Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.
Artykuł metodologiczny
Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W badaniach biomedycznych niezbędne są nieniszczące, bezkontaktowe i bezetykietowe technologie do monitorowania kultur komórkowych i tkankowych.1-5 Jednak obecnie dostępne rutynowe metody wymagają etapów przetwarzania i zmieniają integralność próbek. Spektroskopia Ramana jest szybką metodą, która umożliwia pomiar próbek biologicznych bez konieczności przeprowadzania dalszych etapów obróbki. Ta oparta na laserach technologia wykrywa niespójne rozpraszanie światła monochromatycznego.6 Ponieważ każdemu drganiu chemicznemu przypisana jest konkretna pasmo Ramanowskie (liczba falowa w cm-1), każda próbka biologiczna charakteryzuje się typowym wzorcem widmowym wynikającym z jej wrodzonego składu biochemicznego.7-9 W widmach Ramana intensywność piku koreluje z ilością obecnych wiązań molekularnych.1 Podobieństwa i różnice w zbiorach danych spektralnych można wykryć, stosując analizę wielowymiarową (np. analizę głównych składowych (PCA)).10
W niniejszym materiale przeprowadzamy spektroskopię Ramanowską żywych komórek oraz tkanek natywnych. Przed pomiarem komórki są wysiewane na szalki z dna szklanego lub utrzymywane w zawiesinie w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO2). Tkanki natywne są preparowane i przechowywane w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w temperaturze 4 °C przed pomiarami. W zależności od konfiguracji eksperymentalnej skupialiśmy się na jądrze komórkowym lub białkach macierzy pozakomórkowej (ECM), takich jak elastyna i kolagen. we wszystkich badaniach mierzone jest minimum 30 komórek lub 30 losowych punktów zainteresowania w obrębie ECM. Etapy przetwarzania danych obejmowały odejmowanie tła oraz normalizację.
Protokół
1. Przygotowanie próbki biologicznej
- Przygotowanie żywych komórek
- Przygotowanie komórek adherentnych
- Wysiać komórki hodowane in vitro lub świeżo izolowane na szalkę z szklanym dnem (Greiner BioOne/Germany) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do całkowitego przylegania komórek.
- Usunąć pożywkę hodowlaną i przed pomiarem delikatnie przemyć trzy razy PBS. Przez cały czas trwania procedury pomiarowej komórki powinny być przykryte PBS lub pożywką hodowlaną.
- Przygotowanie komórek w zawiesinie
- Odłączyć komórki hodowane in vitro zgodnie z powszechnymi protokołami (np. trypsyna-EDTA, skrobanie komórek), odwirować komórki i ponownie zawiesić otrzymany osad komórkowy w PBS lub pożywce hodowlanej.
- Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej (stężenie: maks. 100,000 komórek/ml) na szalkę z szklanym dnem.
- Przygotowanie komórek adherentnych
- Przygotowanie tkanek natywnych
- Po pobraniu tkanek przenieść je do sterylnego, lodowatego PBS i przechowywać nie dłużej niż 12 godzin w temperaturze 4 °C lub w lodzie przed pomiarem. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że przedłużony czas przechowywania (czas zimnego niedokrwienia > 12 godzin w 4 °C) prowadził do zmian spektralnych wynikających z naturalnych procesów degradacji.
- Pomiary muszą być wykonywane z tkanką przykrytą PBS lub pożywką, aby uniknąć uszkodzenia białek ECM i komórek na skutek wysychania tkanki.
2. Spektrometr Ramana
Nasz dostosowany spektrometr Raman łączy standardowy mikroskop fluorescencyjny (Olympus IX 71) ze spektrometrem Raman, co umożliwia bezpośrednie porównywanie obrazów w polu jasnym i fluorescencyjnych ze spektrami Raman. Podstawowy układ składa się z lasera diodowego o długości fali 784 nm (Toptica photonics AG/Niemcy), filtra notch do oddzielenia światła rozproszonego Ramanowsko od światła wzbudzenia, mikroskopu oraz spektrografu (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor/USA) z urządzeniem ładunkowym (kamera CCD) zoptymalizowanym pod kątem detekcji informacji spektralnych (F-view od Soft Imaging Systems/Niemcy).
3. Kontrola funkcji lasera
- Uruchom oprogramowanie Andor Solis (Andor/United Kingdom) i ustaw temperaturę kamery CCD na -60 °C, aby zminimalizować szum wywołany prądami termicznymi w kamerze.
