Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Podsumowanie

Nanocząstki, takie jak półprzewodnikowe kropki kwantowe (QDs), mogą być wykorzystywane do tworzenia agentów fotoaktywowalnych w zastosowaniach przeciwdrobnoustrojowych lub przeciwnowotworowych. Niniejsza technika przedstawia sposób nadawania rozpuszczalności w wodzie kropkom kwantowym z tellurku kadmu (CdTe), ich sprzęganie z antybiotykiem oraz przeprowadzanie testu inhibicji bakteryjnej w oparciu o krzywe wzrostu i liczenie kolonii na płytkach.

Streszczenie

Kropki kwantowe (QDs) to fluorescencyjne nanocząstki półprzewodnikowe o widmach emisji zależnych od rozmiaru, które mogą być pobudzane szerokim zakresem długości fal. Ze względu na swoją jasną i stabilną fluorescencję, QDs wzbudziły duże zainteresowanie w obszarze obrazowania, diagnostyki i terapii^{1,2 3,4,5}. QDs mogą być konjugowane z różnymi cząsteczkami biologicznie aktywnymi w celu wiązania z bakteriami i komórkami ssaków⁶.

Kropki kwantowe (QDs) są również szeroko badane jako czynniki cytotoksyczne do ukierunkowanego zwalczania bakterii. Pojawianie się wielolekoopornych szczepów bakteryjnych szybko staje się kryzysem zdrowia publicznego, szczególnie w przypadku patogenów Gram-ujemnych ⁷. Ze względu na dobrze znany efekt przeciwdrobnoustrojowy niektórych nanomateriałów, zwłaszcza Ag, istnieje setki badań analizujących toksyczność nanocząstek wobec bakterii ⁸. Badania bakteriologiczne przeprowadzono również z zastosowaniem innych rodzajów półprzewodnikowych nanocząstek, zwłaszcza TiO₂ ^9,10-11, ale także ZnO¹² i innych, w tym CuO ¹³. W badaniach tych przeprowadzono niektóre porównania szczepów bakteryjnych, zazwyczaj zestawiając szczep Gram-ujemny ze szczepem Gram-dodatnim. W przypadku wszystkich tych cząstek mechanizmy toksyczności przypisuje się utlenianiu: albo fotogenerowaniu reaktywnych form tlenu (ROS) przez cząstki, albo bezpośredniemu uwalnianiu jonów metali, które mogą powodować toksyczność oksydacyjną. Nawet w odniesieniu do tych materiałów wyniki różnych badań znacznie się różnią. W niektórych opracowaniach zgłaszano, że badany szczep Gram-dodatni jest bardziej wrażliwy niż Gram-ujemny ¹⁰; w innych obserwowano sytuację odwrotną ¹⁴. Badania te zostały szczegółowo omówione w przeglądach literatury ¹⁵.

W przypadku wszystkich badań nad nanocząsteczkami skład cząstek, ich rozmiar, chemia powierzchni, starzenie/rozpad próbki oraz długość fali, moc i czas ekspozycji na światło mogą w znacznym stopniu wpływać na wyniki. Ponadto należy wziąć pod uwagę produkty uboczne syntezy oraz rozpuszczalniki^{16 17}. W celu opracowania skutecznych nowych preparatów nanomedycznych konieczne jest zastosowanie technik wysokoprzepustowego przesiewania.

Kropki kwantowe CdTe wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe samodzielnie¹⁸ lub w połączeniu z antybiotykami. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że sprzęganie antybiotyków z CdTe może zwiększyć toksyczność wobec bakterii, ale zmniejszyć toksyczność wobec komórek ssaków, co wynika ze zmniejszonej produkcji reaktywnych form tlenu przez konjugaty¹⁹. Choć jest mało prawdopodobne, aby związki zawierające kadm zostały dopuszczone do stosowania u ludzi, takie preparaty mogłyby być wykorzystywane do dezynfekcji powierzchni lub sterylizacji wody.

W niniejszym protokole przedstawiamy prostą metodę solubilizacji kropek kwantowych CdTe za pomocą kwasu mercaptopropionowego (MPA). Kropki kwantowe są gotowe do użycia w ciągu godziny. Następnie demonstrujemy ich sprzęganie z czynnikiem przeciwdrobnoustrojowym.

