Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Podsumowanie

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Streszczenie

Fuzja mitochondriów odgrywa kluczową rolę w homeostazie wapnia w mitochondriach, bioenergetyce, autofagii i kontroli jakości. Fuzję w żywych komórkach ilościowo określa się poprzez fotokonwersję skierowanego do macierzy fotoaktywnego GFP (mtPAGFP) w podgrupie mitochondriów. Szybkość, z jaką sfotokonwertowane cząsteczki równoważą się w całej populacji mitochondriów, służy jako miara aktywności fuzji. Do tej pory pomiary przeprowadzano przy użyciu podejścia time-lapse dla pojedynczej komórki, ilościowo określając równowagę w jednej komórce w ciągu godziny. W niniejszej pracy skalujemy i automatyzujemy wcześniej opisaną metodę dla żywych komórek, opartą na wykorzystaniu mtPAGFP i niskiego stężenia TMRE (15 nm). Metoda ta polega na fotoaktywacji niewielkiej części sieci mitochondrialnej, zbieraniu wysoko rozdzielczych stosów przekrojów konfokalnych co 15 min przez 1 godzinę oraz ilościowym określeniu zmiany natężenia sygnału. W zależności od kilku czynników, takich jak łatwość znalezienia komórek wykazujących ekspresję PAGFP oraz sygnał z regionów fotoaktywowanych, możliwe jest zebranie danych z około 10 komórek w odstępach 15 min. Zapewnia to znaczną poprawę wydajności czasowej tego testu, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej rozdzielczości ilościowej na poziomie subkomórkowym, a także parametrów kinetycznych niezbędnych do uchwycenia szczegółów zachowania mitochondriów w ich naturalnym środowisku cytoarchitektonicznym.

Dynamika mitochondrialna odgrywa istotną rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w oddychaniu, regulacji poziomu wapnia i apoptozie^1,2,3,13. Struktura sieci mitochondrialnej wpływa na funkcję mitochondriów oraz sposób, w jaki oddziałują one z resztą komórki. Podlegając ciągłym procesom podziału i łączenia, sieci mitochondrialne przyjmują różne kształty – od sieci silnie połączonych po struktury bardziej pofragmentowane. Co ciekawe, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Charcota-Marie-Totha typu 2A oraz dominująca zanik nerwu wzrokowego są skorelowane ze zmianami morfologii mitochondriów, a konkretnie z fragmentacją sieci^4,10,13. Często po fragmentacji mitochondria ulegają depolaryzacji, a ich nagromadzenie prowadzi do upośledzenia funkcji komórki¹⁸. Wykazano, że podział mitochondriów może być sygnałem dla komórki do przejścia w stan apoptozy. Może on również stanowić mechanizm oddzielania zdepolaryzowanych i nieaktywnych mitochondriów, co pozwala zachować sprawność głównej części sieci¹⁴. Z kolei łączenie się mitochondriów prowadzi do wymiany białek macierzy, substancji rozpuszczonych, mtDNA oraz gradientu elektrochemicznego i wydaje się zapobiegać postępowaniu w stronę apoptozy⁹. Wpływ podziału i łączenia się mitochondriów na homeostazę komórkową, a w konsekwencji na funkcjonowanie organizmu, wymaga dalszych badań, dlatego niezbędny jest ciągły rozwój i optymalizacja metod gromadzenia informacji na temat tych zjawisk.

