Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Podsumowanie

W niniejszej pracy wyjaśniamy sposób wykonania i zastosowania mikropłynnego mieszalnika zdolnego do mieszania dwóch roztworów w czasie ~8 μs. Demonstrujemy również wykorzystanie tych mieszalników w detekcji spektroskopowej z użyciem fluorescencji UV oraz fluorescencyjnego transferu energii w rezonansie (FRET).

Streszczenie

Proces, w którym białko zwija się do swojej natywnej konformacji, ma ogromne znaczenie dla biologii i zdrowia ludzi, a mimo to wciąż nie jest w pełni zrozumiały. Jedną z przyczyn tego stanu rzeczy jest fakt, że zwijanie odbywa się w bardzo szerokim zakresie czasowym, od nanosekund do sekund lub dłużej, w zależności od białka¹. Konwencjonalne miksery typu stopped-flow umożliwiły pomiar kinetyki zwijania począwszy od około 1 ms. Opracowaliśmy niedawno mikromieszalnik mikrofluidyczny, który rozcieńcza denaturant około 100-krotnie w czasie ~8 μs². W przeciwieństwie do miksera stopped-flow, urządzenie to pracuje w reżimie przepływu laminarnego, w którym nie występuje turbulencja. Brak turbulencji pozwala na precyzyjną symulację numeryczną wszystkich przepływów wewnątrz mieszalnika, wykazując doskonałą zgodność z wynikami eksperymentalnymi^3-4.

Przepływ laminarny uzyskuje się dla liczb Reynoldsa Re ≤100. W przypadku roztworów wodnych wymaga to geometrii w skali mikronowej. Używamy twardego podłoża, takiego jak krzem lub kwarc topiony, aby stworzyć kanały o szerokości 5-10 μm i głębokości 10 μm (patrz Rysunek 1). Najmniejsze wymiary, przy wlocie do obszaru mieszania, są rzędu 1 μm. Układ jest uszczelniany cienką szklaną przykrywką lub przykrywką z kwarcytu topionego w celu zapewnienia dostępu optycznego. Typowe całkowite liniowe prędkości przepływu wynoszą ~1 m/s, co daje Re~10, jednak zużycie białka wynosi zaledwie ~0,5 nL/s lub 1,8 μL/hr. Stężenie białka zależy od metody detekcji: dla fluorescencji tryptofanu typowe stężenie wynosi 100 μM (dla 1 Trp/białko), a dla FRET typowe stężenie wynosi ~100 nM.

Proces fałdowania jest inicjowany poprzez szybkie rozcieńczenie denaturanta z 6 M do 0,06 M chlorku guanidyny. Białko w wysokim stężeniu denaturanta przepływa przez kanał centralny i w obszarze mieszania spotyka się z obu stron z buforem bez denaturanta, który porusza się około 100 razy szybciej (patrz Rycina 2). Taka geometria powoduje szybkie zwężenie strumienia białka do wąskiego dżetu o szerokości około 100 nm. Dyfuzja lekkich cząsteczek denaturanta jest bardzo szybka, podczas gdy dyfuzja ciężkich cząsteczek białka jest znacznie wolniejsza i wynosi mniej niż 1 μm w 1 ms. Różnica w stałej dyfuzji denaturanta i białka prowadzi do szybkiego rozcieńczenia denaturanta w strumieniu białka, co obniża jego efektywne stężenie wokół białka. Dżet białka przepływa ze stałą prędkością przez kanał obserwacyjny, a fluorescencję białka podczas fałdowania można obserwować za pomocą skanującego mikroskopu konfokalnego⁵.

Protokół

1. Wytwarzanie mikroprzepływowych chipów do mieszania

Rysunek 3 przedstawia podstawowe etapy wykonania.

