Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Podsumowanie

Nanocząstki, takie jak półprzewodnikowe kropki kwantowe (QDs), mogą być wykorzystywane do tworzenia agentów fotoaktywowalnych w zastosowaniach przeciwdrobnoustrojowych lub przeciwnowotworowych. Niniejsza technika przedstawia sposób nadawania rozpuszczalności w wodzie kropkom kwantowym z tellurku kadmu (CdTe), ich sprzęganie z antybiotykiem oraz przeprowadzanie testu inhibicji bakteryjnej w oparciu o krzywe wzrostu i liczenie kolonii na płytkach.

Streszczenie

Kropki kwantowe (QDs) to fluorescencyjne nanocząstki półprzewodnikowe o widmach emisji zależnych od rozmiaru, które mogą być pobudzane szerokim zakresem długości fal. Ze względu na swoją jasną i stabilną fluorescencję, QDs wzbudziły duże zainteresowanie w obszarze obrazowania, diagnostyki i terapii^{1,2 3,4,5}. QDs mogą być konjugowane z różnymi cząsteczkami biologicznie aktywnymi w celu wiązania z bakteriami i komórkami ssaków⁶.

Kropki kwantowe (QDs) są również szeroko badane jako czynniki cytotoksyczne do ukierunkowanego zwalczania bakterii. Pojawianie się wielolekoopornych szczepów bakteryjnych szybko staje się kryzysem zdrowia publicznego, szczególnie w przypadku patogenów Gram-ujemnych ⁷. Ze względu na dobrze znany efekt przeciwdrobnoustrojowy niektórych nanomateriałów, zwłaszcza Ag, istnieje setki badań analizujących toksyczność nanocząstek wobec bakterii ⁸. Badania bakteriologiczne przeprowadzono również z zastosowaniem innych rodzajów półprzewodnikowych nanocząstek, zwłaszcza TiO₂ ^9,10-11, ale także ZnO¹² i innych, w tym CuO ¹³. W badaniach tych przeprowadzono niektóre porównania szczepów bakteryjnych, zazwyczaj zestawiając szczep Gram-ujemny ze szczepem Gram-dodatnim. W przypadku wszystkich tych cząstek mechanizmy toksyczności przypisuje się utlenianiu: albo fotogenerowaniu reaktywnych form tlenu (ROS) przez cząstki, albo bezpośredniemu uwalnianiu jonów metali, które mogą powodować toksyczność oksydacyjną. Nawet w odniesieniu do tych materiałów wyniki różnych badań znacznie się różnią. W niektórych opracowaniach zgłaszano, że badany szczep Gram-dodatni jest bardziej wrażliwy niż Gram-ujemny ¹⁰; w innych obserwowano sytuację odwrotną ¹⁴. Badania te zostały szczegółowo omówione w przeglądach literatury ¹⁵.

W przypadku wszystkich badań nad nanocząsteczkami skład cząstek, ich rozmiar, chemia powierzchni, starzenie/rozpad próbki oraz długość fali, moc i czas ekspozycji na światło mogą w znacznym stopniu wpływać na wyniki. Ponadto należy wziąć pod uwagę produkty uboczne syntezy oraz rozpuszczalniki^{16 17}. W celu opracowania skutecznych nowych preparatów nanomedycznych konieczne jest zastosowanie technik wysokoprzepustowego przesiewania.

Kropki kwantowe CdTe wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe samodzielnie¹⁸ lub w połączeniu z antybiotykami. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że sprzęganie antybiotyków z CdTe może zwiększyć toksyczność wobec bakterii, ale zmniejszyć toksyczność wobec komórek ssaków, co wynika ze zmniejszonej produkcji reaktywnych form tlenu przez konjugaty¹⁹. Choć jest mało prawdopodobne, aby związki zawierające kadm zostały dopuszczone do stosowania u ludzi, takie preparaty mogłyby być wykorzystywane do dezynfekcji powierzchni lub sterylizacji wody.

W niniejszym protokole przedstawiamy prostą metodę solubilizacji kropek kwantowych CdTe za pomocą kwasu mercaptopropionowego (MPA). Kropki kwantowe są gotowe do użycia w ciągu godziny. Następnie demonstrujemy ich sprzęganie z czynnikiem przeciwdrobnoustrojowym.