Istniejące testy fuzji mitochondriów dostarczyły wielu cennych informacji na temat fizjologii mitochondriów, a każda z tych metod posiada własne zalety. Hybrydowy test fuzji z użyciem PEG⁷ polega na mieszaniu dwóch populacji komórek znakowanych w różny sposób (mtRFP i mtYFP), a następnie analizie stopnia mieszania i kolokalizacji fluoroforów w zfuzjowanych komórkach wielojądrowych. Choć metoda ta dostarczyła istotnych danych, nie wszystkie typy komórek mogą ulegać fuzji, a warunki stymulujące ten proces wiążą się z zastosowaniem toksycznych leków, które prawdopodobnie wpływają na naturalny przebieg fuzji. W ostatnim czasie opracowano technikę bezkomórkową, wykorzystującą izolowane mitochondria do obserwacji zdarzeń fuzji w oparciu o test lucyferazy^1,5. Dwie linie komórkowe człowieka są celowane za pomocą odpowiednio części aminowej lub karboksylowej lucyferazy Renilla wraz z tzw. zamkiem leucynowym (leucine zipper), aby zapewnić dimeryzację po zmieszaniu. Mitochondria są izolowane z każdej z linii komórkowych, a następnie poddawane fuzji. Reakcja fuzji może zachodzić bez obecności cytozolu w warunkach fizjologicznych, przy dostępie do energii, odpowiedniej temperaturze oraz zachowaniu potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej. Co ciekawe, stwierdzono, że cytozol moduluje zakres fuzji, co dowodzi, że sygnalizacja komórkowa reguluje proces fuzji ^4,5. Test ten będzie bardzo użyteczny w badaniach wysokoprzepustowych w celu identyfikacji komponentów aparatu fuzyjnego, a także związków farmakologicznych, które mogą wpływać na dynamikę mitochondriów. Niemniej jednak, aby uzupełnić ten test in vitro i zaobserwować te zdarzenia w środowisku komórkowym, konieczne będzie zastosowanie bardziej szczegółowych testów mitochondrialnych przeprowadzanych na całych komórkach.

Od pewnego czasu stosowana jest technika monitorowania dynamiki mitochondriów w całych komórkach, oparta na skierowanym do mitochondriów fotoaktywowalnym białku GFP (mtPAGFP)^6,11. Po ekspresji mtPAGFP niewielka część sieci mitochondrialnej (10-20%) zostaje fotoaktywowana, a rozprzestrzenianie się sygnału na resztę sieci mitochondrialnej jest rejestrowane co 15 minut przez 1 godzinę przy użyciu konfokalnej obrazowni poklatkowej. Każde zdarzenie fuzji prowadzi do rozcieńczenia intensywności sygnału, co umożliwia kwantyfikację szybkości fuzji. Chociaż fuzja i fisja zachodzą w komórkach w sposób ciągły, technika ta monitoruje jedynie fuzję, ponieważ fisja nie prowadzi do rozcieńczenia sygnału PAGFP⁶. Współoznaczenie niskimi stężeniami TMRE (7-15 nM w komórkach INS1) pozwala na kwantyfikację potencjału błonowego mitochondriów. Gdy mitochondria są hiperpolaryzowane, pobierają więcej TMRE, a gdy ulegają depolaryzacji, tracą barwnik TMRE. Mitochondria, które ulegają depolaryzacji, nie posiadają już wystarczającego potencjału błonowego i mają tendencję do mniej wydajnej fuzji lub całkowitego braku fuzji. Dlatego aktywne mitochondria ulegające fuzji można śledzić przy tych niskich stężeniach TMRE^9,15. Akumulacja zdepolaryzowanych mitochondriów pozbawionych sygnału TMRE może być oznaką fototoksyczności lub śmierci komórki. Wyższe stężenia TMRE sprawiają, że mitochondria stają się bardzo wrażliwe na światło laserowe, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć nadmiernego znakowania TMRE. Jeśli przedmiotem zainteresowania jest efekt depolaryzacji mitochondriów, można zastosować technikę z użyciem nieco wyższych stężeń TMRE i intensywniejszego światła laserowego, aby zdepolaryzować mitochondria w sposób kontrolowany (Mitra i Lippincott-Schwartz, 2010). Aby upewnić się, że toksyczność wywołana przez TMRE nie stanowi problemu, sugerujemy poddanie obciążonych komórek (3-15 nM TMRE) parametrom obrazowania, które będą stosowane w analizie (np. 7 stosów po 6 przekrojów optycznych jeden po drugim), i ocenę stanu zdrowia komórek po 2 godzinach. Jeśli mitochondria wydają się zbyt pofragmentowane, a komórki obumierają, zamiast TMRE można zastosować inne markery mitochondrialne, takie jak dsRED lub Mitotracker red.