1. Oczyść 4-calowe (100 mm) wafle z krzemionki topionej świeżym roztworem Piranha (3:1 H₂SO₄:H₂O₂): i) Podgrzej kwas siarkowy do 130 °C, a następnie wlej nadtlenek. Należy pamiętać, że chropowatość powierzchni i płaskość użytych wafli z krzemionki topionej odgrywają istotną rolę w końcowym etapie łączenia. ii) Zanurz wafle na co najmniej 30 minut. iii) Płucz wodą przez 5 minut i wysusz. Nałóż powłokę z polikrzemu (poly) o grubości ~1 μm na każde planowane 10 μm głębokości końcowych kanałów mikrofluidycznych, korzystając z pieca do chemicznego osadzania z fazy gazowej przy niskim ciśnieniu (LPCVD).
2. Oczyść wafle i maskę zgodnie z protokołem Piranha opisanym w kroku 1.1. Maskę oczyść w ten sam sposób, a następnie wypłucz acetonem, metanolem i izopropanolem i natychmiast wysusz strumieniem powietrza. Odwodnij wafle na płycie grzejnej w temperaturze 150 °C przez ~10 minut (użyj namiotu z folii aluminiowej, aby zapobiec osadzaniu się cząstek) lub w piekarniku w temperaturze 120 °C przez co najmniej 120 min (najlepiej przez noc). Aby zwiększyć adhezję fotorezystu, natychmiast poddaj ciepłe wafle działaniu par HMDS przez 5 minut. Nałóż na wafle metodą spin-coatingu warstwę fotorezystu AZ5214 o grubości ~900 nm i przeprowadź wstępne wypiekanie (soft bake) w temperaturze 90 °C bezpośrednio na płycie grzejnej przez 1 minutę lub w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 30 min (Rysunek 3, krok 1).
3. Wyrównaj maskę i zapewnij twardy kontakt próżniowy. Naświetlaj światłem UV przez kilka sekund (całkowita energia: ~103 mJ/cm²) (Rysunek 3, krok 2). Wywołaj w wywoływaczu AZ400K, rozcieńczonym 4:1 wodąy dejonizowaną (DI), przez ~50 sekund (do pełnego wywołania fotorezystu), delikatnie wstrząsając. Płucz wodą przez 2 minuty. Sprawdź strukturę pod mikroskopem (Rysunek 3, krok 3). Jeśli struktury są słabo rozdzielone, usuń fotorezyst i powtórz proces od kroku 1.2. Przeprowadź końcowe wypiekanie (hard bake) w temperaturze 115 °C bezpośrednio na płycie grzejnej przez 2 minuty.
4. Usuń pozostałości organiczne (descum) z wafli za pomocą urządzenia Asher lub plazmy O₂ przez 2,5 minuty przy mocy RF 100 W. Używając głębokiego trawienia jonowego (DRIE), wytraw warstwę polikrzemu całkowicie aż do znajdującej się poniżej krzemionki topionej. Usuń pozostały fotorezyst za pomocą zmywacza PRS2000 w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Wypłucz i wysusz. Zmierz głębokość trawienia, aby upewnić się, że powłoka z polikrzemu została całkowicie przebita (Rysunek 3, krok 4).
5. Używając urządzenia DRIE zdolnego do trawienia tlenków, np. trawienia ULVAC NLD-6000, wytraw krzemionkę topioną do głębokości ~10 μm na każdy mikron grubości powłoki z polikrzemu (Rysunek 3, krok 5). Powłoka z polikrzemu będzie ulegać zużyciu podczas trawienia, dlatego może być konieczne okresowe sprawdzanie integralności powłoki w trakcie procesu. Jeśli obszary wafla, które zamierzało się pozostawić gładkimi, zostały odsłonięte poprzez całkowite usunięcie ochronnej powłoki z polikrzemu podczas trawienia, powierzchnia najprawdopodobniej uległa wżerom i nie będzie już nadawała się do łączenia w końcowych etapach produkcji. W takim przypadku wafel jest najpewniej nieużyteczny. Oczyść urządzeniem Matrix Asher przez 4 minuty przy mocy RF 100 W. Usuń polikrzem za pomocą trawienia XeF₂ (Rysunek 3, krok 6). Może być konieczne powtórzenie kroku 1.4 oraz tego etapu kilka razy, aby usunąć wszystkie fotorezysty i powłoki z polikrzemu.