Druga część protokołu przedstawia test inhibicji bakterii w 96-dołkowej płytce z wykorzystaniem konjugowanych i niekonjugowanych kropek kwantowych (QD). Gęstość optyczna jest odczytywana przez wiele godzin, co pozwala na ocenę efektów dodania QD i ekspozycji na światło zarówno natychmiast, jak i po okresie regeneracji. Przedstawiamy również metodę liczenia kolonii w celu ilościowego określenia przeżywalności bakterii.

Protokół

1. Solubilizacja kropek kwantowych (QD)

Jest to metoda odpowiednia dla CdTe. Podobne metody można zastosować w przypadku innych typów kropek kwantowych (QDs), takich jak InP/ZnS²⁰ oraz CdSe/ZnS ²¹.

1. Przygotować roztwór kropek kwantowych (QDs) CdTe w toluenie o stężeniu 15 μM (gęstość optyczna = 2,5 w pierwszym piku ekscytonowym).
2. Przenieść 200 μL tego roztworu zapasowego do szklanej fiolki. Nie używać plastiku!
3. Dodać 800 μL toluenu, 1 mL 200 mM buforu boranowego (pH 9) oraz 2 μL 11,5 M kwasu merkaptopropionowego (MPA).
4. Zamknąć fiolkę i energicznie wstrząsać przez 30-60 sekund.
5. Fazy wodna i organiczna rozdzielą się samoistnie. Faza wodna przyjmie kolor kropek kwantowych. Aby uniknąć kontaktu z warstwą toluenu, należy ją usunąć i odrzucić. Następnie przenieść fazę wodną do czystej fiolki.
6. Oczyścić rozpuszczone kropki kwantowe poprzez czterokrotne przemywanie/filtrowanie przy użyciu filtra wirówkowego o objętości 500 μL i progu odcięcia masy cząsteczkowej 10000 Da. Filtry należy wirować przy 3000 x g przez 13 minut. Przynajmniej dwa ostatnie przemycia należy przeprowadzić przy użyciu docelowego buforu końcowego.
7. Po ostatnim przemywaniu zawiesić oczyszczone kropki kwantowe w 50 mM buforze boranowym o żądanym pH i przechowywać w temperaturze 4 °C. Będą one stabilne przez 1-2 tygodnie.
8. Zmierzyć widma absorbancji i emisji w celu oszacowania stężenia na podstawie opublikowanych wzorów ²².

Reprezentatywne wyniki: Rysunek 1 przedstawia obraz CdTe QDs pod wpływem lampy UV oraz widma emisji przed i po solubilizacji w wodzie, wykazując nieznaczne zmiany wynikające z wymiany otoczki.

2. Koniugacja kropek kwantowych z antybiotykiem

Ta część protokołu ma zastosowanie do każdej ujemnie naładowanej nanocząstki rozpuszczalnej w wodzie, w tym do większości komercyjnych kropek kwantowych (QD), cząstek metali i innych¹⁹.