Metoda mtPAGFP ujawniła szczegóły dotyczące zachowania sieci mitochondrialnej, których nie można było zwizualizować za pomocą innych metod. Wiemy na przykład, że fuzja mitochondrialna może być pełna lub przejściowa, przy czym zawartość macierzy może mieszać się bez zmiany ogólnej morfologii sieci. Dodatkowo wiemy, że prawdopodobieństwo fuzji jest niezależne od czasu trwania kontaktu i wymiarów organelli, a zależy od ruchliwości organelli, potencjału błonowego oraz historii poprzedniej aktywności fuzyjnej^8,15,16,17.

W niniejszym manuskrypcie opisujemy metodologię skalowania wcześniej opublikowanego protokołu z wykorzystaniem mtPAGFP i 15nM TMRE⁸ w celu badania wielu komórek jednocześnie i zwiększenia efektywności czasowej gromadzenia danych bez utraty rozdzielczości subkomórkowej. Stało się to możliwe dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego stolika mikroskopowego oraz programowalnego oprogramowania do akwizycji obrazów. Oprogramowanie Zen firmy Zeiss umożliwia użytkownikowi oznakowanie i śledzenie kilku wybranych komórek wykazujących ekspresję mtPAGFP. Każda z tych komórek może zostać fotoaktywowana w określonym obszarze zainteresowania, a stosy przekrojów konfokalnych mogą być monitorowane pod kątem sygnału mtPAGFP oraz TMRE w określonych odstępach czasu. Do przeprowadzenia tego protokołu można użyć innych systemów konfokalnych, pod warunkiem dostępności programowalnego, zautomatyzowanego stolika, inkubatora z CO₂ oraz sposobu fotoaktywacji PAGFP; może to być laser wielofotonowy lub laser diodowy o długości fali 405 nm.

Protokół

1. Przygotowanie płytki obrazowej

1. Hodować komórki INS1 w pożywce RPMI zawierającej 10% standardowej płatkowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny i streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 5 mM NaHCO₃, 2 mM HEPES, 2 mM kwasu pirowinowego oraz 11 mM glukozy do osiągnięcia 80% konfluencji.
2. Poddać kultury komórek INS1 trypsynizacji przy użyciu 0,05% trypsyny i wysiać je na płytki do obrazowania z dnem z szkiełek podstawkowych powlekonych poli-D-lizyną (konfluencja 30-40%).
3. Pozostawić płytki do osiągnięcia 60-80% konfluencji (~2 dni) i dodać adenowirusowy PA-GFP skierowany do macierzy mitochondrialnej (COXVIII) na 24 h (MOI=5). Wymienić pożywkę i pozostawić komórki do wzrostu przez kolejne 2 dni przed obrazowaniem.
4. W dniu obrazowania dodać 7-15 nM TMRE do płytek do obrazowania i inkubować w celu wyrównania przez co najmniej 45 min.
5. W tym czasie włączyć inkubator (tutaj zastosowano inkubator stołowy) i pozwolić mikroskopowi wyrównać temperaturę do 37 °C przez około 1 godzinę. Włączyć dopływ 5% CO₂.

2. Parametry obrazowania dla konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 710

1. Po ustabilizowaniu mikroskopu, w zakładce Acquisition kliknij „show manual tools”, otwórz panel konfiguracji obrazowania, wybierz „channel mode” i ustaw przełączanie ścieżki na każdą „frame”.
2. W panelu ścieżki światła wybierz LSM oraz tryb kanału. Idąc od ikony preparatu w górę, zaznacz „rear”, MBS 690+ oraz MBS 488. Na dole panelu wybierz „T-PMT”, aby włączyć wizualizację kanału bright field lub DIC.
3. Zakończ regulację parametrów ścieżki światła, ustawiając zakres dla barwnika GFP na 490-540 nm oraz dla barwnika TMRE na 580-700 nm.
4. W trybie akwizycji ustaw pole skanowania na 512 × 512 pikseli, średnią z 4 obrazów (average 4x) i wybierz współczynnik powiększenia (zoom factor), który warto zachować na stałe w celu późniejszej kalibracji.