6. Nałóż na wafle metodą spin-coatingu nową warstwę fotorezystu o grubości ~1 μm, aby chronić kanały podczas dalszej obróbki. Wywierć otwory wejściowe i wyjściowe w każdym chipie, używając komputerowo sterowanego wiertła z diamentową końcówką lub ręcznie za pomocą piaskarki (Rysunek 3, krok 7). W przypadku użycia wiertła, zamocuj wafel (stroną ze strukturami do dołu) na poświęcalnej płytce szklanej za pomocą Aqua Bond 55, dbając o to, aby w spoiwie nie było pęcherzyków powietrza. Chłodź wiertło roztworem czyszczącym micro-90. Zapobiega to przywieraniu małych kawałków szkła do kanałów, co mogłoby doprowadzić do zapchania chipa podczas użytkowania.
7. Wypłucz wafel wodą DI, używając strzykawki do wstrzyknięcia wody do każdego otworu. Moczy w wodzie z mydłem przez godzinę. Usuń fotorezyst i Aqua Bond za pomocą PRS 2000 w temperaturze 60 °C przez kilka godzin, aż powierzchnia będzie czysta. Wypłucz wafel wodą DI i ciepłą wodą z mydłem. Ponownie wypłucz każdy otwór strzykawką, unikając obszarów wytrawionych. Wysusz wafel azotem i w piekarniku próżniowym ustawionym na 120 °C. Sprawdź otwory, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń, i w razie potrzeby powtórz kroki czyszczenia. Zmierz głębokość kanałów za pomocą optycznego lub mechanicznego profilometru (Rysunek 3, krok 8).
8. Oczyść wafle oraz odpowiednią liczbę pokrywek ze krzemionki topionej o grubości 170 μm za pomocą: 1) roztworu Piranha (1-2 godziny zgodnie z procedurą w 1.1), 2) roztworu RCA 2 (5:1:1 DI:HCl:H₂O₂) przez 10 minut w 75 °C, 3) roztworu RCA 1 (5:1:1 DI:NH₄OH:H₂O₂) przez 22 minuty w 75 °C. Płucz wodą DI przez 5 minut pomiędzy każdym roztworem.
9. Połóż jeden wafel stroną ze strukturami do góry na stosie 3-4 chusteczek do czystych pomieszczeń (cleanroom wipes) umieszczonych na twardej, płaskiej powierzchni, np. na małej szybie. Dokładnie wysusz wafel azotem przez co najmniej 5 minut. Powtórz czynność z pokrywką szklaną. Podnieś pokrywkę za krawędź i odwróć ją tak, aby polerowana strona była skierowana w dół nad waflem, a następnie wyrównaj krawędzie. Ostrożnie opuść pokrywkę na wafel i pozwól jej osiąść. Przesuwaj ją tylko poziomo w celu korekty wyrównania. Dociśnij jednym palcem w centrum wafla. Powinien pojawić się front łączenia rozszerzający się na zewnątrz. W razie potrzeby zastosuj dodatkowy nacisk w innych miejscach wokół wafla, aby posunąć front łączenia do przodu (Rysunek 3, krok 9).
10. Umieść zapieczętowane wafle w piekarniku wysokotemperaturowym, ustawiając program rampy od temperatury pokojowej do 800 °C w ciągu 3 godzin, a następnie od 800 do 1100 °C przez kolejne 1,2 godziny. Wytrzymaj w temperaturze 1100 °C przez 2 godziny, a następnie schładzaj do temperatury pokojowej przez kolejne 1,5 godziny.
11. Potnij wafle na poszczególne chipy za pomocą piły do cięcia wafli (Rysunek 3, krok 10).
12. Protokół opisuje wytwarzanie kanałów w dość nietypowym podłożu z krzemionki topionej, które jest niezbędne do detekcji UV. Jednak protokół ten można zaadaptować dla podłoża krzemowego, które wymaga jedynie jednego etapu trawienia². Pokrywkę szklaną (ale nie z krzemionki topionej) można przyłączyć do wafla za pomocą łączenia anodowego.