1. Można zastosować dowolną cząsteczkę, która albo samoorganizuje się na ujemnie naładowanych, solubilizowanych kropkach kwantowych (QD), albo posiada grupę reaktywną umożliwiającą konjugację, taką jak amina pierwszorzędowa. W tym przykładzie stosujemy polymyksynę B (PMB), która jest naładowana dodatnio i samoorganizuje się bez konieczności użycia odczynników konjugujących. Rozpuścić PMB w H₂O do stężenia 60 μM. (Jeśli wybrany antybiotyk nie jest rozpuszczalny w H₂O, rozpuścić go w DMSO lub etanolu w stężeniu 0,1-1 mM). Będzie to roztwór 10x (w H₂O) lub roztwór 100x (w rozpuszczalniku).
2. Obliczyć ilość roztworu QD potrzebną do eksperymentów nad toksycznością bakteryjną. Dla płytki 96-dołkowej z objętością 0,3 mL na dołek w czterech powtórzeniach, wymagane jest 0,5 mL koniugatu o stężeniu 200 nM. Przygotować dwie probówki zawierające 100 μL kropek kwantowych o stężeniu 1 μM w 50 mM buforze boratowym.
3. W przypadku sprzęgania z aminą pierwszorzędową, przygotować roztwór chlorku 1-etylo-3-[3-dimetylaminopropyl]karbodiimidu (EDC) o stężeniu 19 mg/mL (100 mM) w H₂O. EDC w roztworze jest niestabilny; należy go użyć natychmiast, a pozostałość wyrzucić.
4. Do probówki z koniugatem dodać 50 μL 10-krotnego roztworu antybiotyku (w H₂O) lub 5 μL 100-krotnego roztworu (w rozpuszczalniku). Dla konjugacji PMB:CdTe w stosunku molowym 30:1, dodać 50 μL PMB o stężeniu 60 μM. Do probówki kontrolnej z samymi QD dodać H₂O lub rozpuszczalnik.
5. W razie potrzeby dodać 1 μL roztworu stokowego EDC do probówki z koniugatem.
6. Uzupełnić objętość koniugatu do 0,5 mL odpowiednim buforem (bufor boratowy lub PBS; nie stosować buforów zawierających aminy, takich jak Tris, ponieważ hamują one działanie EDC).
7. Osłonić probówki przed światłem folią aluminiową i umieścić na nutatorze lub wstrząsarce na 1 hr. Jeśli wystąpi agregacja, powtórzyć konjugację przy zastosowaniu niższych stężeń antybiotyku. Zwiększać stężenie miareczkowo, aż cząstki przestaną agregować.
8. Przemyć koniugaty, przepuszczając je przez odpowiedni filtr. Próg odcięcia masy cząsteczkowej 10000 jest odpowiedni dla większości antybiotyków, ale nie dla białek ani przeciwciał.
9. W zależności od cząsteczki, do oszacowania liczby cząsteczek antybiotyku na jedną QD można zastosować różne metody: spektroskopię absorbancyjną lub fluorescencyjną, elektroforezę w żelu lub spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR).

Reprezentatywne wyniki. W tym przykładzie koniugacja PMB charakteryzuje się zmianami w widmie emisyjnym QD. Rycina 2 przedstawia widma QD CdTe po dodaniu PMB.

3. Przygotowanie bakterii do przesiewu w płytkach 96-dołkowych; oznaczenie IC₅₀ antybiotyku

Metoda ta ma zastosowanie do niemal każdego szczepu bakteryjnego hodowanego na odpowiedniej pożywce¹⁸. Dokładny czas trwania pomiarów zależy od tempa wzrostu bakterii. W naszym przykładzie wykorzystujemy Escherichia coli hodowaną na pożywce LB (lysogeny broth).

1. W celu wyboru odpowiednich stężeń koniugatów QD ważne jest określenie IC₅₀ antybiotyku podlegającego koniugacji oraz sprawdzenie, czy same kropki kwantowe (QD) wykazują toksyczność. Czynność tę należy rozpocząć 2 dni przed eksperymentem z koniugacją. Wieczorem zaszczepić 10 mL pożywki do wzrostu bakterii z świeżej kolonii, stosując odpowiednie techniki sterylności i bezpieczeństwa biologicznego.
2. Następnego dnia, 1-2 godziny przed eksperymentem, napełnić każdą z dolek płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem niemal maksymalną ilością pożywki. Używając pipety wielokanałowej, zaszczepić każdą dolkę 1-50 μL kultury bakteryjnej (stężenie będzie zależeć od szybkości wzrostu konkretnego szczepu i musi zostać skalibrowane w laboratorium).
3. Umieścić płytkę w czytniku płytek i ustawić pomiar co 10 minut przez 2 godziny przy określonej długości fali (zazwyczaj 600 nm). Monitorować płytkę, aby bakterie nie osiągnęły zbyt wysokiej gęstości zbyt szybko.
4. Gdy wszystkie komórki osiągną OD=0.1-0.15, wyjąć płytkę z czytnika i zatrzymać rejestrację.
5. Dodać sam lek oraz same QD w różnych stężeniach, co najmniej w trzech powtórzeniach. Jedną stronę płytki wykorzystać jako kontrolę „ciemną”, a drugą połowę poddać naświetlaniu. Sugerowany układ przedstawiono na Rysunku 3. Stężenia powinny obejmować zakres wystarczająco szeroki, aby zawierał jedno stężenie słabo hamujące wzrost bakterii oraz jedno, które wyeliminuje je wszystkie.
6. Zasłonić „ciemną” stronę płytki folią aluminiową. Pozostałą stronę naświetlić lampą o pożądanej długości fali. Stosujemy specjalną lampę do płytek 96-dołkowych o długości fali 440 nm, wykonaną z diod LED 2,4 mW (Rysunek 4), i naświetlamy przez 30-60 min. Czarne płytki z przezroczystym dnem pomagają chronić nienaświetlane bakterie przed światłem rozproszonym. Pomiędzy stroną naświetlaną a nienaświetlaną można również zostawić pustą kolumnę.
7. Po naświetleniu umieścić płytkę w czytniku i rejestrować OD 600 co 10 minut przez 5-12 godzin, w zależności od szybkości wzrostu. Jeśli to możliwe, utrzymać temperaturę < 32 °C, aby uniknąć wysychania kultur.
8. Narysować krzywe wzrostu w wybranym punkcie czasowym w funkcji log [stężenia] i wyznaczyć IC₅₀ antybiotyku, korzystając z równania Hilla:

gdzie H to współczynnik Hilla, y_max to najwyższy punkt wzrostu (idealnie na plateau), a y_min to punkt zerowy, również idealnie na plateau. Mało prawdopodobne jest, aby same QD wykazały znaczną toksyczność wobec komórek przy zastosowanych stężeniach, zatem wartość ta nie zostanie określona.

Reprezentatywne wyniki. Po zakończeniu okresu pomiaru czyste dołki będą wskazywać na całkowitą śmierć komórek, a wzdłuż rosnących stężeń leku powinien pojawić się gradient gęstości komórek. Bakterie powinny wykazywać krzywe wzrostu w kształcie litery S (Rysunek 5 A); położenie maksymalnego plateau będzie się znacznie różnić w zależności od szczepu, a także zależeć od temperatury. Można wybrać konkretny punkt czasowy jako reprezentatywny i nanieść wartości na wykres w funkcji Log[antybiotyku], aby wyznaczyć IC₅₀ (Rysunek 5 B). W celu oceny toksyczności QD można również nanieść na wykres przeżywalność w funkcji Log[QD], jednak osiągnięcie znaczącego uśmiercenia bakterii za pomocą samych QD jest rzadkie (Rysunek 5 C).

4. Przygotowanie bakterii do przesiewu w płytce 96-dołkowej z antybiotykiem/Kropkami kwantowymi (QDs)

1. Dzień przed eksperymentem, z zachowaniem odpowiednich zasad sterylności i bezpieczeństwa biologicznego, zaszczep 10 mL kultury ze świeżej kolonii do odpowiedniego medium bogatego. Konjugat QD-antybiotyk należy przygotować tego dnia, chyba że jest on wysoce niestabilny.
2. Na 1-2 godziny przed eksperymentem wypełnij każdą z dolek płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem niemal maksymalną ilością medium wzrostowego. Używając pipety wielokanałowej, zaszczep każdą dolkę 1-50 μL kultury bakteryjnej.
3. Umieść płytkę w czytniku płytek i ustaw go tak, aby odczyt odbywał się co 10 minut przez 2 godziny przy tej samej długości fali co w Części 3.
4. Gdy wszystkie komórki osiągną OD=0,1-0,15, wyjmij płytkę z czytnika i zatrzymaj pomiar.
5. Dodaj konjugaty QD w różnych stężeniach, co najmniej w czterech powtórzeniach. Wykorzystaj jedną stronę płytki jako kontrolę „ciemną”, a drugą połowę do naświetlania. Sugerowany układ przedstawiono na Rysunku 6. Pasek kontrolny zawierający tylko bakterie zawsze powinien być dołączony na wypadek, gdyby problemy z kulturą, temperaturą itp. wpłynęły na warunki wzrostu. Należy również uwzględnić pojedyncze paski zawierające tylko lek oraz tylko QD, aby upewnić się, że są one zgodne z wcześniej wykonaną płytką kontrolną. Pozostałe dołki są przeznaczone dla konjugatów, aby umożliwić uzyskanie dobrych statystyk.
6. Osłoń „ciemną” stronę płytki folią aluminiową. Wystaw drugą stronę na działanie lampy o pożądanej długości fali.
7. Po naświetlaniu umieść płytkę w czytniku i rejestruj OD 600 co 10 minut przez 5-12 godzin. Jeśli to możliwe, utrzymuj temperaturę < 32 °C, aby uniknąć wysychania kultur.

