oczyszczania ramię robotyczne dozuje metanolan sodu do fiolki reakcyjnej. Reakcję miesza się przez 2 hr. Jeśli reakcja nie dobiegła końca, można ją ponownie kontynuować przez dłuższy czas, a ostatecznie zmodyfikować zaprogramowany czas wymagany.
13. Po zakończeniu reakcji produkt jest oczyszczany metodą FSPE, a następnie rozpuszczany w bezwodnym toluenie, po czym następuje odparowanie w celu usunięcia resztkowej wody.
14. Następnie cykl (od kroku 6 do 13) powtarza się do momentu uzyskania pożądanej długości łańcucha dla cząsteczki docelowej.
15. Produkt chroniony otrzymany z automatyzacji jest następnie dalej oczyszczany i w pełni charakteryzowany za pomocą technik takich jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Całkowite usunięcie grup ochronnych (usunięcie wszystkich pozostałych grup ochronnych) z końcowej cząsteczki docelowej jest zazwyczaj przeprowadzane poza platformą automatyzacji, ponieważ zwykle wiąże się to z użyciem wybuchowego wodoru i palladu. Końcowy etap deprotekcji przeprowadzono na stanowisku laboratoryjnym poza platformą automatyzacji. Pierwszym krokiem była ozonoliza wiązania podwójnego w etykiecie fluorowej, a następnie utlenianie powstałego aldehydu do kwasu karboksylowego. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej. Ostatnim etapem była deprotekcja grup eteru benzylowego poprzez uwodornienie katalityczne z użyciem palladu. Produkt przepuszczono przez warstwę celitu, aby usunąć pallad i otrzymać czysty produkt końcowy.

2. Wysokoprzepustowa funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek

1. Wysokoprzepustowa synteza polimerów i wytwarzanie nanocząsteczek są przeprowadzane zgodnie z tym samym protokołem i konfiguracją robotyczną, którą opisali Petersen et al¹⁹. Systemy kopolimerowe wykorzystane do wytwarzania cząsteczek opierają się na kwasie sebacynowym (SA) i 1,6-bis(para-karboksyfenoksy)heksanie (CPH), oraz 1,8-bis(para-karboksyfenoksy)-3,6-dioksaoctanie (CPTEG) i CPH. Schematyczne przedstawienie wykorzystanego aparatu do robotycznego nanoszenia reagentów zaprezentowano na Rysunku 1b.
2. Po wytworzeniu nanocząsteczek uchwyt zawierający probówki z biblioteką nanocząsteczek zostaje ponownie zamocowany na stopnicy aktuatora liniowego.
3. W celu przyłączenia węglowodanów do powierzchni cząsteczek polianhydrydu przeprowadza się reakcję sprzęgania aminy z kwasem karboksylowym ²⁰, składającą się z dwóch następujących po sobie etapów.
4. W pierwszej reakcji strzykawkę w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej napełnia się 10 ekwiwalentami (eq.) (ekwiwalenty średniego molowego stężenia kwasu karboksylowego na powierzchni cząsteczek) chlorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropyl)-karbodiimidu (EDC) oraz 10 eq. etylenodiaminy w roztworze wodnym, natomiast strzykawkę w drugiej programowalnej pompie strzykawkowej ładuje się 12 eq. N-hydroksysukcynimidu (NHS) w roztworze wodnym.
5. Za pomocą programu LabVIEW zawiesiny reagentów są nanoszone do biblioteki nanocząsteczek*.
6. Następnie każdą próbkę poddaje się sonikacji (30 s przy 40 Hz), a uchwyt do probówek zostaje odłączony od platformy robotycznej.
7. Zawiesiny nanocząsteczek są inkubowane przez 9 h** przy stałym obrocie w temperaturze 4 °C.
8. Po zakończeniu czasu reakcji probówki są wirowane (12000 x g przez 5 min) i zwracane do stacji robotycznej w celu przeprowadzenia dwóch etapów płukania.
9. Do płukania jedna strzykawka pozostaje pusta i załadowana w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej, podczas gdy strzykawka w drugiej pompie jest napełniona zimną wodą. Nadpływ z każdej probówki jest odsysany do pustej strzykawki, a druga pompa nanosi zimną wodę.
10. Homogenizację zawiesiny nanocząsteczek przeprowadza się zgodnie z opisem w kroku 2.6. Następnie probówki są wirowane (12000 x g przez 5 min) i przeprowadzany jest drugi etap płukania zgodnie z opisem w kroku 2.9.
11. W drugiej reakcji stosuje się dwa etapy nanoszenia. W pierwszym etapie nanoszenia jedna pompa ładuje 12 eq. EDC, a druga pompa ładuje 12 eq. NHS.
12. Drugi etap nanoszenia obejmuje 10 eq. konkretnego sacharydu w pierwszej i drugiej pompie (tj. galaktozy, laktozy lub di-mannozy)*** oraz trzecią pompę z 10 eq. kwasu glikolowego (użytego jako kontrola****).
13. Zawiesiny nanocząsteczek są homogenizowane zgodnie z opisem w kroku 2.6 i inkubowane przez 9 h przy stałym obrocie w temperaturze 4 °C.
14. Po zakończeniu czasu reakcji przeprowadza się etap płukania zgodnie z opisem w krokach 2.8, 2.9 i 2.10.
15. Funkcjonalizowana biblioteka nanocząsteczek jest następnie umieszczana w komorze próżniowej w celu osuszenia przez co najmniej 2 h.
16. Funkcjonalizowane nanocząsteczkami są następnie charakteryzowane za pomocą spektroskopii fotoelektronów w promieniach X oraz wysokoprzepustowego testu kwasu fenolo-siarkowego w celu oznaczenia odpowiednio składu powierzchniowego i stężenia sacharydu. Skaningowa mikroskopia elektronowa oraz dynamiczne rozpraszanie światła są wykorzystywane do określenia wielkości cząsteczek, rozkładu wielkości i ładunku powierzchniowego.