2. Montaż i ładowanie chipów

1. Kolektor do mocowania chipa mieszającego i roztworów może być wykonany z tworzywa sztucznego, takiego jak Lexan lub Plexiglas, lub z aluminium w celu kontroli temperatury (patrz Rysunek 4). W przypadku zastosowania aluminium, zbiorniki na roztwory powinny być powleczone parylenem, aby zapobiec rozpuszczaniu aluminium przez roztwory soli znajdujące się w zbiornikach. Temperaturą całego kolektora, roztworów i chipa można sterować za pomocą urządzeń termoelektrycznych zamontowanych po bokach oraz sterownika elektronicznego.
2. Chip jest łączony z kolektorem za pomocą małych o-ringów i utrzymywany na miejscu pierścieniem zabezpieczającym, który zapewnia niezakłócony wgląd optyczny w centrum chipa. Rowki na o-ringi powinny być płytsze niż standardowe, aby zapewnić dobre dopasowanie bez wywierania zbyt dużego nacisku na chip, np. o-ring 002 powinien mieć głębokość 0,025". Po zamontowaniu chipa należy dodać roztwory do zbiorników centralnego i bocznych, dbając o usunięcie pęcherzyków powietrza uwięzionych na dnie studni.
3. Ponieważ objętości stosowane w tym mieszalniku są bardzo małe, przepływem można sterować za pomocą ciśnienia powietrza przykładanego nad studniami z roztworami. Rysunek 4 przedstawia kolektor ciśnieniowy połączony z górną częścią kolektora chipa za pomocą o-ringów. Kolektor ciśnieniowy jest podłączony do sterowanych komputerowo przetworników ciśnienia, które mogą utrzymywać ciśnienie od ~2-80 PSI. Chip został zaprojektowany w taki sposób, aby równe ciśnienia w kanałach centralnym i bocznych generowały około 100-krotną różnicę w liniowych prędkościach przepływu. Przy 20 PSI liniowa prędkość przepływu w kanale wylotowym wynosi ~1 m/s.
4. Umieść kolektor na mikroskopie odwróconym i obejrzyj obszar mieszania za pomocą okularu lub wyjścia z kamery. Latarka żarowa umieszczona na górze kolektora zapewni wystarczającą ilość światła. Aby zobaczyć strumień, w kanale centralnym należy zastosować barwnik lub roztwór o wysokim współczynniku załamania światła (np. 6 M chlorowodorku guanidyny).
5. Przy równym ciśnieniu w kanałach centralnym i bocznych strumień będzie trudny do dostrzeżenia gołym okiem, dlatego należy rozpocząć od ciśnienia w kanale bocznym wynoszącego 0 PSI i powoli zwiększać je do poziomu równego ciśnieniu w kanale centralnym. Jeśli jeden z kanałów bocznych jest zatkany, strumień zostanie pchnięty w stronę jednej ze ścianek kanału wylotowego. Jeśli pojawi się widoczny zator, można go usunąć, przykładając ciśnienie lub próżnię do kanału wylotowego za pomocą strzykawki.
6. Jeśli białka lub inny materiał organiczny zatkają chip, można go wyczyścić poprzez namoczenie w roztworze Pirhana przez całą noc.

3. Gromadzenie danych

Rysunek 5 przedstawia podstawowy schemat instrumentu optycznego.

1. Wprowadź skolimowaną wiązkę lasera do mikroskopu klasy badawczej za pomocą lustra dichroicznego umieszczonego wewnątrz lub tuż na zewnątrz mikroskopu. Ustaw laser tak, aby ognisko było widoczne w okularze lub na kamerze w pobliżu obszaru mieszania.
2. Fluorescencja białka w mieszalniku jest zbierana przez obiektyw i kierowana przez lustro dichroiczne, a następnie skupiana przez soczewkę na otworze zwężającym (pinhole) i obrazowana na liczniku fotonów. Skanuj chip za pomocą skanera piezoelektrycznego w osiach x i y, aby uzyskać obraz obszaru mieszania (typowy skok wynosi 2 μm). Wybierz pozycję na strumieniu i skanuj w osiach x i z, aby znaleźć ognisko w centrum kanału w pionie. Głębia ostrości mikroskopu jest znacznie mniejsza niż głębokość kanału, a prędkość przepływu w kanale jest jednolita, z wyjątkiem obszaru w odległości 1 μm od ścianek. Zatem rozdzielczość czasowa obserwowanej fluorescencji jest określona przede wszystkim przez rozmiar plamki konfokalnej.
3. Skanuj poziomo wewnątrz kanału wylotowego (typowy skok to 0,2 μm w poprzek strumienia i 2 μm wzdłuż strumienia) w przyrostach 100 μm wzdłuż strumienia, obserwując każdą pozycję przez ok. 1 ms (patrz Rycina 6). Przesuń stolik mikroskopu o 80-90 μm wzdłuż strumienia, aby zarejestrować późniejsze punkty czasowe.
4. Alternatywnie światło można wykrywać za pomocą spektrografu i matrycy CCD po lustrze dichroicznym, stosując soczewkę do skupienia światła na szczelinie wejściowej. Ponieważ zbieranie danych jest wolniejsze niż w przypadku licznika fotonów (1 sekunda na pozycję), zazwyczaj najpierw obrazuje się strumień za pomocą licznika fotonów, a następnie mierzy punkty wzdłuż strumienia przy użyciu spektrografu (patrz Rycina 7).
5. Dane z licznika fotonów analizuje się poprzez sumowanie 3-5 pikseli wokół strumienia w każdej pozycji, aby utworzyć wykres intensywności w funkcji odległości. Czas oblicza się z odległości, wykorzystując prędkość wyznaczoną na podstawie przyłożonych ciśnień (patrz Rycina 8).
6. Dane ze spektrografu można analizować na kilka sposobów. W przypadku FRET można zsumować kanały określone jako „donor” i „akceptor”, a następnie obliczyć stosunek bliskości E=I_A/(I_D+I_D) (patrz Rycina 9). Alternatywnie można przeprowadzić rozkład według wartości osobliwych (SVD), aby zbadać niezależne składowe widmowe w czasie, np. przesunięcie w widmie emisji tryptofanu podczas zwijania się białka.
7. Odległość w kanale wylotowym można przeliczyć na czas, korzystając ze stałej prędkości przepływu wyznaczonej z ciśnienia przyłożonego do kanałów bocznych. W ciągu pierwszych 2 μm kanału wylotowego prędkość przepływu strumienia białka wzrasta ok. 100-krotnie, a czasy w tym obszarze muszą zostać obliczone za pomocą analizy elementów skończonych linii prądu (co daje czasy przedstawione na Rycini 8). Przyspieszenie to powoduje przesunięcie o ok. 1-2 μs po osiągnięciu stałej prędkości, co zazwyczaj można pominąć przy pomiarze kinetyki znacznie wolniejszej niż proces mieszania.