Reprezentatywne wyniki. Kombinacja kropek kwantowych (QD) i antybiotyku może być mniej toksyczna niż sam antybiotyk, równie toksyczna lub bardziej toksyczna. Można to określić ilościowo, wykorzystując krzywe wzrostu i pomiary IC₅₀. Rycina 7 przedstawia przykład koniugatów o toksyczności równej samemu antybiotykowi oraz przykład koniugatów o większej toksyczności.

5. Metoda płytkowa

1. Wybierz jedno lub więcej dołków z potraktowanej płytki 96-dołkowej, które zostaną wykorzystane do rozcieńczeń seryjnych i liczenia kolonii.
2. Przygotuj rozcieńczenie seryjne każdej z wybranych próbek bakteryjnych w PBS lub roztworze soli fizjologicznej (0,9 % NaCl). Przenieś 20 μL zawiesiny bakteryjnej i rozcieńcz ją w 180 μL roztworu soli fizjologicznej, wymień końcówkę pipety, wymieszaj i przenieś 20 μL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do 180 μL roztworu soli fizjologicznej. Powtórz czynność 6 razy.
3. Pobierz 10 μL z każdego rozcieńczenia i wysiej na odpowiednią płytkę z pożywką stałą. Wszystkie 8 stężeń jednej próbki można wysiać na okrągłej szalce Petriego o średnicy 10 cm, choć zaleca się stosowanie szalek prostokątnych, ponieważ łatwiej jest wtedy zachować odpowiedni układ.
4. Pozostaw próbki do wyschnięcia na blacie przez 15 min, a następnie inkubuj w temperaturze odpowiedniej dla danej bakterii przez 16 godzin.
5. Policz kolonie i oblicz liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) zgodnie ze wzorem: (liczba kolonii x czynnik rozcieńczenia)/objętość wysiana = CFU/mL.

Rysunek 8 przedstawia przykład płytki z CFU.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Kropki kwantowe (QDs) CdTe. (A) Osiem preparatów CdTe QDs oświetlonych lampą UV (365 nm). (B) Widma absorbancji i emisji pięciu wybranych rozmiarów przed i po solubilizacji w wodzie. Linie przerywane reprezentują widma w toluenie, a linie ciągłe w wodzie.

Rycina 2. Analiza spektralna i żelowa koniugatów QD-PMB. W tym przykładzie zastosowano kropki kwantowe (QD) z CdTe emitujące światło pomarańczowe; wpływ na inne rodzaje QD będzie wymagał oceny w każdym eksperymencie. (A) Typowe widma absorbancji (linia szara) i emisji (linia czarna) QD przed koniugacją z PMB oraz widmo emisji (linia przerywana) po dodaniu 160 równoważników molowych PMB. (B) Zależność między stosunkiem PMB a intensywnością emisji QD (kwadraty) oraz położeniem maksimum długości fali (trójkąty).

Rysunek 3. Sugerowany układ płytki dla płytki kontrolnej wzrostu. Przedstawiono szeroki zakres stężeń PMB i QD. Jedna połowa płytki jest naświetlona (wyróżniona na niebiesko), a identyczna druga połowa jest chroniona przed światłem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 4. Specjalistyczna lampa z 96 diodami LED do jednorodnego naświetlania płytki, przedstawiająca wygląd urządzenia w stanie wyłączonym i włączonym. Można również użyć typowej przenośnej lampy UV, jednak nie zapewni ona jednorodnego pokrycia całej płytki.