Druga część protokołu przedstawia test inhibicji bakterii w 96-dołkowej płytce z wykorzystaniem konjugowanych i niekonjugowanych kropek kwantowych (QD). Gęstość optyczna jest odczytywana przez wiele godzin, co pozwala na ocenę efektów dodania QD i ekspozycji na światło zarówno natychmiast, jak i po okresie regeneracji. Przedstawiamy również metodę liczenia kolonii w celu ilościowego określenia przeżywalności bakterii.

Protokół

1. Solubilizacja kropek kwantowych (QD)

Jest to metoda odpowiednia dla CdTe. Podobne metody można zastosować w przypadku innych rodzajów kropek kwantowych (QD), takich jak InP/ZnS²⁰ i CdSe/ZnS ²¹.

1. Przygotować roztwór kropek kwantowych (QD) CdTe w toluenie o stężeniu 15 μM (gęstość optyczna = 2,5 przy pierwszym piku ekscytonowym).
2. Przenieść 200 μL tego roztworu zapasowego do szklanej fiolki. Nie używać plastiku!
3. Dodać 800 μL toluenu, 1 mL 200 mM buforu boratowego (pH 9) oraz 2 μL 11,5 M kwasu merkaptopropionowego (MPA).
4. Zamknąć fiolkę i energicznie wstrząsać przez 30-60 sekund.
5. Fazy wodna i organiczna rozdzielą się samoistnie. Faza wodna przybierze kolor kropek kwantowych. Aby usunąć warstwę toluenu, należy ją odessać i odrzucić. Następnie przenieść fazę wodną do czystej fiolki.
6. Oczyścić rozpuszczalne QD poprzez czterokrotne przemycie/filtrowanie przy użyciu filtra wirowego o progu odcięcia 10000 Da i pojemności 500 μL. Filtry należy wirować przy 3000 x g przez 13 minut. Przez co najmniej dwa ostatnie etapy przemywać docelowym buforem.
7. Po ostatnim przemyciu zawiesić oczyszczone QD w 50 mM buforze boratowym o żądanym pH i przechowywać w temperaturze 4 °C. Będą one stabilne przez 1-2 tygodnie.
8. Zmierzyć widma absorbancji i emisji, aby oszacować stężenie na podstawie opublikowanych wzorów ²².

Reprezentatywne wyniki: Rysunek 1 przedstawia obraz CdTe QDs pod wpływem lampy UV oraz widma emisji przed i po solubilizacji w wodzie, wykazując pomijalną zmianę po wymianie otoczki. Wartości rozmiaru to średnica rdzenia zmierzona za pomocą mikroskopii elektronowej.

2. Koniugacja kropek kwantowych z antybiotykiem

Ta część protokołu ma zastosowanie do każdej ujemnie naładowanej nanocząstki rozpuszczalnej w wodzie, w tym do większości komercyjnych QD, cząstek metali i innych¹⁹.

