Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Podsumowanie

W niniejszej pracy wyjaśniamy sposób wykonania i zastosowania mikropłynnego mieszalnika zdolnego do mieszania dwóch roztworów w czasie ~8 μs. Demonstrujemy również wykorzystanie tych mieszalników w detekcji spektroskopowej z użyciem fluorescencji UV oraz fluorescencyjnego transferu energii w rezonansie (FRET).

Streszczenie

Proces, w którym białko zwija się do swojej natywnej konformacji, ma ogromne znaczenie dla biologii i zdrowia ludzi, a mimo to wciąż nie jest w pełni zrozumiały. Jedną z przyczyn tego stanu rzeczy jest fakt, że zwijanie odbywa się w bardzo szerokim zakresie czasowym, od nanosekund do sekund lub dłużej, w zależności od białka¹. Konwencjonalne miksery typu stopped-flow umożliwiły pomiar kinetyki zwijania począwszy od około 1 ms. Opracowaliśmy niedawno mikromieszalnik mikrofluidyczny, który rozcieńcza denaturant około 100-krotnie w czasie ~8 μs². W przeciwieństwie do miksera stopped-flow, urządzenie to pracuje w reżimie przepływu laminarnego, w którym nie występuje turbulencja. Brak turbulencji pozwala na precyzyjną symulację numeryczną wszystkich przepływów wewnątrz mieszalnika, wykazując doskonałą zgodność z wynikami eksperymentalnymi^3-4.

Przepływ laminarny uzyskuje się dla liczb Reynoldsa Re ≤100. W przypadku roztworów wodnych wymaga to geometrii w skali mikronowej. Używamy twardego podłoża, takiego jak krzem lub kwarc topiony, aby stworzyć kanały o szerokości 5-10 μm i głębokości 10 μm (patrz Rysunek 1). Najmniejsze wymiary, przy wlocie do obszaru mieszania, są rzędu 1 μm. Układ jest uszczelniany cienką szklaną przykrywką lub przykrywką z kwarcytu topionego w celu zapewnienia dostępu optycznego. Typowe całkowite liniowe prędkości przepływu wynoszą ~1 m/s, co daje Re~10, jednak zużycie białka wynosi zaledwie ~0,5 nL/s lub 1,8 μL/hr. Stężenie białka zależy od metody detekcji: dla fluorescencji tryptofanu typowe stężenie wynosi 100 μM (dla 1 Trp/białko), a dla FRET typowe stężenie wynosi ~100 nM.

Proces fałdowania jest inicjowany poprzez szybkie rozcieńczenie denaturanta z 6 M do 0,06 M chlorku guanidyny. Białko w wysokim stężeniu denaturanta przepływa przez kanał centralny i w obszarze mieszania spotyka się z obu stron z buforem bez denaturanta, który porusza się około 100 razy szybciej (patrz Rycina 2). Taka geometria powoduje szybkie zwężenie strumienia białka do wąskiego dżetu o szerokości około 100 nm. Dyfuzja lekkich cząsteczek denaturanta jest bardzo szybka, podczas gdy dyfuzja ciężkich cząsteczek białka jest znacznie wolniejsza i wynosi mniej niż 1 μm w 1 ms. Różnica w stałej dyfuzji denaturanta i białka prowadzi do szybkiego rozcieńczenia denaturanta w strumieniu białka, co obniża jego efektywne stężenie wokół białka. Dżet białka przepływa ze stałą prędkością przez kanał obserwacyjny, a fluorescencję białka podczas fałdowania można obserwować za pomocą skanującego mikroskopu konfokalnego⁵.

Protokół

1. Wykonanie mikrofluidycznych chipów mieszających

Rycina 3 przedstawia podstawowe etapy wytwarzania.