4. Reprezentatywne wyniki

Rycina 6 przedstawia wykres konturowy natężenia w obszarze mieszania zmierzonego za pomocą licznika fotonów. Tło w kanale wylotowym poza strumieniem powinno być zbliżone do poziomu szumów detektora i zazwyczaj nie jest odejmowane. Wyższe tło może wskazywać na niewłaściwe ustawienie lub na to, że białko przywiera do ścianek kanału. Strumień, który wydaje się załamany lub skrzywiony, zwłaszcza w pobliżu obszaru mieszania, świadczy o niewłaściwym trawieniu dysz.

Rycina 7 przedstawia spektra rozdzielone w czasie dla białka wiążącego acylo-koenzym A (ACBP) znakowanego barwnikami Alexa 488 i Alexa 647. Od tych danych odjęto tło, aby usunąć prąd ciemny i sygnał laserowy. Sygnał tła zarejestrowano przy ciśnieniu w kanale centralnym ustawionym na 0 PSI.

Czas mieszania można wyznaczyć poprzez pomiar szybkiej reakcji, która przebiega znacznie szybciej niż proces mieszania, takiej jak gaszenie fluorescencji Trp przez KI lub kolaps jednoniciowego DNA, znakowanego barwnikami FRET, po dodaniu NaCl. Ponieważ strumień jest mniejszy niż rozdzielczość optyczna mikroskopu, w obszarze mieszania następuje znaczny spadek intensywności w momencie formowania się strumienia. Tę odpowiedź instrumentu można wyeliminować, wykonując pomiar kontrolny, w którym warunki roztworu nie ulegają zmianie. Rysunek 8 przedstawia stosunek eksperymentów z mieszaniem (do 400 mM KI) i bez mieszania fluorescencji N-acetylo-tryptofanu amidu. Linia wskazuje przewidywane stężenie KI z symulacji COMSOL. Czas mieszania, mierzony jako czas potrzebny do spadku stężenia o 80%, wynosi 8 μs.

Ponieważ dane są zbierane w przyrostach 100 μm wzdłuż kanału wylotowego o długości 500 μm, dane z wielu widoków muszą zostać ze sobą połączone. Pomiędzy widokami zdarzają się niewielkie przesunięcia sygnału, wynikające prawdopodobnie z niewielkich zmian ostrości podczas przesuwania chipa przez stolik mikroskopu. Przesuwając stolik o 80 lub 90 μm na widok, przesunięcia te można wyeliminować poprzez analizę nakładających się danych. Zazwyczaj dane są zbierane przy co najmniej dwóch prędkościach przepływu, a następnie łączone, aby potwierdzić, że wszelkie zmiany sygnału wynikają z rzeczywistych zmian spektroskopowych w białku, a nie z efektów optycznych lub przepływowych. Rycina 9 przedstawia zmiany FRET w białku ACBP po rozcieńczeniu denaturanta z 6 M do 0,06 M. Dane te nie wymagają eksperymentu kontrolnego, ponieważ FRET jest już wartością stosunku, a odpowiedź instrumentu została już usunięta. Gwałtowny skok w okolicach T=0 reprezentuje szybką zmianę sygnału FRET w czasie mieszania.