Uwagi: *Objętości osadzania różnią się w zależności od masy nanocząstek zawartych w każdej probówce.
**Czas trwania pierwszej i drugiej reakcji może zostać zmieniony w celu dostosowania końcowego stężenia sacharydów.
***Każdy sacharyd jest nanoszony do probówek w zależności od pożądanej grupy.
****W przypadku konkretnej reakcji zastosowanej w niniejszym badaniu do przyłączania węglowodanów, kwas glikolowy służy jako kontrola łącznika, ponieważ odchronione sacharydy mają już kowalencyjnie związaną tę cząsteczkę, co umożliwia dalsze przyłączenie do powierzchni nanocząstek.

3. Reprezentatywne wyniki

W pełni chroniony dimannozyd przedstawiony na Rysunku 2 został zsyntetyzowany z wykorzystaniem platformy automatycznej. Zsyntetyzowany związek scharakteryzowano za pomocą ¹H NMR w spektrometrze VXR 400 MHz, używając CDCl₃ jako rozpuszczalnika. Widmo NMR przedstawiono na Rysunku 3.

Wykorzystując opisaną tutaj wysokoprzepustową metodę wytwarzania i funkcjonalizacji nanocząsteczek polianhydrydu, pomyślnie przeprowadzono przyłączenie dimannozy, laktozy i galaktozy ^{10, 11}. Przy użyciu tej konfiguracji zidentyfikowano optymalne warunki reakcji (tj. temperaturę i czas reakcji), aby uzyskać pożądaną funkcjonalizację i morfologię nanocząsteczek. Gdy reakcję prowadzono w 4 °C zamiast w temperaturze pokojowej, w badaniu SEM zaobserwowano zmniejszenie agregacji nanocząsteczek (dane nie przedstawiono). Tabela 1 przedstawia reprezentatywne wyniki charakterystyki funkcjonalizowanych nanocząsteczek 50:50 CPTEG:CPH z dimannozą lub laktozą, syntetyzowanych w 4 °C. Dane wskazują na niewielki wzrost średnicy nanocząsteczek wynikający z funkcjonalizacji. Podczas gdy nanocząsteczki niefunkcjonalizowane miały ujemny potencjał zeta wynoszący ok. -20 mV, cząsteczki funkcjonalizowane wykazały dodatnią wartość potencjału zeta, co świadczy o pomyślnej funkcjonalizacji powierzchni nanocząsteczek. Laktoza i dimannoza są cukrami obojętnymi; jednak za dodatni potencjał zeta mogą odpowiadać wolne grupy aminowe z łącznika etylenodiaminowego wykorzystanego do przyłączenia cukrów.

Czas reakcji jest kolejną zmienną, która może wpływać zarówno na końcową morfologię nanocząsteczek, jak i na uzyskany stopień przyłączania cukrów. Poprzez regulację czasu reakcji można kontrolować końcowe stężenie cukru przyłączonego do powierzchni nanocząsteczek, co przedstawiono na Rysunku 4A. Zgodnie z oczekiwaniami, stężenie dimannozy na powierzchni nanocząsteczek CPTEG:CPH w stosunku 50:50 wzrastało wraz z całkowitym czasem reakcji i osiągnęło maksimum po 18 hr. Nanocząsteczki funkcjonalizowane przy całkowitym czasie reakcji 24 hr zostały wykorzystane do oceny ich zdolności do celowania w receptory CLR na komórkach dendrytycznych (DCs) pochodzących z szpiku kostnego myszy. Do oceny ekspresji dwóch receptorów CL (tj. CIRE (CD209, DC-SIGN) oraz receptora mannozowego (CD206)) po stymulacji nanocząsteczkami niefunkcjonalizowanymi oraz funkcjonalizowanymi laktozą i dimannozą wykorzystano cytometrię przepływową (Rysunek 4B). Wyższą ekspresję obu receptorów, co świadczy o skutecznym celowaniu, uzyskano w przypadku stymulacji komórek nanocząsteczkami funkcjonalizowanymi zarówno laktozą, jak i dimannozą. Jednakże cząsteczki funkcjonalizowane dimannozą wykazały wyższy poziom ekspresji, co wskazuje na specyficzność tego ligandu względem badanych receptorów.