1. Oczyść 4-calowe (100 mm) wafle z krzemionki topionej świeżym roztworem Piranha (3:1 H₂SO₄:H₂O₂): i) Podgrzej kwas siarkowy do 130 °C, a następnie wlej nadtlenek. Należy pamiętać, że chropowatość powierzchni i płaskość użytych wafli z krzemionki topionej odgrywają ważną rolę w końcowym etapie łączenia. ii) Zanurz wafle na co najmniej 30 minut. iii) Płucz wodą przez 5 minut i osusz. Nanieś powłokę z polikrzemu (poly) o grubości ~1 μm na każde zamierzone 10 μm głębokości końcowych kanałów mikrofluidycznych, korzystając z pieca do chemicznego osadzania z fazy gazowej przy niskim ciśnieniu (LPCVD).
2. Oczyść wafle i maskę zgodnie z protokołem Piranha opisanym w kroku 1.1. Maskę oczyść w ten sam sposób, a następnie przepłucz acetonem, metanolem i izopropanolem i natychmiast osusz strumieniem powietrza. Odwodnij wafle na płycie grzejnej w temperaturze 150 °C przez ~10 minut (użyj namiotu z folii aluminiowej, aby zapobiec osadzaniu się cząsteczek) lub w piekarniku w temperaturze 120 °C przez co najmniej 120 min (najlepiej przez noc). Aby zwiększyć adhezję fotorezystu, natychmiast poddaj ciepłe wafle działaniu oparów HMDS przez 5 minut. Na wafle nanieś metodą spin-coatingu warstwę fotorezystu AZ5214 o grubości ~900 nm i przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft bake) w temperaturze 90 °C bezpośrednio na płycie grzejnej przez 1 minutę lub w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 30 min (Rycina 3, krok 1).
3. Wyrównaj maskę i zapewnij twardy kontakt próżniowy. Naświetlaj światłem UV przez kilka sekund (całkowita energia: ~103 mJ/cm²) (Rycina 3, krok 2). Wywołaj za pomocą wywoływacza AZ400K, rozcieńczonego 4:1 wodą DI, przez ~50 sekund (aż fotorezyst zostanie całkowicie wywołany), delikatnie wstrząsając. Płucz wodą przez 2 minuty. Sprawdź strukturę pod mikroskopem (Rycina 3, krok 3). Jeśli struktury są słabo rozdzielone, usuń fotorezyst i zacznij ponownie od punktu 1.2. Przeprowadź końcowe wygrzewanie (hard bake) w 115 °C bezpośrednio na płycie grzejnej przez 2 minuty.
4. Usuń pozostałości organiczne (descum) z wafli za pomocą urządzenia Asher lub plazmy O₂ przez 2,5 minuty przy mocy RF 100 W. Używając głębokiego trawienia jonowego (DRIE), wytraw warstwę polikrzemu aż do leżącej pod nią krzemionki topionej. Usuń pozostały fotorezyst za pomocą zmywacza PRS2000 w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Przepłucz i osusz. Zmierz głębokość trawienia, aby upewnić się, że powłoka z polikrzemu została całkowicie przebita (Rycina 3, krok 4).
5. Używając DRIE zdolnego do trawienia tlenków, takiego jak trawacz ULVAC NLD-6000, wytraw krzemionkę topioną do głębokości ~10 μm na każdy mikron grubości powłoki z polikrzemu (Rycina 3, krok 5). Powłoka z polikrzemu będzie zużywana podczas trawienia, dlatego może być konieczne okresowe sprawdzanie integralności powłoki w trakcie procesu trawienia. Jeśli obszary powierzchni wafla, które celowo miały pozostać bez struktur, zostały całkowicie pozbawione ochronnej powłoki z polikrzemu podczas trawienia, powierzchnia prawdopodobnie uległa wżerom i nie będzie już nadawać się do łączenia w końcowych etapach produkcji. W takim przypadku wafel jest najprawdopodobniej niezdatny do użytku. Oczyść urządzeniem Matrix Asher przez 4 minuty przy mocy RF 100 W. Usuń polikrzem za pomocą trawacza XeF₂ (Rycina 3, krok 6). Może być konieczne powtórzenie kroku 1.4 oraz tego etapu kilka razy, aby usunąć wszystkie powłoki z fotorezystu i polikrzemu.