Rycina 1. Układ obszaru mieszania pomierzony za pomocą mikroskopii elektronowej.

Rycina 2. Schemat mieszania hydrodynamicznego w badaniach fałdowania białek. Białko, rozpuszczone w wysokim stężeniu denaturanta w celu jego rozfałdowania, przepływa środkowym kanałem w stronę obszaru mieszania, gdzie spotyka się z buforem przepływającym około 100 razy szybciej. Przepływ laminarny wymusza uformowanie się strumienia białka w postaci wąskiego dżetu, z którego cząsteczki denaturanta mogą szybko dyfundować. Podczas przepływu dżetu kanałem wylotowym, białko może być obserwowane z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

Rysunek 3. Wytwarzanie z kwarcowego szkła topionego. 1) Proces rozpoczyna się od wysokopolerowanego podłoża z kwarcowego szkła topionego o grubości 500 μm (a), na którego górnej i dolnej powierzchni naniesiono warstwę polikrzemu (poly) (b), a następnie pokryto warstwą fotorezystu metodą spin-coatingu (c). 2) Fotomaska (e) zostaje dociśnięta do wafla, a fotorezyst zostaje naświetlony światłem UV (d). 3) Wafla umieszcza się w kąpieli wywoływacza, co pozwala na ujawnienie wzoru w fotorezyście. 4) Wafla umieszcza się w urządzeniu DRIE, gdzie struktury zostają wytrawione w górnej warstwie poly. Następnie usuwa się fotorezyst. 5) Warstwa poly służy następnie jako maska podczas umieszczenia wafla w trawaczu tlenków, gdzie struktury są trawione na głębokość 10 - 40 μm w podłożu z kwarcowego szkła topionego. 6) Warstwa poly zostaje następnie usunięta w trawaczu XeF₂. 7) Wafer zostaje przyklejony do poświęcalnej płytki szklanej za pomocą uszczelniacza aktywowanego termicznie (g), stroną ze strukturami do dołu, a wiertłem diamentowym (f) wiercone są otwory przelotowe od strony tylnej. 8) Profilometr powierzchniowy (h) bezpośrednio mierzy głębokość wytrawionych struktur. 9) Wafer z przykrywki z kwarcowego szkła topionego o grubości 170 μm zostaje bezpośrednio przyklejony do górnej powierzchni wafla. 10) Wafer zostaje pocięty na pojedyncze chipy mikroprzepływowe.

Rycina 4. Kolektor miksera. Chip mikropłynny jest przymocowany do kolektora roztworów za pomocą obrobionej aluminiowej płyty czołowej i czterech pierścieni O-ring pod zbiornikami o pojemności ~200 μL. W centrum kolektora, bezpośrednio nad obszarem mieszania przymocowanego chipa mikropłynnego, wywiercono duży otwór, który umożliwia ucieczkę nadmiaru światła UV bez rozpraszania wstecznego, co zapobiega autofluorescencji samego kolektora i pozwala na bezpośrednie oświetlenie chipa w celu jego wyrównania przy użyciu oka lub kamery. Kolektor powietrza uszczelnia każdy z zbiorników w taki sposób, aby ciśnienie powietrza w każdym z nich można było kontrolować za pomocą zewnętrznego modułu sterowania ciśnieniem.

Rycina 5. Schemat optycznego mikroskopu konfokalnego.

Rysunek 6. Wykres konturowy fluorescencji tryptofanu w mikroprzemieszajniku. Obszar mieszania znajduje się na wysokości ~90 μm na osi y.

Rysunek 7. Zależne od czasu widma fluorescencji zarejestrowane w mieszalniku. Zielone i czerwone prostokąty wskazują odpowiednio długości fal wyznaczonych jako kanały donora i akceptora.

Rycina 8. Czas mieszania mierzony metodą gaszenia fluorescencji tryptofanu przez jodek potasu (punkty i oś prawa) oraz obliczony za pomocą analizy elementów skończonych (linia i oś lewa).