3. Optymalizacja parametrów obrazowania

1. Używając obiektywu plan-apochromatu 100x (1,4 NA), ustaw ostrość na komórkach, korzystając ze światła halogenowego, a nie fluorescencyjnego, aby chronić mitochondria przed fototoksycznością.
2. Wyszukaj komórki wykazujące ekspresję PA-GFP, stosując maksymalnie otwartą dziurkę otworową (pinhole) i skanując obraz w celu znalezienia komórek o intensywniejszej zielonej fluorescencji.
3. Wyznacz najniższą moc lasera dwufotonowego niezbędną do aktywacji PA-GFP i zoptymalizuj parametry obrazowania, upewniając się, że sygnał nie nasyca detektora. Sprawdź w kilku seriach Z, czy sygnał PA-GFP kolokalizuje z sygnałem TMRE. Utrata sygnału TMRE świadczy o depolaryzacji mitochondrialnej lub fototoksyczności; komórki wykazujące takie cechy nie powinny być wykorzystywane do analizy.
4. Znajdź komórkę wykazującą ekspresję PA-GFP i określ współczynnik powiększenia (zoom).
5. Ustaw zakres serii Z tak, aby zebrać 6 przekrojów (zakres ten musi być odpowiedni dla wszystkich 10 komórek, chyba że dla każdej pozycji zostanie ustawiona osobna ostrość w osi Z).
6. Zapisz metodę obrazowania dla każdej komórki (komórka 1, komórka 2 itd.).

4. Dostosuj zautomatyzowaną część programu i wyznacz 10 komórek, które będą obserwowane w ramach 1-godzinnego testu fuzji mitochondriów

1. W lewym panelu okna multitime wybierz panel „saving” (zapisywanie) i określ lokalizację, w której będą zapisywane pliki.
2. W panelu „Acquisition” (akwizycja) wczytaj metodę akwizycji zapisaną dla komórki 1 w konfiguracji skanowania i zaznacz pole z stack. Wybierz również opcję „marked Z- middle of z stack”.
3. W panelu „blocks” (bloki) wybierz „single block at each location”. Kliknij „add blocks” dla każdego interwału, który ma zostać zmierzony.
4. W panelu „timing” (czas) wybierz „wait interval” i wpisz „0” w polu „wait interval before block at first location only”. Bloki 2-4 będą miały w tej sekcji wartość „15 min”.
5. W panelu lokalizacji wybierz „move focus to load position between locations” oraz „load scan config when 'move to loc' or 'next loc' clicked”. W sekcji „edit locations list” wybierz „clear all”, a następnie zaznacz „multiple locations motorized stage”.
6. W panelu „Bleach” zaznacz pole „bleach” i w rozwijanym menu „config” wskaż plik konfiguracyjny zgodnie z ustawieniami w głównym oknie oprogramowania. Następnie w oknie „bleaching” zapisz odpowiednią metodę fotoaktywacji. W panelu obszarów wybierz ROI dla tej konkretnej komórki i dodaj to ROI do multitime, wybierając okno „add current region to ROI list”. Upewnij się, że w rozwijanym menu „ROI” wybrana jest ta sama lokalizacja.

Aby synchronizacja czasu przebiegała prawidłowo i każda komórka miała 15-minutowy odstęp, należy zapisać dwie metody. Na liście bloków pierwszy będzie posiadał „prawdziwą” konfigurację fotoaktywacji, a pozostałe będą miały konfigurację „pozorną” (mock), która nie wykorzystuje lasera dwufotonowego. Pierwszy blok będzie również jedynym blokiem bez opóźnienia (BKIntv=0). W związku z tym metoda rozpoczyna się od jednego skanu bazowego, po którym następuje skan fotoaktywacji. Pozostałe bloki mają wartość BkIntv wynoszącą 900 s i w każdym punkcie czasowym wykonuje się dwa skany, podobnie jak w czasie 0 s, aby zachować spójność czasową.

7. Dla każdej z 10 komórek, które będą monitorowane w czasie, wykonaj następującą sekwencję:
   Znajdź komórkę wykazującą ekspresję PAGFP – zapisz metodę obrazowania
   Panel lokalizacji (Location panel) – zaznacz pozycję stolika, określ metodę obrazowania
   Główny panel ROI – wybierz obszar zainteresowania do fotoaktywacji. Panel wybielania (Bleach panel) – zapisz konkretny obszar ROI i wczytaj go również do pola ROI:
   Usuń ROI i zresetuj powiększenie skanowania do 1
   Znajdź kolejną komórkę i ustaw powiększenie
   Powtórz ten proces dla kolejnych 9 komórek

Upewnij się, że każda lokalizacja na stole oraz wszystkie bloki mają przypisaną odpowiednią metodę obrazowania (konfigurację skanowania). Upewnij się również, że pierwszy blok w każdej lokalizacji odpowiada odpowiedniej metodzie fotoaktywacji, podczas gdy pozostałe zawierają metodę „mock”. Na koniec wybierz „run”.