1. Można zastosować dowolną cząsteczkę, która albo samoorganizuje się na ujemnie naładowanych rozpuszczonych QD, albo posiada grupę reakcyjną umożliwiającą koniugację, np. aminę pierwszorzędową. W tym przykładzie wykorzystujemy polymyxynę B (PMB), która jest dodatnio naładowana i samoorganizuje się bez konieczności stosowania reagentów do koniugacji. Rozpuścić PMB w H₂O do stężenia 60 μM. (Jeśli wybrany antybiotyk nie jest rozpuszczalny w H₂O, rozpuścić go w DMSO lub etanolu w stężeniu 0,1-1 mM). Będzie to roztwór 10x (w H₂O) lub roztwór 100x (w rozpuszczalniku).
2. Obliczyć ilość roztworu QD potrzebną do eksperymentów nad toksycznością bakteryjną. Dla płytki 96-dołkowej z objętością 0,3 mL na dołek w czterech powtórzeniach wymagane jest 0,5 mL koniugatu o stężeniu 200 nM. Przygotować dwie probówki zawierające 100 μL kropek kwantowych o stężeniu 1 μM w 50 mM buforze boratowym.
3. W przypadku sprzęgania z aminą pierwszorzędową przygotować roztwór węglowanimidu 1-etylo-3-[3-dimetylaminopropyl]o (EDC) o stężeniu 19 mg/mL (100 mM) w H₂O. Roztwór EDC jest niestabilny; należy go użyć natychmiast, a pozostałość wyrzucić.
4. Do probówki z koniugatem dodać 50 μL 10x roztworu antybiotyku (w H₂O) lub 5 μL roztworu 100x (w rozpuszczalniku). Dla koniugacji PMB:CdTe w stosunku molowym 30:1 dodać 50 μL PMB o stężeniu 60 μM. Do probówki kontrolnej z samymi QD dodać H₂O lub rozpuszczalnik.
5. W razie potrzeby dodać 1 μL roztworu stokowego EDC do probówki z koniugatem.
6. Uzupełnić objętość koniugatu do 0,5 mL za pomocą odpowiedniego buforu (bufor boratowy lub PBS; nie stosować buforów zawierających aminy, takich jak Tris, ponieważ hamują one działanie EDC).
7. Zabezpieczyć probówki przed światłem za pomocą folii aluminiowej i umieścić na nutatorze lub kołysce na 1 h. W przypadku wystąpienia agregacji powtórzyć koniugację z niższymi stężeniami antybiotyku. Zwiększać stężenie stopniowo, aż do momentu, gdy cząstki przestaną agregować.
8. Przemyć koniugaty, przepuszczając je przez odpowiedni filtr. Próg odcięcia masy cząsteczkowej 10000 jest odpowiedni dla większości antybiotyków, ale nie dla białek lub przeciwciał.
9. W zależności od cząsteczki do oszacowania liczby cząsteczek antybiotyku na jedno QD można zastosować różne metody: spektroskopię absorbancyjną lub fluorescencyjną, elektroforezę żelową lub spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR).

Reprezentatywne wyniki. W tym przykładzie koniugacja PMB jest charakteryzowana zmianami w widmie emisji QD. Rysunek 2 przedstawia widma kropel kwantowych CdTe po dodaniu PMB.

3. Przygotowanie bakterii do przesiewania w płytkach 96-dołkowych; oznaczenie IC₅₀ antybiotyku

Metoda ta ma zastosowanie do niemal każdego szczepu bakterii hodowanego na odpowiedniej pożywce¹⁸. Dokładny czas trwania pomiarów zależy od szybkości wzrostu bakterii. W naszym przykładzie wykorzystano Escherichia coli hodowane na pożywce LB (lysogeny broth).

1. Aby wybrać odpowiednie stężenia koniugatów QD, należy znać IC₅₀ antybiotyku przeznaczonego do koniugacji oraz ustalić, czy same QD są toksyczne. Proces ten należy rozpocząć 2 dni przed eksperymentem z koniugacją. Wieczorem, stosując właściwe techniki sterylności i bezpieczeństwa biologicznego, zaszczepić 10 mL pożywki do wzrostu bakterii świeżą kolonią.
2. Następnego dnia, 1-2 godziny przed eksperymentem, napełnić każdy dołek płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem niemal maksymalną ilością pożywki. Za pomocą pipety wielokanałowej zaszczepić każdy dołek ilością od 1-50 μL kultury bakteryjnej (stężenie będzie zależeć od szybkości wzrostu danego szczepu i musi zostać skalibrowane w laboratorium).
3. Umieścić płytkę w czytniku płytek i ustawić pomiar co 10 minut przez 2 godziny przy określonej długości fali (zazwyczaj 600 nm). Monitorować płytkę, aby bakterie nie osiągnęły zbyt wysokiej gęstości zbyt szybko.
4. Gdy wszystkie komórki osiągną OD=0,1-0,15, wyjąć płytkę z czytnika i zakończyć pomiar.
5. Dodać sam lek oraz same QD w różnych stężeniach, wykonując pomiary w co najmniej trzech powtórzeniach. Jedną stronę płytki wykorzystać jako kontrolę „ciemną”, a drugą połowę poddać naświetlaniu. Sugerowany układ przedstawiono na Rysunku 3. Stężenia powinny obejmować zakres wystarczająco szeroki, aby zawierał jedno stężenie, które w niewielkim stopniu hamuje wzrost bakterii, oraz jedno, które całkowicie je zabija.
6. Osłonić „ciemną” stronę płytki folią aluminiową. Pozostałą stronę naświetlić lampą o pożądanej długości fali. Stosujemy specjalistyczną lampę do płytek 96-dołkowych o długości fali 440 nm, zbudowaną z diod LED 2,4 mW (Rysunek 4), i naświetlamy przez 30-60 min. Czarne płytki z przezroczystym dnem pomagają chronić nienaświetlane bakterie przed światłem rozproszonym. Między stroną naświetlaną a nienaświetlaną można również pozostawić pustą kolumnę.
7. Po naświetlaniu umieścić płytkę w czytniku i rejestrować OD 600 co 10 minut przez 5-12 godzin, w zależności od szybkości wzrostu. Jeśli to możliwe, utrzymać temperaturę < 32 °C, aby zapobiec wysychaniu kultur.
8. Wykreślić krzywe wzrostu w wybranym punkcie czasowym w funkcji log [stężenia] i wyznaczyć IC₅₀ antybiotyku za pomocą równania Hilla:

gdzie H to współczynnik Hilla, y_max to najwyższy punkt wzrostu (idealnie na plateau), a y_min to punkt zerowy, również idealnie na plateau. Mało prawdopodobne jest, aby same kropki kwantowe (QDs) wykazały znaczną toksyczność dla komórek przy zastosowanych stężeniach, zatem wartość ta nie zostanie wyznaczona.

Reprezentatywne wyniki. Pod koniec okresu rejestracji czyste studzienki będą wskazywać na całkowity śmierć komórek, a wzdłuż rosnących stężeń leku powinien pojawić się gradient gęstości komórek. Bakterie powinny wykazywać krzywe wzrostu w kształcie litery S (Rysunek 5 A); położenie maksymalnego plateau będzie się znacznie różnić w zależności od szczepu, a także zależeć od temperatury. Można wybrać określony punkt czasowy jako reprezentatywny i nanieść wartości na wykres w funkcji Log[antibiotic], aby wyznaczyć IC₅₀ (Rysunek 5 B). Aby ocenić toksyczność QD, można również nanieść na wykres przeżywalność w funkcji Log[QD], jednak uzyskanie znaczącego efektu zabijania bakterii za pomocą samych QD jest rzadkie (Rysunek 5 C).

4. Przygotowanie bakterii do przesiewu w 96-dołkowej płytce z antybiotykiem/kropkami kwantowymi (QDs)

1. Dzień przed eksperymentem, z zachowaniem odpowiednich technik sterylności i bezpieczeństwa biologicznego, zaszczep 10 mL kultury z świeżej kolonii do odpowiedniego medium bogatego. Konjugat QD-antybiotyk należy przygotować tego dnia, chyba że jest on wysoce niestabilny.
2. Na 1-2 godziny przed eksperymentem wypełnij każdą z studni płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem niemal maksymalną ilością medium wzrostowego. Za pomocą pipety wielokanałowej zaszczep każdą studnię 1-50 μL kultury bakteryjnej.
3. Umieść płytkę w czytniku płytek i ustaw odczyt co 10 minut przez 2 godziny przy tej samej długości fali, co w Części 3.
4. Gdy wszystkie komórki osiągną OD=0,1-0,15, wyjmij płytkę z czytnika i zatrzymaj rejestrację.
5. Dodaj konjugaty QD w różnych stężeniach, wykonując pomiar w przynajmniej czterech powtórzeniach. Jedną stronę płytki wykorzystaj jako kontrolę „ciemną”, a drugą połowę jako oświetloną. Sugerowany układ przedstawiono na Rysunku 6. Pasek kontrolny zawierający wyłącznie bakterie powinien być zawsze uwzględniany na wypadek, gdyby problemy z kulturą, temperaturą itp. wpłynęły na warunki wzrostu. Należy również uwzględnić pojedyncze paski zawierające tylko lek oraz tylko QD, aby upewnić się, że odpowiadają one płytce kontrolnej przygotowanej wcześniej. Pozostałe studnie przeznacz dla konjugatów, aby zapewnić odpowiednią statystykę.
6. Osłoń „ciemną” stronę płytki folią aluminiową. Wystaw drugą stronę na działanie lampy o pożądanej długości fali.
7. Po ekspozycji na światło umieść płytkę w czytniku płytek i rejestruj OD 600 co 10 minut przez 5-12 godzin. Jeśli to możliwe, utrzymuj temperaturę < 32 °C, aby uniknąć wysychania kultur.