Rycina 9. Zmiany FRET mierzone podczas zwijania białka ACBP. Gwałtowny wzrost w pobliżu t=0 reprezentuje fazę burst w czasie mieszania, a wolniejszy wzrost odzwierciedla stopniowe formowanie struktury w miarę zwijania się białka. Dane zostały zebrane przy dwóch różnych prędkościach przepływu i nałożone na siebie, co doprowadziło do różnej gęstości pomiarów w różnych punktach czasowych.

Dyskusja

Szybkie mieszanie od wielu lat stanowi cel rozwojowy w dziedzinie zwijania białek, ponieważ od dawna wiadomo, że procesy molekularne biomolekuł zachodzą w skalach czasowych od pikosekund do sekund. Konwencjonalne mieszalniki typu stopped-flow mają martwe czasy rzędu 1-5 ms, co wynika przede wszystkim z turbulencji. W ciągu ostatnich 15 lat niewielka liczba grup opracowała turbulentne mieszalniki przepływowe z czasami mieszania wynoszącymi 30-300 μs, jednak zazwyczaj wymagają one wysokich prędkości przepływu do osiągnięcia takich czasów mieszania, co wiąże się z dużym zużyciem próbek^6-8.

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikrofluidycznych chipów mieszających w celu uzyskania szybkiego rozcieńczenia w reżimie przepływu laminarnego. Praca w tym reżimie niesie ze sobą wiele zalet, z których główną jest możliwość precyzyjnej symulacji całego procesu mieszania, co pozwala na modyfikację odpowiedzi mieszania. Mieszalniki typu T opracowane przez inne grupy o prostych geometriach wykazały czasy mieszania rzędu 100-200 μs, co było ograniczone przede wszystkim rozmiarem kanałów^9-10. Poprzez zmniejszenie rozmiaru kanałów do 10 μm Knight zredukował czas mieszania do ~10 μs¹¹. Yao i Bakajin wykazali, że niewielkie zmiany w geometrii mogą prowadzić do znacznej poprawy czasu mieszania⁴. Praca ta wykazała jednak, że przyspieszenie mieszania może prowadzić również do wystąpienia wolniejszych faz. Konstrukcja zastosowana w niniejszej pracy^12-13 stanowi kompromis między dwoma najlepszymi projektami z referencji⁴, mający na celu zminimalizowanie wolniejszego wykładniczego spadku stężenia denaturantu oraz zwiększenie powtarzalności struktur podczas trawienia DRIE.

W dziedzinie ultraszybkiego mieszania istniały pewne kontrowersje dotyczące definicji czasu mieszania. Ważne jest rozróżnienie między „czasem mieszania” a „czasem martwym”. Czas martwy w mieszalniku turbulentnym definiuje się jako czas, w którym nie można dokonać pomiaru, i w rzeczywistości może on być znacznie dłuższy niż rzeczywisty czas mieszania. Jest on zazwyczaj wyznaczany poprzez wykonanie kilku pomiarów reakcji bimolekularnej rzekomego pierwszego rzędu (takiej jak gaszenie fluorescencji tryptofanu przez N-bromosuccynian) przy różnych stężeniach. Obserwowane wygaszania wykładnicze są dopasowywane tak, aby zbiegały się w jednej wartości przyjętej za t=0 s, a czas między tym punktem a pierwszym zmierzonym punktem stanowi czas martwy. W przypadku mieszalników o przepływie laminarnym pomiary mogą być wykonywane w trakcie procesu mieszania, zatem nie występuje czas martwy, a jedynie czas mieszania. Czas mieszania to po prostu czas potrzebny na połączenie dwóch roztworów do osiągnięcia wystarczającej jednorodności. Wcześniej definiowaliśmy czas mieszania jako czas 90/10, czyli czas, w którym stężenie denaturanta spada z 90% do 10% wartości początkowej (przed zmieszaniem). Jednak kształt krzywej mieszania nie jest idealnie symetryczny, a końcowy etap wygaszania wykazuje niewielką składową wykładniczą. Co więcej, zwijanie białek wykazuje silną nieliniową zależność od stężenia denaturanta, tak że proces zwijania może często rozpocząć się nawet wtedy, gdy stężenie denaturanta zostanie zredukowane tylko dwukrotnie. Dlatego w ostatnim czasie zdefiniowaliśmy czas mieszania jako czas potrzebny do zredukowania stężenia denaturanta o 80%. Oczywiście, w zależności od wymagań eksperymentu, można stosować inne definicje.