Typ nanocząsteczek	Średnica średnia cząsteczek (nm)	Średni potencjał ζ cząsteczek (mV)
Niefunkcjonalizowane	162 ± 43	-20 ± 0.6
Laktoza	235 ± 34	26 ± 2.4
Di-mannoza	243 ± 32	30 ± 4.2

Tabela 1. Charakterystyka nanocząsteczek. Nanocząsteczki niefunkcjonalizowane oraz funkcjonalizowane poddano charakterystyce za pomocą quasi-elastycznego rozpraszania światła oraz pomiarów potencjału zeta. Dane dotyczące wielkości cząstek reprezentują wartość średnią ± odchylenie standardowe (SD) danych z dynamicznego rozpraszania światła zebranych w trzech niezależnych eksperymentach. Dane dotyczące potencjału zeta reprezentują wartość średnią ± SD z trzech niezależnych pomiarów. Zmiana znaku potencjału zeta wykazuje, że cukier został efektywnie sprzężony z powierzchnią nanocząsteczek 50:50 CPTEG:CPH.

Rycina 1. (A) Graficzna reprezentacja podejścia polegającego na funkcjonalizacji nanocząstek polianhydrydu węglowodanami oraz przykład bibliotek funkcjonalizowanych nanocząstek, które można zaprojektować przy użyciu opisanego podejścia wysokoprzepustowego. (B) Schematyczne przedstawienie zautomatyzowanego aparatu do nanoszenia wykorzystywanego do funkcjonalizacji cząstek, który składa się z (i) trzech pomp NE 1000; (ii) stołu robotycznego zintegrowanego z dwoma siłownikami (Zaber): jednym do ruchu w kierunku x i drugim do ruchu w kierunku y; (iii) drugiego stołu robotycznego z dwoma sąsiadującymi statywami (odpowiednimi dla probówek i kuwet) składającego się z trzech siłowników, po jednym dla każdego kierunku (x, y i z). Pompy i łącznie pięć siłowników są połączone szeregowo. Siłownikami i pompami steruje komputer za pomocą oprogramowania LabVIEW. Schemat nie jest narysowany w skali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 2. Schematyczna reprezentacja zautomatyzowanej syntezy iteracyjnej węglowodanów na przykładzie mannozy.

Rycina 3. ¹H NMR chronionego dimannosydy.

Rysunek 4. (A) Wpływ czasu reakcji na stężenie sacharydu na powierzchni nanocząsteczek. Przedstawione dane dotyczą nanocząsteczek 50:50 CPTEG:CPH funkcjonalizowanych dimannozą w różnych odstępach czasu, przy czym reakcję przeprowadzono w temperaturze 4 °C. Przedstawiono średnią oraz błąd standardowy z dwóch niezależnych eksperymentów funkcjonalizacji. (B) Nanocząsteczki funkcjonalizowane laktozą i dimannozą skutecznie celują w DC-SIGN (CIRE, CD209) oraz receptor mannozy (CD206) w komórkach dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, co wykazano poprzez zwiększoną ekspresję tych dwóch markerów po stymulacji funkcjonalizowanymi nanocząsteczkami 50:50 CPTEG:CPH w porównaniu z ekspresją uzyskaną przy użyciu cząsteczek niefunkcjonalizowanych.

Dyskusja

Skuteczność węglowodanów jako czynników celujących, kierujących oddziaływania nanocząstek do komórek odpornościowych, została wykazana we wcześniejszych badaniach ^{10, 11}. Poprzednie badania w naszych laboratoriach wykazały, że specyficzne cukry przyłączone do nanocząstek polianhydrydowych są w stanie celować w różne receptory lektynowe (CLR) na komórkach prezentujących antygen (APC), zwiększając tym samym aktywację komórek odpornościowych, co może mieć istotne znaczenie dla dalszej aktywacji limfocytów T ^...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmotoryzowany stół XYZ: 3x T-LSM050A, zakres ruchu 50 mm na oś	Zaber Technologies	T-XYZ-LSM050A-KT04
Jednopompowa pompa strzykawkowa NE-1000	New Era Pump Systems	NE-1000
Wielorazowe szklane probówki do hodowli Pyrex* Vista* bez kołnierza	Corning	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed Technologies
LabVIEW	National Instruments	776671-35
Strzykawki gazoszczelne SGE, Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
Sonikator XL-2000	Qsonica	Q55
Rotator do mini-probówek	Fisher Scientific	05-450-127