5. Analiza intensywności sygnału PA-GFP

1. W przypadku komórek, w których sygnał fotoaktywnego GFP kolokalizuje z czerwonym sygnałem TMRE, należy odjąć tło w obrazach PAGFP (w tym przypadku użyto programu Metamorph).
2. Następnie wyeksportuj dane do programu Excel i oblicz średnią intensywność dla stosów z-stack w każdym punkcie czasowym. Odrzuć przekroje optyczne pozbawione sygnału.
3. Zmierz rozcieńczenie sygnału w każdym stosie z-stack, obliczając procent pierwotnego sygnału fotoaktywnego.

Każdy punkt danych jest skanowany i rejestrowany dwukrotnie, co skutkuje uzyskaniem podwojonych informacji o stosach z dla każdego punktu czasowego. Należy sprawdzić, czy wartości stosów z są zgodne. W przeciwnym razie wskazuje to na wystąpienie problemu (np. z ogniskowaniem lub ruchem komórek).

6. Reprezentatywne wyniki

Gdy dojdzie do fuzji aktywowanego i nieaktywowanego mitochondrium z PA-GFP, białko PA-GFP w macierzy mitochondrialnej miesza się z macierzą nieoznaczoną i ulega rozcieńczeniu na większym obszarze, co prowadzi do spadku intensywności sygnału (Rysunek 1A). W komórce INS1 znaczący spadek intensywności sygnału występuje co 15 minut, aż do osiągnięcia stanu równowagi fuzji mitochondrialnej (około 1 godziny). Należy zauważyć, że komórka na Rysunku 1B wykazuje niemal całkowitą kolokalizację sygnałów PA-GFP i TMRE. W tych analizach stosuje się bardzo niskie stężenie TMRE (15 nM), aby wspomóc celowanie w fotoaktywację PA-GFP, a także w celu monitorowania stanu zdrowia komórek. Komórki z dużą liczbą zdepolaryzowanych mitochondriów będą wykazywać niepełną kolokalizację PA-GFP i TMRE i nie powinny być analizowane, ponieważ wskazuje to albo na fototoksyczność, albo na komórki w stanie obumierania.

Czas równoważenia dla fuzji mitochondrialnej w komórkach INS1 zazwyczaj wynosi 1 hr, gdy aktywowane zostaje około 15% objętości mitochondriów. Czasami, nawet przy naświetleniu niewielkiego obszaru, większość mitochondriów ulega fotoaktywacji ze względu na ich silne powiązanie w sieci, co utrudnia wykrycie dalszej fuzji. Inne typy komórek mogą wykazywać inne czasy równoważenia i powinny być badane w krótszych odstępach czasu oraz przez dłuższy okres w celu scharakteryzowania dynamiki mitochondriów. Aby zahamować fuzję mitochondrialną, komórki można umieścić w środowisku lipotoksycznym. Wcześniej wykazano, że 0,4 mM palmitanu powoduje fragmentację mitochondriów i hamuje ich fuzję⁹. Efekt ten widoczny jest na Rysunku 2, gdzie mitochondria są pofragmentowane, ale intensywność sygnału mtPAGFP nie zmienia się tak bardzo, jak w warunkach normalnych (Rysunek 1). W związku z tym rozcieńczenie sygnału PA-GFP wynika prawdopodobnie z fuzji mitochondrialnej, a nie z fisji. W przypadku innych typów komórek sugerujemy zastosowanie innych znanych metod indukowania fragmentacji mitochondriów, takich jak wyciszenie białka OPA1, które jest niezbędne do fuzji mitochondrialnej¹⁴.