Zastosowanie tego miksera do badania fałdowania białek konsekwentnie dostarcza zaskakujących wyników. Od dawna wiadomo, że fałdowanie cytochromu c oraz apomioglobiny przebiega w wielu etapach, a wczesne wyniki uzyskane przy użyciu mikserów przepływowych wykazały, że zapadanie struktury (collapse) następuje w skali czasu ~100 μs^10,14-15. Nasze pomiary wykonane tym mikserem wykazały istnienie co najmniej dwóch etapów w tej skali czasu: bardzo szybkiego, prawdopodobnie niespecyficznego zapadania (mierzonego przesunięciem widma fluorescencji Trp) w czasie mieszania, po którym następuje wolniejsza faza (mierzona wygaszaniem całkowitej emisji Trp), będąca prawdopodobnie pierwszym etapem formowania struktury natywnej⁵. Zaobserwowaliśmy również proces trwający 50 μs w domenie B1 białka L, co obala konwencjonalną interpretację, według której białko to fałduje się w modelu dwustanowym¹³.

Zaletą tego szybkiego miksera jest możliwość badania zwijania najszybciej zwijających się białek, które zazwyczaj można było mierzyć jedynie za pomocą instrumentów do skoków temperatury (T-jump) w skali nanosekundowej. Metoda T-jump zazwyczaj wymaga obserwacji relaksacji zwijania/rozwijania w pobliżu temperatury topnienia białka, przez co nigdy nie pozwala na śledzenie zwijania całej populacji. Za pomocą tego miksera zbadaliśmy zwijanie represora γ (λ^6-86) przy użyciu całkowitej emisji Trp oraz przesunięcia widmowego, co dostarczyło dowodów na to, że białko to nie posiada bariery zwijania w silnych warunkach sprzyjających zwijaniu, które nie były dostępne dla wcześniejszych pomiarów T-jump¹². Na koniec zmierzyliśmy zwijanie fragmentu głowowego villiny HP-35, jednego z najszybciej zwijających się białek, jakie dotychczas zmierzono, i stwierdziliśmy, że szybkość zwijania mierzona po zmieszaniu jest około 5 razy wolniejsza niż mierzona metodą T-jump w tych samych warunkach¹⁶. Sugeruje to, że kinetyka zwijania zależy od warunków początkowych, co podważa główne założenie w tej dziedzinie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fotorezyst AZ P4110	AZ Electronic Materials
Wywoływacz AZ 400 K	AZ Electronic Materials
Zmywacz fotorezystu Baker PRS 2000	Avantor Performance Materials
AquaBond	AquaBond Technologies	AquaBond 55
Wafer pokrywowy 500 μm	SENSOR Prep Services		: 100 mm ± 0.5 mm Grubość: 0.5 mm ± 0.025 mm Tolerancje standardowe (chyba że zaznaczono inaczej) Wykończenie powierzchni: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Krawędzie płaskie: jedna główna SEMI-STD, jedna pomocnicza Czysty i polerowany z obu stron
Wafer pokrywowy 170 μm	SENSOR Prep Services	Wafery 7980 2G	: 100 mm ± 0.5 mm Grubość: 0.17 mm ± 0.025 mm Tolerancje standardowe (chyba że zaznaczono inaczej) Wykończenie powierzchni: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Krawędzie płaskie: jedna główna SEMI-STD, jedna pomocnicza Czysty i polerowany z obu stron
Urządzenie do głębokiego trawienia jonowego dla tlenków	ULVAC	ULVAC NL-6000
Laser jonowy argonowy	Cambridge Laser Laboratories	Lexel 95-SHG	λ=258 nm
Laser jonowy argonowy	Melles Griot		λ=488 nm
Mikroskop	Olympus Corporation	IX-51
Obiektyw mikroskopu	Thorlabs Inc.	OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA	λ= 258 nm
Obiektyw mikroskopu	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW 1.2 NA	λ=488 nm
Nanopozycjoner	Mad City Labs	Nano-LP100
Zmotoryzowany stół translacyjny	Semprex Corp	KL-Series 12-6436
Licznik fotonów GaAsP	Hamamatsu Corp.	H7421-40
Monochromator	Horiba Instruments Inc	MicroHR
Kamera CCD	Andor	iDus 420A-BU
Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505