Rycina 5. Przykładowe wyniki dla płyty wzrostu kontrolnej. (A) Reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii przy różnych stężeniach leku, od 0 do całkowitej śmierci komórkowej. Otwarte symbole oznaczają sam PMB z podanymi stężeniami; pełne symbole oznaczają CdTe-PMB bez naświetlania; a symbole półpełne oznaczają CdTe-PMB z naświetlaniem. Naświetlanie nie miało wpływu na próbki z samym PMB, dlatego krzywe te pominięto dla przejrzystości. Wszystkie konjugaty PMB-CdTe mają stosunek PMB:QD wynoszący 30:1. (B) Wykresy wartości krzywej wzrostu w 200 min w funkcji Log[PMB] oraz dopasowania do równania (1). W celu kontroli efektów światła wykonano krzywą dla samego antybiotyku przy 30 min ekspozycji na światło. (C) Przeżywalność bakterii w 200 min w funkcji stężenia QD, z użyciem QD CdTe. Przy ekspozycji na światło widoczna jest pewna toksyczność, jednak zbyt mała, aby wyznaczyć wartość IC₅₀. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą figurę.

Rysunek 6. Sugerowany układ płytki do testu koniugatów. Zakreślona na niebiesko połowa płytki powinna być wystawiona na działanie światła, a niezakreślona połowa pozostaje chroniona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 7. Przykładowe wyniki dla płytki testowej z koniugatami. Wartości krzywej wzrostu w 200 min zostały naniesione na wykres i dopasowane do równania (1). (A) Koniugaty CdTe-PMB wykazują zwiększoną toksyczność w porównaniu do samego PMB. (B) Koniugaty nanocząsteczek złota Au-PMB nie wykazują zwiększonej toksyczności w porównaniu do samego PMB.

Rycina 8. Przykład płytki CFU. E. coli zaszczepione w płytce 96-dołkowej poddano działaniu QD-PMB z naświetlaniem lub bez naświetlania przez 30 min, a następnie inkubowano w temperaturze 32 °C przez 4 godziny. Wykonano rozcieńczenia seryjne każdej próbki bakteryjnej w roztworze soli fizjologicznej, a następnie 10 μL rozcieńczeń od 100 X do 10⁷ X wysiano na płytki z agarem. Płytki inkubowano w temperaturze 37 °C, a kolonie przeliczono po 16 godzinach. Płytka przedstawia rozcieńczenia wzdłuż rzędów zgodnie z oznaczeniem; kolumny to: (A) 0,06 μM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 μM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 μM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 μM PMB + 2 nM CdTe naświetlane, (E) 0,12 μM PMB + 4 nM CdTe naświetlane, (F) 0,2 μM PMB + 6,7 nM CdTe naświetlane.

Dyskusja

Nanocząstki stanowią obiecujące podejście do tworzenia nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Analiza krzywej wzrostu jest sposobem monitorowania gęstości komórek bakteryjnych, który pozwala odróżnić komórki aktywnie rosnące od komórek o zahamowanym wzroście. W połączeniu z liczeniem kolonii na płytkach umożliwia ona dokładną analizę potencjału antybiotykowego koniugatu. Format 96-dołkowy pozwala na stosunkowo wysokoprzepustowe zmiany stężeń i innych warunków, takich jak ekspozycja na światło; ta ostatnia jest kluczowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Składnik buforu boranowego nr 1	Fisher	Boric acid A-74-1
Składnik buforu boranowego nr 2	Sigma-Aldrich	Sodium Tetraborate B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Dostępne różne MWCO
Fiolki szklane	Fisher	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Polymyxyna B	Sigma-Aldrich	P1004
Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 1	Fisher	NaCl S271
Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 2	BD	Tryptone 211705
Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 3	BD	Yeast Extract 211929
Lampa do naświetlania	Custom
Płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem	Fisher	07-200-567 lub 07-200-730
Spektrometr fluorescencyjny	Molecular Devices
Czytnik płytek absorbancji	Molecular Devices
BactoAgar do pożywek stałych	Bioshop	AGR001.1
Szalki Petriego okrągłe	Fisher	08-75-12
Szalki Petriego prostokątne	Fisher	08-757-11A