Reprezentatywne wyniki. Połączenie QD i antybiotyku może być mniej toksyczne niż sam antybiotyk, równie toksyczne lub bardziej toksyczne. Można to określić ilościowo za pomocą krzywych wzrostu i pomiarów IC₅₀. Na Rysunku 7 przedstawiono przykład koniugatów o toksyczności równej samemu antybiotykowi oraz przykład koniugatów o większej toksyczności.

5. Liczenie kolonii na płytkach

1. Wybierz jedną lub więcej studzienek z przetworzonej płytki 96-dołkowej do przeprowadzenia rozcieńczeń seryjnych i zliczania kolonii.
2. Przygotuj rozcieńczenia seryjne dla każdej z wybranych próbek bakterii w PBS lub roztworze soli fizjologicznej (0,9 % NaCl). Przenieś 20 μL roztworu bakteryjnego i rozcieńcz go w 180 μL roztworu soli fizjologicznej, wymień końcówkę pipety, wymieszaj i przenieś 20 μL rozcieńczonego roztworu bakteryjnego do 180 μL roztworu soli fizjologicznej. Powtórz czynność 6 razy.
3. Pobierz 10 μL z każdego rozcieńczenia i wysej na odpowiednią płytkę z podłożem stałym. Wszystkie 8 stężeń jednej próbki można wysiać na okrągłej szalce Petriego o średnicy 10 cm, choć preferowane są szalki prostokątne, ponieważ ułatwia to zachowanie równego rozmieszczenia.
4. Pozostaw do wyschnięcia na blacie przez 15 min, a następnie inkubuj w temperaturze odpowiedniej dla danej bakterii przez 16 godzin.
5. Zlicz kolonie i oblicz jednostki tworzące kolonie (CFU) zgodnie ze wzorem: (liczba kolonii x czynnik rozcieńczenia)/objętość wysiana = CFU/mL.

Rysunek 8 przedstawia przykładową płytkę z CFU.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Kropki kwantowe (QDs) CdTe. (A) Osiem preparatów QDs CdTe naświetlonych lampą UV (365 nm). (B) Widma absorbancji i emisji pięciu wybranych rozmiarów przed i po solubilizacji w wodzie. Linie przerywane reprezentują widma w toluenie, a linie ciągłe w wodzie.

Rysunek 2. Analiza widmowa i żelowa koniugatów QD-PMB. W tym przykładzie zastosowano kropki kwantowe (QDs) CdTe emitujące światło pomarańczowe; wpływ na inne rodzaje QDs będzie musiał zostać oceniony dla każdego eksperymentu. (A) Typowe widmo absorbancji (szara linia) i widmo emisji (czarna linia) QDs przed koniugacją z PMB oraz widmo emisji (linia przerywana) po dodaniu 160 równoważników molowych PMB. (B) Zależność między stosunkiem PMB a intensywnością emisji QDs (kwadraty) oraz położeniem szczytu długości fali (trójkąty).

Rycina 3. Sugerowany układ płytki dla kontrolnego wzrostu. Przedstawiono szeroki zakres stężeń PMB i QD. Jedna połowa płytki jest naświetlana (zaznaczona na niebiesko), a druga, identyczna połowa, jest chroniona przed światłem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Rysunek 4. Specjalistyczna lampa z 96 diodami LED do jednorodnego naświetlania płytek, przedstawiająca wygląd w stanie wyłączonym i włączonym. Można również użyć typowej przenośnej lampy UV, jednak nie zapewni ona jednorodnego pokrycia całej płytki.