- W celu przeprowadzenia procedury kalibracji umieść podłoże krzemowe na stoliku mikroskopu.
- Włącz laser i ustaw jego moc na 85 mW.
- Za pomocą oprogramowania Cell B (Olympus/Germany) skup laser na podłożu, aż pojawi się obraz XY.
- Wykonaj pomiar podłoża krzemowego z pojedynczym czasem integracji 1 sec, używając obiektywu powietrznego 60x.
- W oprogramowaniu Andor Solis zmień jednostkę osi x z numeru piksela na przesunięcie ramanowskie (cm-1).
- Reguluj ogniskowanie lasera dla piku krzemu przy 520 cm-1 w zebranym widmie, aby uzyskać maksymalną możliwą intensywność dla tego pasma Ramanowskiego. Minimalna liczba zliczeń musi być wyższa niż 11 000, aby kalibracja zakończyła się powodzeniem.
4. Pomiary spektroskopowe Ramana
Wszystkie pomiary są wykonywane w temperaturze pokojowej.
- Ustawienia podstawowe
- Do zbierania widm próbek należy użyć obiektywu imersyjnego 60x (Olympus/Germany) z aperturą numeryczną 1,2.
- Zmienić ustawienia akwizycji na 10 integracji/ 10 sekund, co daje łącznie 100 sekund na każdy pomiar.
- Pomiar komórek adherentnych
- Wziąć naczynko z dnem szklanym zawierające komórki i umieścić je na stoliku mikroskopu.
- Aby uzyskać lepszy sygnał i zapewnić powtarzalność, należy skupić wiązkę lasera na jądrze komórkowym, wyłączyć oświetlenie mikroskopu i rozpocząć zbieranie widma.
- Co 10 widm należy zmierzyć referencyjne widmo tła, przesuwając ogniskową lasera poza obszar komórki. Należy pamiętać, że przy każdej zmianie głębokości ogniskowania konieczne jest zebranie nowego tła.
- Pomiar komórek w zawiesinie
- Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do naczynka z dnem szklanym i umieścić je na stoliku mikroskopu.
- Skupić wiązkę lasera na środku komórki, wyłączyć oświetlenie mikroskopu i rozpocząć zbieranie widma.
- Co 10 widm należy zmierzyć referencyjne widmo tła, przesuwając ogniskową lasera poza obszar komórki. Przy zmianie głębokości ogniskowania należy zebrać nowe tło dla nowej głębokości.
- Pomiar tkanek natywnych
- Wziąć próbkę i umieścić ją w naczynku z dnem szklanym. Obszar zainteresowania (ROI) powinien być skierowany w stronę dna naczynka.
- Wypełnić naczynko odpowiednią ilością PBS, aby całkowicie przykryć próbkę.
- Położyć szkiełko nakrywkę na próbce, aby zapobiec jej przemieszczaniu się podczas pomiarów.
- Ustawić ogniskową lasera w strukturze zainteresowania (rozdzielczość głębokości zależy od lasera i rodzaju tkanki) i rozpocząć zbieranie widm.
- Co 10 widm należy zebrać referencyjne widmo tła, przesuwając ogniskową lasera poza cały obszar tkanki. Przy zmianie głębokości ogniskowania należy zebrać nowe tło dla nowej głębokości.
- Pomiar kriosiekcji znakowanych immunofluorescencyjnie (IF)
- Przygotować skrawki z tkanek świeżych, zamrożonych błyskawicznie, używając standardowego kriotomu, a następnie osadzić je na szkiełkach nakrywkach powlekanych krzemionką.
- Kriosiekcje należy barwić zgodnie z rutynowym protokołem IF, stosując jedynie krótki etap fiksacji (maks. 10 minut w 4% paraformaldehydzie) i używając odpowiednich przeciwciał do detekcji badanego białka.
- Wykonać pomiary Ramanowskie, skupiając wiązkę w obszarze, w którym występuje fluorescencja.
- Doświadczenia nad degradacją elastyny
- Umieścić warstwę ventricularis wyciętych listków zastawki aorty świni (warstwa bogata w elastynę, znajdująca się po stronie dopływu krwi do zastawki serca) skierowaną w stronę dna naczynka z dnem szklanym.
- Zmierzyć tkankę natywną jako „kontrolę nieinkubowaną” w 30 losowych punktach na całej powierzchni tkanki, skupiając wiązkę na strukturach włóknistych.
- Podzielić próbkę na 3 części i umieścić je w oddzielnych probówkach Eppendorf o pojemności 2,5 ml, wypełnionych 2 ml roztworu elastazy (5 U/ ml, Worthington/Germany).