6. Nanieś na wafle metodą spin-coatingu nową warstwę fotorezystu o grubości ~1 μm, aby chronić kanały podczas dalszej obróbki. Wywierć otwory wlotowe i wylotowe w każdym chipie za pomocą sterowanego komputerowo wiertła z diamentową końcówką lub ręcznie za pomocą piaskarki (Rycina 3, krok 7). W przypadku użycia wiertła, zamocuj wafel (stroną ze strukturami do dołu) na pomocniczej płytce szklanej za pomocą Aqua Bond 55, dbając o to, by w spoiwie nie było pęcherzyków powietrza. Chłodź wiertło roztworem czyszczącym micro-90. Zapobiega to przywieraniu małych odłamków szkła do kanałów, co mogłoby spowodować zatkanie chipa podczas użytkowania.
7. Przepłucz wafel wodą DI, używając strzykawki do wstrzyknięcia wody do każdego otworu. Namocz w wodzie z mydłem przez godzinę. Usuń fotorezyst i Aqua Bond za pomocą PRS 2000 w 60 °C przez kilka godzin, aż powierzchnia będzie czysta. Przepłucz wafel wodą DI i ciepłą wodą z mydłem. Ponownie przepłucz każdy otwór strzykawką, unikając obszarów wytrawionych. Osusz wafel azotem i w piecu próżniowym ustawionym na 120 °C. Sprawdź otwory, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń, i w razie potrzeby powtórz etapy czyszczenia. Zmierz głębokość kanałów za pomocą optycznego lub mechanicznego profilometru powierzchni (Rycina 3, krok 8).
8. Oczyść wafle oraz odpowiednią liczbę pokrywek ze szkła topionego o grubości 170 μm za pomocą: 1) roztworu Piranha (1-2 godziny zgodnie z procedurą w 1.1), 2) roztworu RCA 2 (5:1:1 DI:HCl:H₂O₂) przez 10 minut w 75 °C, 3) roztworu RCA 1 (5:1:1 DI:NH₄OH:H₂O₂) przez 22 minuty w 75 °C). Płucz wodą DI przez 5 minut pomiędzy każdym roztworem.
9. Połóż jeden wafel stroną ze strukturami do góry na stosie 3-4 chusteczek do czystych pomieszczeń, umieszczonych na twardej, płaskiej powierzchni, np. małej szybie. Dokładnie osusz wafel gazem azotowym przez co najmniej 5 minut. Powtórz czynność z pokrywką szklaną. Chwyć pokrywkę za krawędź i odwróć ją tak, aby polerowana strona była skierowana w dół nad waflem, a następnie wyrównaj płaskie krawędzie. Ostrożnie opuść pokrywkę na wafel i poczekaj, aż osiądzie. Przesuwaj ją wyłącznie poziomo, aby skorygować wyrównanie. Naciśnij jednym palcem w centrum wafla. Powinien pojawić się front łączenia rozprzestrzeniający się na zewnątrz. W razie potrzeby wywrzyj dodatkowy nacisk w innych miejscach wokół wafla, aby przesunąć front łączenia (Rycina 3, krok 9).
10. Umieść scalone wafle w piecu wysokotemperaturowym, ustawiając rampę wzrostu temperatury od temperatury pokojowej do 800 °C w ciągu 3 godzin, a następnie od 800 do 1100 °C w ciągu kolejnych 1,2 godziny. Utrzymuj temperaturę 1100 °C przez 2 godziny, a następnie obniżaj ją do temperatury pokojowej w ciągu kolejnych 1,5 godziny.
11. Potnij wafle za pomocą piły do wafli na poszczególne chipy (Rycina 3, krok 10).
12. Protokół opisuje wykonanie kanałów w dość nietypowym podłożu z krzemionki topionej, co jest niezbędne do detekcji UV. Protokół ten można jednak zaadaptować do podłoża krzemowego, które wymaga tylko jednego etapu trawienia². Pokrywkę szklaną (ale nie z krzemionki topionej) można połączyć z waflem za pomocą łączenia anodowego.