Rysunek 5. Przykładowe wyniki dla płyt kontrolnych wzrostu. (A) Reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii przy różnych stężeniach leku, od 0 do całkowitej śmierci komórek. Symbole puste oznaczają sam PMB z podanymi stężeniami; symbole pełne oznaczają CdTe-PMB bez naświetlania; a symbole częściowo wypełnione oznaczają CdTe-PMB z naświetlaniem. Naświetlanie nie miało wpływu na próbki zawierające tylko PMB, dlatego krzywe te pominięto dla przejrzystości. Wszystkie konjugaty PMB-CdTe mają stosunek PMB:QD wynoszący 30:1. (B) Wykresy wartości krzywej wzrostu w 200 min w funkcji Log[PMB] wraz z dopasowaniem do równania (1). W celu kontroli efektów światła wykonano krzywą dla samego antybiotyku przy 30 min ekspozycji na światło. (C) Przeżywalność bakterii w 200 min w funkcji stężenia QD z użyciem QD CdTe. Przy ekspozycji na światło widoczna jest pewna toksyczność, jednak zbyt mała, aby wyznaczyć wartość IC₅₀. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.

Rycina 6. Sugerowany układ płytki do testowania koniugatów. Podświetlona na niebiesko połowa płytki powinna być wystawiona na działanie światła, a połowa niewyróżniona powinna być chroniona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

Rysunek 7. Przykładowe wyniki dla płytki testowej z koniugatami. Wartości krzywej wzrostu w 200 min naniesiono na wykres i dopasowano do równania (1). (A) Koniugaty CdTe-PMB wykazują zwiększoną toksyczność w porównaniu do samego PMB. (B) Koniugaty nanocząsteczek złota Au-PMB nie wykazują zwiększonej toksyczności w porównaniu do samego PMB.

Rycina 8. Przykład płytki CFU. E. coli zasiane w płytce 96-dołkowej poddano działaniu QD-PMB z naświetlaniem lub bez naświetlania przez 30 min, następnie inkubowano w 32 °C przez 4 godziny. Wykonano rozcieńczenia seryjne każdej próbki bakteryjnej w roztworze soli fizjologicznej, a następnie 10 μL rozcieńczeń od 100 X do 10⁷ X wysiano na płytki agarowe. Płytki inkubowano w 37 °C, a kolonie policzono po 16 godzinach. Na płytce zaznaczono rozcieńczenia wzdłuż rzędów; kolumny to: (A) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe (C) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe, (D) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe naświetlane, (E) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe naświetlane, (F) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe naświetlane.

Dyskusja

Nanocząstki stanowią obiecujące podejście do tworzenia nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Analiza krzywej wzrostu jest sposobem monitorowania gęstości komórek bakteryjnych, który pozwala odróżnić komórki aktywnie rosnące od komórek o zahamowanym wzroście. W połączeniu z liczeniem kolonii na płytkach umożliwia ona dokładną analizę potencjału antybiotykowego koniugatu. Format 96-dołkowy pozwala na stosunkowo wysokoprzepustowe zmiany stężeń i innych warunków, takich jak ekspozycja na światło; ta ostatnia jest kluczowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Składnik buforu boranowego nr 1	Fisher	Boric acid A-74-1
Składnik buforu boranowego nr 2	Sigma-Aldrich	Sodium Tetraborate B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Dostępne różne MWCO
Fiolki szklane	Fisher	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Polymyxyna B	Sigma-Aldrich	P1004
Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 1	Fisher	NaCl S271
Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 2	BD	Tryptone 211705
Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 3	BD	Yeast Extract 211929
Lampa do naświetlania	Custom
Płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem	Fisher	07-200-567 lub 07-200-730
Spektrometr fluorescencyjny	Molecular Devices
Czytnik płytek absorbancji	Molecular Devices
BactoAgar do pożywek stałych	Bioshop	AGR001.1
Szalki Petriego okrągłe	Fisher	08-75-12
Szalki Petriego prostokątne	Fisher	08-757-11A