- Inkubować tkankę przez 15 lub 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji przez 15 lub 30 minut wyjąć tkanki z probówek Eppendorf i dokładnie przemyć PBS, aby całkowicie zatrzymać reakcję enzymatyczną.
- Zmierzyć każdą próbkę w 30 losowych punktach, skupiając wiązkę na strukturach włóknistych.
5. Przetwarzanie i analiza danych
- Przetwarzanie widm Ramana
Wstępna obróbka wygenerowanych widm została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania OPUS (Bruker Optik GmbH/Niemcy).- Aby zredukować sygnały zakłócające pochodzące ze szkła i medium, a także uniknąć zmienności spowodowanej zmianami ogniskowania podczas pomiarów, należy odjąć odpowiednie widmo tła od zebranych widm.
- Ogranicz widma do zakresu liczb falowych między 400-1800 cm-1, który dostarcza największej ilości informacji.
- W razie potrzeby znormalizuj widma do maksymalnego piku. Normalizacja eliminuje wahania intensywności i błędy systematyczne, co upraszcza wykrywanie zmian strukturalnych w widmach próbek.
- Wykonaj korekcję linii bazowej, aby zwiększyć porównywalność między różnymi eksperymentami.
- Analiza widm Ramana
Widma Ramana analizowano metodą PCA przy użyciu oprogramowania The Unscrambler (CAMO/ Norwegia). Ta analiza wielowariancyjna wykrywa różnice i podobieństwa w zestawach danych spektralnych. Każde widmo jest przedstawione jako pojedynczy punkt w przestrzeni wielowymiarowej na podstawie liczby zliczeń dla każdego przesunięcia Ramanowskiego. Każda główna składowa (PC) opisuje określoną ilość całkowitej informacji zawartej w oryginalnych danych. Pierwsza składowa PC zawiera największe źródło zmienności. Każda kolejna składowa PC zawiera kolejno mniej informacji niż poprzednia. Każda zmienna posiada wartość wyniku (score) oraz ładunek (loading) dla każdej składowej PC. Poprzez wykreślenie składowych PC (=scores) można wykazać istotne korelacje między próbkami. Ładunki opisują wkład każdej analizowanej zmiennej do PCA.- Oznacz każdą grupę pomiarów, tworząc zakresy wierszy dla każdej grupy próbek.
- Użyj następujących podstawowych ustawień dla PCA: walidacja krzyżowa (cross validation), algorytm NIPALS, brak rotacji i uruchom analizę. Ustawienia te zależą od rodzaju widm.
- Wykonaj analizę PCA.
6. Reprezentatywne wyniki
Widma Ramana generowane z komórek adherentnych często wykazują niski stosunek sygnału do szumu oraz niską całkowitą intensywność sygnału (Rys. 1).11 Ze względu na to, że ognisko lasera musi zostać ustawione blisko szklanego dna, wpływ interferującego sygnału szkła jest dość wysoki, co powoduje maskowanie właściwego sygnału próbki. W konsekwencji sygnał próbki może zostać zminimalizowany lub nawet usunięty podczas późniejszego odejmowania tła. Dlatego do analizy spektroskopowej Ramana preferujemy stosowanie komórek w zawiesinie, ponieważ pozwalają one na detekcję bardziej szczegółowych informacji spektralnych. Niemniej jednak widma komórek adherentnych i w zawiesinie wykazują te same główne piki, różniące się jedynie intensywnością.