2. Montaż i ładowanie chipów

1. Kolektor do utrzymania chipa mieszającego i roztworów może być wykonany z tworzywa sztucznego, takiego jak Lexan lub Plexiglas, lub z aluminium w celu kontroli temperatury (patrz Rysunek 4). W przypadku zastosowania aluminium zbiorniki z roztworami powinny być powleczone parylenem, aby zapobiec rozpuszczaniu aluminium przez roztwory soli w zbiornikach. Temperaturą całego kolektora, roztworów i chipa można sterować za pomocą urządzeń termoelektrycznych zamontowanych po bokach oraz sterownika elektronicznego.
2. Chip jest łączony z kolektorem za pomocą małych o-ringów i utrzymywany na miejscu pierścieniem mocującym, który zapewnia wyraźny wgląd optyczny w środek chipa. Rowki pod o-ringi powinny być płytsze niż standardowo, aby zapewnić dobre dopasowanie bez wywierania zbyt dużego nacisku na chip, np. o-ring 002 powinien mieć głębokość 0.025". Po zamontowaniu chipa należy dodać roztwory do zbiorników centralnego i bocznych, dbając o usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza uwięzionych na dnie studni.
3. Ponieważ objętości stosowane w tym mieszalniku są bardzo małe, przepływem można sterować za pomocą ciśnienia powietrza przyłożonego nad studniami z roztworami. Rysunek 4 przedstawia kolektor ciśnieniowy połączony o-ringami z górną częścią kolektora chipa. Kolektor ciśnieniowy jest podłączony do sterowanych komputerowo przetworników ciśnienia, które mogą utrzymywać ciśnienie w zakresie od ~2-80 PSI. Chip został zaprojektowany w taki sposób, aby równe ciśnienia w kanałach centralnym i bocznych generowały około 100-krotną różnicę w liniowych prędkościach przepływu. Przy 20 PSI liniowa prędkość przepływu w kanale wylotowym wynosi ~1 m/s.
4. Należy umieścić kolektor na mikroskopie odwróconym i zbadać obszar mieszania za pomocą okularu lub wyjścia kamery. Latarka żarowa umieszczona na górze kolektora zapewni wystarczającą ilość światła. W kanale centralnym należy zastosować barwnik lub roztwór o wysokim współczynniku załamania światła (np. 6 M chlorku guanidyny), aby uwidocznić strumień.
5. Przy równym ciśnieniu w kanałach centralnym i bocznym strumień będzie trudny do zauważenia gołym okiem, dlatego należy zacząć od ciśnienia 0 PSI w kanale bocznym i powoli zwiększać je do wartości równej ciśnieniu w kanale centralnym. Jeśli jeden z kanałów bocznych jest zatkany, strumień zostanie pchnięty w stronę jednej ze ścianek kanału wylotowego. Jeśli pojawi się widoczny zator, można go usunąć, przykładając ciśnienie lub próżnię do kanału wylotowego za pomocą strzykawki.
6. Jeśli białko lub inny materiał organiczny zapcha chip, można go wyczyścić, namaczając go przez noc w roztworze Pirhana.

3. Gromadzenie danych

Rysunek 5 przedstawia podstawowy układ instrumentu optycznego.