Rysunek 1. Typowe rozcieńczenie sygnału PA-GFP po fotoaktywacji podczas testu fuzji mitochondriów. A. PA-GFP staje się stopniowo słabszy z powodu zdarzeń fuzji mitochondriów, co prowadzi do rozcieńczenia białka na coraz większym obszarze, co widać na tych obrazach projekcyjnych z 6 przekrojów optycznych ilościowanych co 15 minut. B. TMRE z PA-GFP wykazuje, że mitochondria są aktywne i nie są zdepolaryzowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 2. Hamowanie fuzji mitochondrialnej za pomocą 0,4 mM palmitanu zmniejsza rozcieńczenie PA-GFP. A. Projekcje 6 przekrojów optycznych ukazujące krótkie mitochondria z niezmienną w czasie intensywnością sygnału. B. Kolokalizacja PA-GFP z TMRE wykazuje, że mitochondria nie są zdepolaryzowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Metoda ta pozwala na obrazowanie około 10 komórek jednocześnie, jeśli akwizycja odbywa się co 15 minut po fotoaktywacji. Dokładna liczba komórek zależy od tego, jak szybko uda się zlokalizować i oznaczyć komórki wykazujące ekspresję mtPAGFP w naczyniu hodowlanym oraz jak szybko zostaną skonfigurowane wszystkie parametry oprogramowania. Aby automatyzacja przebiegała sprawnie, należy zastosować równomierną warstwę komórek, ponieważ wyznaczone marginesy stosu z będą obowiązywać dla wszystkich komórek.

Wielkość tego początkowego obszaru fotoaktywacji będzie determinować czas equilibracji. Aby móc mierzyć fuzję mitochondriów, ważne jest, aby fotoaktywować jedynie 10-20% sieci, tak aby można było monitorować rozprzestrzenianie się sygnału do pozostałej części sieci w czasie. Jeśli zostanie fotoaktywowana zbyt duża część sieci, możliwe jest, że całkowita fuzja nastąpi zbyt szybko i zdarzenie to nie zostanie zarejestrowane.

Należy zachować szczególną ostrożność przy regulacji mocy lasera dwufotonowego oraz stężenia TMRE, aby uniknąć fototoksyczności prowadzącej do depolaryzacji mitochondriów. Potwierdzenie, że sygnał mtPAGFP kolokalizuje z sygnałem TMRE, może pomóc w ocenie fototoksyczności i ogólnego stanu zdrowia komórek ^8,15. Należy unikać naświetlania światłem epifluorescencyjnym. Podczas poszukiwania komórek wykazujących ekspresję mtPAGFP, otwór (pinhole) powinien być maksymalnie otwarty podczas skanowania przy użyciu niskiej mocy wzbudzenia 488nm. Dostrojenie mocy lasera dwufotonowego tak, aby fotoaktywować wystarczającą ilość PA-GFP do pomiaru sygnału przez 1 godzinę, ale bez doprowadzenia do przesycenia którakolwiek z komórek, może być trudne ⁸. Warto jednak poświęcić czas na ten etap optymalizacji, ponieważ po uruchomieniu programu automatycznego jego zatrzymanie w celu wyboru większej liczby komórek i ponowne wznowienie jest uciążliwe.

W ramach kontroli jakości bardzo pomocne może być pozyskanie obrazu w kontraście interferencyjnym różnicowym (DIC) (lub w świetle przechodzącym), aby monitorować ostrość ustawioną na komórkach, a także w celu wykrycia pęcherzyków powietrza powstałych w oleju imersyjnym podczas skanowania; zdarza się to czasami w wyniku ruchów stolika.

Choć zastosowanie metody mtPAGFP pozwala na gromadzenie danych o jednokierunkowym przemieszczaniu się białek macierzy mitochondrialnej z mitochondriów fotoaktywowanych do tych nieoznaczonych, można tę technikę wykorzystać do badania innych procesów. Na przykład do białek błonowych można przyłączyć specyficzne fluorochromy, aby obserwować ich specyficzny ruch podczas zdarzeń fuzji, co wykazano w przypadku ABC-me, którego fuzja zachodzi w innej skali czasowej niż mieszanie rozpuszczalnych białek macierzy ¹⁵.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
COXIII-adenowiralny PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 710	Carl Zeiss, Inc.