W celu charakterystyki różnych typów komórek w zawiesinie nie jest wymagane żadne przygotowanie wstępne. Średnie widma Ramana oraz odchylenia standardowe dla ludzkich fibroblastów, mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs), chondrocytów i keratynocytów zmierzonych w zawiesinie przedstawiono na Rysunku 2. Wszystkie widma Ramana mają podobną strukturę, z pikami pochodzącymi od typowych biomolekuł, takich jak białka, kwasy nukleinowe i lipidy (patrz Tabela 1).12 Dla tych typów komórek obszar widmowy między 600 a 1800 cm-1 zawiera większość istotnych informacji spektralnych, dzięki którym można wykryć wyraźne różnice między poszczególnymi typami komórek (Rys. 2A). Przykładowo, wyróżniliśmy jeden obszar widmowy (1280-1350 cm-1) wykazujący wyraźne różnice strukturalne, który można przypisać wibracjom molekularnym kolagenu i lipidów. W przeciwieństwie do tego, analizy morfologiczne nie nadają się do identyfikacji i rozróżnienia większości komórek (Rys. 2B-I). Podczas gdy różnica między chondrocytami a komórkami skóry jest zauważalna (Rys. 2D,H w porównaniu z B,F i E,I), fibroblasty i MSCs są trudne do rozróżnienia przy użyciu wyłącznie mikroskopii w polu jasnym (Rys. 2B,F w porównaniu z C,G).13
Analiza spektroskopowa Ramana tkanek natywnych, w szczególności białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), wymaga wizualizacji obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą obrazowania w jasnym polu, aby umożliwić ustawienie ostrości na odpowiednią strukturę. W celu przypisania białka do konkretnego widma odciskowego wygenerowaliśmy widma Ramana komercyjnie dostępnych czystych białek oraz immunohistochemicznie barwionych skrawków mrożonych. Zidentyfikowaliśmy widma odciskowe włókien elastycznych w tkankach natywnych, porównując liofilizowaną elastynę oraz skrawki mrożone barwione immunofluorescencyjnie z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko elastynie. Jednak ze względu na wysoką autofluorescencję elastyny, która odbija się w widmach Ramana, analiza danych jest trudna (Ryc. 3A). Aby zredukować błędy systematyczne wynikające z właściwości specyficznych dla próbki, takich jak autofluorescencja, kluczowe jest odpowiednie przetworzenie zestawów danych. W naszych analizach danych zastosowaliśmy normalizację w celu wyeliminowania znacznie wyższej intensywności sygnału czystego białka elastyny, dzięki czemu mogliśmy wygenerować porównywalne widma Ramana (Ryc. 3B). Elastyna jest jednym z najtrwalszych białek ECM w organizmie i dlatego jest bardzo trudna do degradacji.14 W naszym układzie doświadczalnym wywołaliśmy degradację elastyny w zdrowych płatkach zastawki aorty świni poprzez trawienie enzymatyczne. Stosując wielowymiarową analizę PCA, zidentyfikowaliśmy istotne różnice między widmami Ramana próbek traktowanych enzymatycznie a kontrolami natywnymi (Ryc. 3C). Różnice spektralne te zaobserwowano w widmie obciążeń przy 861, 1003 i 1664 cm-1. Przewidywane zmiany strukturalne we włóknach zawierających elastynę, wynikające z wydłużonego czasu ekspozycji na elastazę, wykazano w barwieniu metodą HART (Ryc. 4), co znalazło odzwierciedlenie w bardziej wyraźnych, oddzielnych klastrach wyników (Ryc. 3C).
Rysunek 1. Średnie widma Ramana fibroblastów odseparowanych i przylegających.
Rycina 2. (A) Średnie widma Ramanowskie i odchylenia standardowe czterech różnych typów izolowanych komórek pierwotnych (fibroblastów, MSC, chondrocytów i keratynocytów). Ramka wyróżnia obszar widma od 1280 do 1350 cm-1 z różnicami strukturalnymi. (B-E) Obrazy w polu jasnym odspojonych (B) fibroblastów, (C) MSC, (D) chondrocytów i (E) keratynocytów. Pasek skali odpowiada 20 μm. (F-I) Obrazy w polu jasnym adherentnych (F) fibroblastów, (G) MSC, (H) chondrocytów i (I) keratynocytów. Pasek skali odpowiada 200 μm.
Rysunek 3. (A) Widma Ramanowskie bez normalizacji dla liofilizowanej elastyny (linia niebieska), krioprzekrojów znakowanych immunofluorescencją (IF) (linia pomarańczowa) oraz włókien elastycznych (linia czerwona) zmierzonych w natywnych płatkach zastawki aortalnej. Wysoka intensywność sygnału liofilizowanej elastyny wynika z autofluorescencji. (B) Widma Ramanowskie po normalizacji w celu wyeliminowania błędów systematycznych. (C) Wyniki (scores) i ładunki (loadings) z porównania między niepoddanymi działaniu enzymów włóknami kontrolnymi (kolor czerwony) a włóknami elastycznymi zdegradowanymi enzymatycznie (kolory niebieski i zielony) w tkance natywnej.