1. Wprowadź skolimowany wiązkę lasera do mikroskopu klasy badawczej za pomocą lustra dichroicznego umieszczonego wewnątrz lub tuż na zewnątrz mikroskopu. Wyjustuj laser tak, aby ogniskowanie było widoczne w okularze lub na kamerze w pobliżu obszaru mieszania.
2. Fluorescencja białka w mieszalniku jest zbierana przez obiektyw i przesyłana przez lustro dichroiczne, a następnie ogniskowana przez soczewkę w otworze pinhole i obrazowana na liczniku fotonów. Skanuj chip za pomocą skanera piezoelektrycznego w osiach x i y, aby obrazować obszar mieszania (typowy skok wynosi 2 μm). Wybierz pozycję na strumieniu i skanuj w osiach x i z, aby znaleźć ognisko w pionowym centrum kanału. Głębia ostrości mikroskopu jest znacznie mniejsza niż głębokość kanału, a prędkość przepływu w kanale jest jednolita, z wyjątkiem obszaru w odległości 1 μm od ścianek. Zatem rozdzielczość czasowa obserwowanej fluorescencji jest określana przede wszystkim przez rozmiar plamki konfokalnej.
3. Skanuj poziomo w kanale wylotowym (typowy skok to 0,2 μm w poprzek strumienia i 2 μm wzdłuż strumienia) w przyrostach 100 μm wzdłuż strumienia, obserwując każdą pozycję przez ok. 1 ms (patrz Rysunek 6). Przesuń stolik mikroskopu o 80-90 μm wzdłuż strumienia, aby zarejestrować późniejsze punkty czasowe.
4. Alternatywnie światło może być wykrywane przez spektrograf i detektor CCD za lustrem dichroicznym, przy użyciu soczewki do ogniskowania światła na szczelinie wejściowej. Ponieważ zbieranie danych jest wolniejsze niż w przypadku licznika fotonów (1 sekunda na pozycję), zazwyczaj najpierw obrazuje się strumień za pomocą licznika fotonów, a następnie mierzy punkty wzdłuż strumienia za pomocą spektrografu (patrz Rysunek 7).
5. Dane z licznika fotonów są analizowane poprzez sumowanie 3-5 pikseli wokół strumienia w każdej pozycji, aby utworzyć wykres intensywności w funkcji odległości. Czas jest obliczany z odległości przy użyciu prędkości wyznaczonej na podstawie przyłożonych ciśnień (patrz Rysunek 8).
6. Dane ze spektrografu można analizować na kilka sposobów. W przypadku FRET można zsumować kanały oznaczone jako „donor” i „akceptor”, a następnie obliczyć stosunek bliskości E=I_A/(I_D+I_D) (patrz Rysunek 9). Alternatywnie można przeprowadzić dekompozycję wartości osobliwych (SVD), aby zbadać niezależne komponenty spektralne w czasie, takie jak przesunięcie w widmie emisji tryptofanu podczas zwijania się białka.
7. Odległość w kanale wylotowym można przeliczyć na czas, korzystając ze stałej prędkości przepływu wyznaczonej z ciśnienia przyłożonego do kanałów bocznych. W ciągu pierwszych 2 μm kanału wylotowego prędkość przepływu strumienia białka wzrasta ok. 100-krotnie, a czasy w tym obszarze muszą być obliczone za pomocą analizy elementów skończonych linii prądu (co daje czasy przedstawione na Rysunku 8). Przyspieszenie to powoduje przesunięcie o ok. 1-2 μs po tym, jak prędkość stanie się stała, co zazwyczaj można pominąć przy pomiarze kinetyki znacznie wolniejszej niż proces mieszania.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 6 przedstawia wykres konturowy natężenia w obszarze mieszania zmierzonego za pomocą licznika fotonów. Tło w kanale wylotowym poza strumieniem powinno być bliskie poziomowi szumów detektora i zazwyczaj nie jest odejmowane. Wyższe tło może wskazywać na niewłaściwe wyrównanie lub na to, że białko przykleja się do ścianek kanału. Strumień, który wydaje się załamany lub krzywy, zwłaszcza w pobliżu obszaru mieszania, wskazuje na niewłaściwe trawienie dysz.

Rysunek 7 przedstawia widma rozdzielone w czasie białka wiążącego acylo-koenzym A (ACBP) znakowanego barwnikami Alexa 488 i Alexa 647. Od tych danych odjęto tło, aby usunąć prąd ciemny oraz sygnał lasera. Sygnał tła zarejestrowano przy ciśnieniu kanału centralnego ustawionym na 0 PSI.

Czas mieszania można wyznaczyć poprzez pomiar szybkiej reakcji, która przebiega znacznie szybciej niż samo mieszanie, takiej jak gaszenie fluorescencji Trp przez KI lub zapadanie się jednoniciowego DNA, znakowanego barwnikami FRET, po dodaniu NaCl. Ponieważ strumień jest mniejszy niż rozdzielczość optyczna mikroskopu, w obszarze mieszania występuje znaczny spadek intensywności podczas formowania się strumienia. Tę odpowiedź aparatury można usunąć, wykonując pomiar kontrolny, w którym warunki roztworów nie ulegają zmianie. Rysunek 8 przedstawia stosunek eksperymentów z mieszaniem (do 400 mM KI) i bez mieszania dla fluorescencji N-acetylotryptofaniamidu. Linia wskazuje przewidywane stężenie KI z symulacji COMSOL. Czas mieszania, mierzony jako czas spadku stężenia o 80%, wynosi 8 μs.

Ponieważ dane są zbierane w przyrostach 100 μm wzdłuż 500 μm długiego kanału wylotowego, muszą one zostać złożone z wielu widoków. Pomiędzy widokami zdarzają się niekiedy niewielkie przesunięcia sygnału, prawdopodobnie wynikające z drobnych zmian ostrości podczas przesuwania chipa przez stolik mikroskopu. Przesuwając stolik o 80 lub 90 μm na widok, przesunięcia te można wyeliminować poprzez analizę nakładających się danych. Zazwyczaj dane zbiera się dla co najmniej dwóch szybkości przepływu, a następnie łączy się je, aby potwierdzić, że wszelkie zmiany sygnału wynikają z rzeczywistych zmian spektroskopowych w białku, a nie z efektów optycznych lub przepływowych. Rysunek 9 przedstawia zmiany FRET w białku ACBP po rozcieńczeniu denaturanta z 6 M do 0,06 M. Dane te nie wymagają eksperymentu kontrolnego, ponieważ FRET jest już wartością stosunku, a odpowiedź urządzenia została już usunięta. Gwałtowny skok w pobliżu T=0 reprezentuje szybką zmianę sygnału FRET w czasie mieszania.

Rycina 1. Układ obszaru mieszania pomierzony za pomocą mikroskopii elektronowej.

Rycina 2. Schemat mieszania hydrodynamicznego w badaniach zwijania białek. Białko, rozpuszczone w wysokim stężeniu denaturanta w celu jego rozwinięcia, przepływa przez kanał środkowy w kierunku obszaru mieszania, gdzie spotyka się z buforem płynącym około 100 razy szybciej. Przepływ laminarny wymusza uformowanie strumienia białka w wąski dżet, z którego cząsteczki denaturanta mogą szybko dyfundować. Podczas przepływu dżetu przez kanał wylotowy, białko może być obserwowane z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

Rycina 3. Wytwarzanie z krzemionki topionej. 1) Proces rozpoczyna się od silnie wypolerowanego podłoża z krzemionki topionej o grubości 500 μm (a), na których górnej i dolnej powierzchni osadzono warstwę polikrzemu (poly) (b), a następnie naniesiono metodą spin-coatingu warstwę fotorezystu (c). 2) Fotomaska (e) zostaje dociśnięta do wafla, a fotorezyst zostaje naświetlony światłem UV (d). 3) Wafel umieszcza się w kąpieli wywołującej, co pozwala na ujawnienie wzoru w fotorezyście. 4) Wafel umieszcza się w urządzeniu DRIE, a elementy są trawione w górnej powłoce polikrzemu. Następnie fotorezyst zostaje usunięty. 5) Polikrzem pełni następnie rolę maski, gdy wafel zostaje umieszczony w trawaczu tlenków, a elementy są trawione na głębokość 10 - 40 μm w podłożu z krzemionki topionej. 6) Powłoka polikrzemu zostaje następnie usunięta w trawaczu XeF₂. 7) Wafel zostaje przyklejony do poświęcalnej płytki szklanej za pomocą uszczelniacza aktywowanego termicznie (g), stroną z elementami do dołu, a diamentowy wiertło (f) wykonuje otwory przelotowe metodą ścierną od strony tylnej. 8) Profilometr powierzchniowy (h) bezpośrednio mierzy głębokość wytrawionych elementów. 9) Wafel z przykrywki z krzemionki topionej o grubości 170 μm zostaje bezpośrednio przyklejony do górnej powierzchni wafla. 10) Wafel zostaje pocięty na pojedyncze chipy mikroprzepływowe.

Rycina 4. Kolektor mieszacza. Chip mikrofluidyczny jest przymocowany do kolektora roztworów za pomocą obrobionej aluminiowej płyty czołowej i czterech pierścieni O-ring pod zbiornikami o pojemności ~200 μL. W centrum kolektora, bezpośrednio nad obszarem mieszania przymocowanego chipu mikrofluidycznego, wywiercono duży otwór, który pozwala na ucieczkę nadmiaru światła UV bez rozpraszania wstecznego, co zapobiega autofluorescencji samego kolektora i umożliwia bezpośrednie oświetlenie chipu widoczne dla oka lub kamery w celu wyrównania. Kolektor powietrza uszczelnia każdy z zbiorników w taki sposób, aby ciśnienie powietrza w każdym z nich mogło być kontrolowane za pomocą zewnętrznego sterownika ciśnienia.

Rycina 5. Schemat konfokalnego mikroskopu optycznego.

Rycina 6. Wykres konturowy fluorescencji tryptofanu w mikromieszaczu płynowym. Obszar mieszania znajduje się na poziomie ~90 μm na osi y.

Rycina 7. Zależne od czasu widma fluorescencji zarejestrowane w mieszalniku. Zielony i czerwony prostokąt wskazują odpowiednio długości fal wyznaczone jako kanały donora i akceptora.

Rycina 8. Czas mieszania pomierzony za pomocą wygaszania fluorescencji tryptofanu przez jodek potasu (punkty i oś prawa) oraz obliczony metodą analizy elementów skończonych (linia i oś lewa).