Rysunek 4. Sączki zastawki aorty świń barwione metodą HART. Włókna elastyny są widoczne w kolorze czarnym. (A) i (B) przedstawiają nietraktowaną grupę kontrolną, a (C) i (D) ukazują próbki tkanek poddane działaniu elastazy, enzymu degradującego elastynę, przez 30 minut.
| Liczba falowa w cm⁻¹-1 | Zadanie12 | |
| 717-719 | C-N | Fosfolipidy |
| 785-788 | zasady DNA/RNA, szkielet O-P-O | DNA/RNA |
| 1003- 1005 | Fenyloalanina | Białko |
| 1220-1280 | Amid III | Białko |
| 1445-1447 | CH2 | Białko/Lipid |
| 1655-1680 | Amid I C=O | Białko Lipid |
Tabela 1. Prążki ramanowskie wykryte w widmach wszystkich typów komórek (fibroblastów, MSC, chondrocytów i keratynocytów).
Dyskusja
Spektroskopia Ramana jest odpowiednim narzędziem do analizy próbek biologicznych, takich jak in vitro– komórki hodowlane i białka ECM, a także komórki w obrębie tkanek natywnych.11,15,16 W niniejszej pracy wykazaliśmy, że ta bezkontaktowa technika bez użycia znaczników pozwala na rozróżnianie różnych typów komórek oraz wykrywanie degradacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wyłącznie na podstawie wewnętrznego składu biomolekularnego tych próbek biologicznych.
Główną zaletą spektroskopii Ramana jest możliwość nieinwazyjnej ilościowej analizy sygnatury biochemicznej próbki na podstawie otrzymanych widm Ramana. W przeciwieństwie do spektroskopii w podczerwieni, która dostarcza podobnych informacji, widma Ramana mogą być pozyskiwane z próbek wodnych, ponieważ rozproszenie Ramana przez wodę jest słabe. Ponadto spektroskopia Ramana opiera się wyłącznie na detekcji wstecznego rozproszenia światła monochromatycznego, w związku z czym przed pomiarem nie jest wymagane żadne przygotowanie próbki. Cechy te sprawiają, że spektroskopia Ramana jest obiecującą alternatywą dla potencjalnych zastosowań obrazowania in vivo. W tym kontekście koherentna spektroskopia Ramana antystokesowska (CARS) jest bardzo interesującą techniką, ponieważ umożliwia szybsze i bardziej czułe pozyskiwanie danych w oparciu o te same sygnały wibracyjne, które wykorzystano w naszych eksperymentach.15,16 Inne metody alternatywne, w tym obrazowanie autofluorescencji indukowanej wielofotonowo oraz generowanie drugiej harmonicznej, okazały się wcześniej odpowiednie do nieinwazyjnego lub małoinwazyjnego monitorowania próbek biologicznych.17 Jednakże te modalności obrazowania wiążą się z bardzo wysokimi kosztami i są ograniczone do cząsteczek generujących autofluorescencję. Dodatkowo spektrometr Ramana można łatwo połączyć z konwencjonalnymi mikroskopami optycznymi. Charakterystyka ta sprawia, że spektroskopia Ramana jest cennym narzędziem do badania próbek biologicznych w środowiskach fizjologicznych.
Jednym z obecnych ograniczeń naszej konfiguracji spektroskopii Ramanowskiej jest stosunkowo mała ogniskowa wiązki lasera (250 nm pełnej szerokości połówki maksimum (FWHM) w płaszczyźnie bocznej i 700 nm FWHM w płaszczyźnie osiowej), generowana przez obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (NA=1.2). Chociaż wysoka apertura numeryczna pozwala na zebranie znacznej ilości emitowanego światła Ramanowskiego, co skutkuje wysokim stosunkiem sygnału do szumu, wysoka wartość NA tworzy w próbce jedynie niewielki obszar ogniskowania, który jest zazwyczaj znacznie mniejszy niż komórka. Aby porównać widma Ramanowskie różnych komórek, niezbędne jest zarejestrowanie widma reprezentatywnego, co jest trudne do osiągnięcia przy małym obszarze ogniskowania. Aby rozwiązać ten problem, pracujemy nad procesem automatyzacji zbierania sygnału w różnych punktach wewnątrz komórki (= mapowanie spektroskopowe Ramanowskie), co prowadzi do uśrednienia widma i uzyskania widma reprezentatywnego. Dodatkowo technika ta zapewni przegląd rozmieszczenia specyficznych pasm Ramanowskich, na przykład rozkładu białek wewnątrz komórki.
Próbki biologiczne są wysoce złożone i składają się z heterogenicznej mieszaniny biomolekuł, które wpływają na rejestrowane widma Ramana. W związku z tym wzorzec spektralny jest bardzo złożony, a monitorowanie pojedynczego typu cząsteczki w widmie Ramana jest trudne do osiągnięcia ze względu na nakładanie się sygnałów różnych cząsteczek. Dodatkowo wewnętrzna fluorescencja próbki może maskować cenne informacje zawarte w słabszych sygnałach Ramana. Co ciekawe, w niektórych z naszych poprzednich badań, przy użyciu odpowiedniego narzędzia analitycznego, zidentyfikowaliśmy autofluorescencję w widmach Ramana jako główny czynnik różnicujący typy komórek (MSC i fibroblasty).13 Stwierdziliśmy również, że zmiany w całkowitej intensywności sygnału Ramana mogą służyć jako wskaźnik stanu kolagenu i włókien kolagenowych w obrębie ECM płatków zastawki aortalnej.9 Jednakże analizując stan elastyny w tych tkankach, nie udało nam się uzyskać podobnych wyników. Jak wspomniano w sekcji wyników, byliśmy w stanie wykryć zmiany jedynie w specyficznych pasmach Ramana w próbkach traktowanych elastazą w porównaniu z natywnymi kontrolami. Nie zaobserwowaliśmy spodziewanego spadku całkowitego sygnału Ramana w próbkach traktowanych enzymatycznie. Obserwacje te skutkowały wykresem wyników (score plot), który nie wykazał wyraźnego tworzenia się skupisk, co miało miejsce w poprzednim badaniu.9 W przeciwieństwie do tego, wpływ traktowania enzymatycznego był wykrywalny w wynikach PCA. Zakładamy, że rozbieżności te między dwoma białkami ECM, elastyną i kolagenem, wynikają z różnic morfologicznych oraz odmiennych procesów degradacji enzymatycznej: w płatku zastawki aortalnej strefa bogata w kolagen (fibrosa) jest ciągłą warstwą, która ulega rozluźnieniu w wyniku traktowania enzymatycznego, podczas gdy strefa zawierająca elastynę (ventricularis) ma konfigurację sieciową, która po ekspozycji na elastazę wydaje się pofragmentowana (Rys. 4). Pomiary punktowe (single spot) nie były zatem odpowiednie do wykrycia tak niewielkich pęknięć w sieci elastyny. W tym przypadku mapowanie Ramanowskie tkanki pomogłoby zidentyfikować przerwy w sieci.
Kolejnym wyzwaniem w spektroskopii Ramanowskiej próbek biologicznych jest skrócenie czasu pomiaru. Jednym z rozwiązań jest zwiększenie mocy lasera, co jest dopuszczalne tak długo, jak próbki biologiczne nie ulegają fotouszkodzeniom. Wszystkie nasze obecne eksperymenty są badaniami typu proof-of-principle skupionymi na badaniach podstawowych; jednak naszym nadrzędnym celem jest wdrożenie spektroskopii Ramanowskiej w zastosowaniach klinicznych, w tym w medycynie regeneracyjnej (np. kontrola jakości produktów inżynierii tkankowej), monitorowaniu graftów przed transplantacją oraz w diagnostyce nowotworów.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Steffenowi Kochowi za wsparcie techniczne oraz Shannon Lee Layland (oboje z Fraunhofer IGB Stuttgart) za pomocne sugestie dotyczące manuskryptu. Praca ta była finansowana z programu Attract Fraunhofer-Gesellschaft oraz BMBF (oba granty dla K.S.-L.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| elastaza | Worthington Biochemical | LS006363 | |
| przeciwciało przeciwko elastynie | Sigma-Aldrich | HPA018111 | 1:75; bufor cytrynianowy |
| PBS | Lonza Inc. | 17-512F | |
| szalki z szklanym dnem | Greiner Bio-One | 627860 | |
| The Unscrambler | CAMO | ||
| Opus | Bruker Corporation |
Bibliografia
- Chan, J. W., Lieu, D. K. Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy. J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).
- Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).
- Gentleman, E. Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation. Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).
- Notingher, I., Hench, L. L. Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro. Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).
- Schenke-Layland, K. Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability. Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 122, 12(1928).
- Frushour, B. G., Koenig, J. L. Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin. Biopolymers. 14, 379-391 (1975).
- Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants. Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).
- Votteler, M. Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues. J. Biophotonics. , (2011).
- Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. Principal component analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).
- Pudlas, M. Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells. Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).
- Pudlas, M. Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy. Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).
- Mecham, R. P. Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification. Methods. 45, 32-41 (2008).
- Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives. Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).
- Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues. Analyst. 134, 1046-1057 (2009).
- Schenke-Layland, K. Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures. J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).
Przedruki i uprawnienia