Rysunek 9. Zmiany FRET mierzone podczas zwijania białka ACBP. Szybki wzrost w pobliżu t=0 reprezentuje fazę gwałtowną w czasie mieszania, a wolniejszy wzrost reprezentuje stopniową akumulację struktury w miarę zwijania się białka. Dane zostały zebrane przy dwóch różnych prędkościach przepływu i nałożone na siebie, co doprowadziło do różnej gęstości pomiarów w różnych punktach czasowych.

Dyskusja

Szybkie mieszanie od wielu lat stanowi cel rozwojowy w dziedzinie zwijania białek, ponieważ od dawna wiadomo, że procesy molekularne biomolekuł zachodzą w skalach czasowych od pikosekund do sekund. Konwencjonalne mieszalniki typu stopped-flow mają martwe czasy rzędu 1-5 ms, co wynika przede wszystkim z turbulencji. W ciągu ostatnich 15 lat niewielka liczba grup opracowała turbulentne mieszalniki przepływowe z czasami mieszania wynoszącymi 30-300 μs, jednak zazwyczaj wymagają one wysokich prędkości przepływu do osiągnięcia takich czasów mieszania, co wiąże się z dużym zużyciem próbek^6-8.

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikrofluidycznych chipów mieszających w celu uzyskania szybkiego rozcieńczenia w reżimie przepływu laminarnego. Praca w tym reżimie niesie ze sobą wiele zalet, z których główną jest możliwość precyzyjnej symulacji całego procesu mieszania, co pozwala na modyfikację odpowiedzi mieszania. Mieszalniki typu T opracowane przez inne grupy o prostych geometriach wykazały czasy mieszania rzędu 100-200 μs, co było ograniczone przede wszystkim rozmiarem kanałów^9-10. Poprzez zmniejszenie rozmiaru kanałów do 10 μm Knight zredukował czas mieszania do ~10 μs¹¹. Yao i Bakajin wykazali, że niewielkie zmiany w geometrii mogą prowadzić do znacznej poprawy czasu mieszania⁴. Praca ta wykazała jednak, że przyspieszenie mieszania może prowadzić również do wystąpienia wolniejszych faz. Konstrukcja zastosowana w niniejszej pracy^12-13 stanowi kompromis między dwoma najlepszymi projektami z referencji⁴, mający na celu zminimalizowanie wolniejszego wykładniczego spadku stężenia denaturantu oraz zwiększenie powtarzalności struktur podczas trawienia DRIE.

W dziedzinie ultraszybkiego mieszania istniały pewne kontrowersje dotyczące definicji czasu mieszania. Ważne jest rozróżnienie między „czasem mieszania” a „czasem martwym”. Czas martwy w mieszalniku turbulentnym definiuje się jako czas, w którym nie można dokonać pomiaru, i w rzeczywistości może on być znacznie dłuższy niż rzeczywisty czas mieszania. Jest on zazwyczaj wyznaczany poprzez wykonanie kilku pomiarów reakcji bimolekularnej rzekomego pierwszego rzędu (takiej jak gaszenie fluorescencji tryptofanu przez N-bromosuccynian) przy różnych stężeniach. Obserwowane wygaszania wykładnicze są dopasowywane tak, aby zbiegały się w jednej wartości przyjętej za t=0 s, a czas między tym punktem a pierwszym zmierzonym punktem stanowi czas martwy. W przypadku mieszalników o przepływie laminarnym pomiary mogą być wykonywane w trakcie procesu mieszania, zatem nie występuje czas martwy, a jedynie czas mieszania. Czas mieszania to po prostu czas potrzebny na połączenie dwóch roztworów do osiągnięcia wystarczającej jednorodności. Wcześniej definiowaliśmy czas mieszania jako czas 90/10, czyli czas, w którym stężenie denaturanta spada z 90% do 10% wartości początkowej (przed zmieszaniem). Jednak kształt krzywej mieszania nie jest idealnie symetryczny, a końcowy etap wygaszania wykazuje niewielką składową wykładniczą. Co więcej, zwijanie białek wykazuje silną nieliniową zależność od stężenia denaturanta, tak że proces zwijania może często rozpocząć się nawet wtedy, gdy stężenie denaturanta zostanie zredukowane tylko dwukrotnie. Dlatego w ostatnim czasie zdefiniowaliśmy czas mieszania jako czas potrzebny do zredukowania stężenia denaturanta o 80%. Oczywiście, w zależności od wymagań eksperymentu, można stosować inne definicje.

Zastosowanie tego miksera do badania fałdowania białek konsekwentnie dostarcza zaskakujących wyników. Od dawna wiadomo, że fałdowanie cytochromu c oraz apomioglobiny przebiega w wielu etapach, a wczesne wyniki uzyskane przy użyciu mikserów przepływowych wykazały, że zapadanie struktury (collapse) następuje w skali czasu ~100 μs^10,14-15. Nasze pomiary wykonane tym mikserem wykazały istnienie co najmniej dwóch etapów w tej skali czasu: bardzo szybkiego, prawdopodobnie niespecyficznego zapadania (mierzonego przesunięciem widma fluorescencji Trp) w czasie mieszania, po którym następuje wolniejsza faza (mierzona wygaszaniem całkowitej emisji Trp), będąca prawdopodobnie pierwszym etapem formowania struktury natywnej⁵. Zaobserwowaliśmy również proces trwający 50 μs w domenie B1 białka L, co obala konwencjonalną interpretację, według której białko to fałduje się w modelu dwustanowym¹³.

Zaletą tego szybkiego miksera jest możliwość badania zwijania najszybciej zwijających się białek, które zazwyczaj można było mierzyć jedynie za pomocą instrumentów do skoków temperatury (T-jump) w skali nanosekundowej. Metoda T-jump zazwyczaj wymaga obserwacji relaksacji zwijania/rozwijania w pobliżu temperatury topnienia białka, przez co nigdy nie pozwala na śledzenie zwijania całej populacji. Za pomocą tego miksera zbadaliśmy zwijanie represora γ (λ^6-86) przy użyciu całkowitej emisji Trp oraz przesunięcia widmowego, co dostarczyło dowodów na to, że białko to nie posiada bariery zwijania w silnych warunkach sprzyjających zwijaniu, które nie były dostępne dla wcześniejszych pomiarów T-jump¹². Na koniec zmierzyliśmy zwijanie fragmentu głowowego villiny HP-35, jednego z najszybciej zwijających się białek, jakie dotychczas zmierzono, i stwierdziliśmy, że szybkość zwijania mierzona po zmieszaniu jest około 5 razy wolniejsza niż mierzona metodą T-jump w tych samych warunkach¹⁶. Sugeruje to, że kinetyka zwijania zależy od warunków początkowych, co podważa główne założenie w tej dziedzinie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fotorezyst AZ P4110	AZ Electronic Materials
Wywoływacz AZ 400 K	AZ Electronic Materials
Zmywacz fotorezystu Baker PRS 2000	Avantor Performance Materials
AquaBond	AquaBond Technologies	AquaBond 55
Wafer pokrywowy 500 μm	SENSOR Prep Services		: 100 mm ± 0.5 mm Grubość: 0.5 mm ± 0.025 mm Tolerancje standardowe (chyba że zaznaczono inaczej) Wykończenie powierzchni: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Krawędzie płaskie: jedna główna SEMI-STD, jedna pomocnicza Czysty i polerowany z obu stron
Wafer pokrywowy 170 μm	SENSOR Prep Services	Wafery 7980 2G	: 100 mm ± 0.5 mm Grubość: 0.17 mm ± 0.025 mm Tolerancje standardowe (chyba że zaznaczono inaczej) Wykończenie powierzchni: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Krawędzie płaskie: jedna główna SEMI-STD, jedna pomocnicza Czysty i polerowany z obu stron
Urządzenie do głębokiego trawienia jonowego dla tlenków	ULVAC	ULVAC NL-6000
Laser jonowy argonowy	Cambridge Laser Laboratories	Lexel 95-SHG	λ=258 nm
Laser jonowy argonowy	Melles Griot		λ=488 nm
Mikroskop	Olympus Corporation	IX-51
Obiektyw mikroskopu	Thorlabs Inc.	OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA	λ= 258 nm
Obiektyw mikroskopu	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW 1.2 NA	λ=488 nm
Nanopozycjoner	Mad City Labs	Nano-LP100
Zmotoryzowany stół translacyjny	Semprex Corp	KL-Series 12-6436
Licznik fotonów GaAsP	Hamamatsu Corp.	H7421-40
Monochromator	Horiba Instruments Inc	MicroHR
Kamera CCD	Andor	iDus 420A-BU
Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505