Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Podsumowanie

Eukarioty mikrobiologiczne są zarówno źródłem węgla pochodzenia fotosyntetycznego, jak i drapieżnymi gatunkami szczytowymi w stale pokrytych lodem jeziorach Antarktydy. Niniejszy raport opisuje podejście oparte na kulturach wzbogaconych w celu izolacji metabolicznie wszechstronnych eukariotów mikrobiologicznych z antarktycznego jeziora Bonney oraz ocenia potencjał asymilacji węgla nieorganicznego przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy (RubisCO).

Streszczenie

Jezioro Bonney jest jednym z wielu stale pokrytych lodem jezior położonych w suchych dolinach McMurdo na Antarktydzie. Całoroczna pokrywa lodowa utrzymuje chemiczne uwarstwienie kolumny wody i, w przeciwieństwie do innych śródlądowych zbiorników wodnych, w znacznym stopniu zapobiega zewnętrznemu dopływowi węgla i składników odżywczych ze strumieni. Biota jest narażona na liczne stresory środowiskowe, w tym całoroczny silny niedobór składników odżywczych, niskie temperatury, ekstremalny cień, hypersalinity oraz 24-godzinny mrok podczas zimy ¹. Te ekstremalne warunki środowiskowe ograniczają biotę w jeziorze Bonney niemal wyłącznie do mikroorganizmów ².

Jednokomórkowe mikroorganizmy eukariotyczne (nazywane „protistami”) są istotnymi uczestnikami globalnego cyklu biogeochemicznego ³ i pełnią ważne role ekologiczne w obiegu węgla w jeziorach suchych dolin, zajmując zarówno role pierwotne, jak i trzeciorzędowe w wodnej sieci troficznej. W wodnej sieci troficznej suchych dolin protisty wiążące węgiel nieorganiczny (autotrofia) są głównymi producentami węgla organicznego dla organizmów organotroficznych ^{4, 2}. Protisty fagotroficzne lub heterotroficzne, zdolne do pochłaniania bakterii i mniejszych protistów, pełnią rolę drapieżników szczytowych w sieci troficznej ⁵. Ponadto nieznana część populacji protistów jest zdolna do połączonego metabolizmu miksotroficznego ^{6, 7}. Miksotrofia u protistów polega na zdolności do łączenia funkcji fotosyntetycznych z fagotroficznym pochłanianiem mikroorganizmów będących ofiarami. Ta forma miksotrofii różni się od metabolizmu miksotroficznego u gatunków bakterii, który zazwyczaj polega na pobieraniu rozpuszczonych cząsteczek węgla. Obecnie istnieje bardzo niewiele izolatów protistów z polarnych jezior stale pokrytych lodem, a badania nad różnorodnością i ekologią protistów w tym ekstremalnym środowisku były ograniczone ^{8, 4, 9, 10, 5}. Lepsze zrozumienie wszechstronności metabolicznej protistów w prostej sieci troficznej jezior suchych dolin pomoże w opracowaniu modeli dotyczących roli protistów w globalnym cyklu węglowym.

Zastosowano metodę hodowli wzbogaconej w celu wyizolowania potencjalnie fototroficznych i miksotroficznych protistów z jeziora Bonney. Głębie poboru próbek z kolumny wody wybrano w oparciu o lokalizację maksimów produkcji pierwotnej i różnorodność filogenetyczną protistów ^{4, 11}, a także zmienność głównych czynników abiotycznych wpływających na troficzne tryby odżywiania protistów: płytkie głębokości poboru są ograniczone pod względem głównych składników odżywczych, natomiast głębsze są ograniczone przez dostępność światła. Ponadto próbki wody jeziornej uzupełniono różnymi rodzajami pożywek wzrostowych, aby stymulować wzrost różnorodnych organizmów fototroficznych.

RubisCO katalizuje etap limitujący szybkość w cyklu Calvina-Bensona-Basshama (CBB), głównym szlaku, za pomocą którego organizmy autotroficzne wiążą węgiel nieorganiczny i dostarczają węgiel organiczny dla wyższych poziomów troficznych w wodnych i lądowych sieciach pokarmowych ¹². W niniejszej badaniu zastosowano test radioizotopowy zmodyfikowany dla próbek filtrowanych ¹³, aby monitorować maksymalną aktywność karboksylazy jako wskaźnik potencjału wiązania węgla i wszechstronności metabolicznej w kulturach wzbogaconych z jeziora Bonney.

Protokół

1. Pozyskiwanie próbek

1. Wybierz i przygotuj miejsce poboru próbek na jeden dzień przed pobraniem próbek z kolumny wody. Pozwoli to na ponowne uformowanie się warstw stratyfikacyjnych kolumny wody po zakłóceniach spowodowanych wierceniem i topnieniem przerębla. Wyznacz lokalizację miejsca wiercenia za pomocą GPS.
2. Aby uzyskać dostęp do kolumny wody, rozpocznij od wywiercenia otworu w lodzie za pomocą świdra lodowego Jiffy z dołączonym 4-calowym przedłużeniem i wiertłem. Aby zapobiec zamarznięciu świdra w otworze, staraj się nie wiercić w wodzie ciekłej, zatrzymując wiercenie około 4-6 cali nad górną granicą kolumny wody.
3. Przed pobraniem próbek średnicę otworu wiertniczego należy powiększyć z 15 do 60 cm. Jest to realizowane za pomocą urządzenia do topnienia lodu (model Hotsy), które tłoczy podgrzany glikol polietylenowy przez miedzianą rurkę. Topnienie otworu trwa zazwyczaj do 18 godzin.
4. Przed pobraniem próbek z kolumny wody upewnij się, że cały wymagany sprzęt i naczynia do przechowywania próbek znajdują się w miejscu poboru. Materiały do pobierania próbek obejmują: butlę Niskin (pojemność 5-10 L), wciągarkę z kabelkiem skalibrowanym pod kątem głębokości, ciężarek (messenger), odpowiednią liczbę butelek na próbki dla każdej głębokości poboru oraz chłodziarki do transportu próbek.
5. Rozpocznij pobieranie próbek wcześnie rano (~5 rano), ponieważ filtrowanie wody z jeziora powinno zostać zakończone w dniu poboru. Pobierz próbki wody (1-5 L) z wybranych głębokości (w niniejszym badaniu: głębokości 6 m, 15 m i 18 m, mierzone od piezometrycznego poziomu wody w otworze lodowym) przy użyciu próbownika Niskin przymocowanego do skalibrowanej ręcznej wciągarki. Aby zapobiec zaburzeniom kolumny wody, pobieraj próbki z mniejszych głębokości przed głębszymi.
6. Przechowuj próbki wody z jeziora w chłodziarkach i transportuj je z miejsca poboru do laboratorium terenowego za pomocą sań przymocowanych do ATV (pojazdu terenowego). Próbki powinny zostać przetworzone lub ustabilizowane (np. poprzez błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie) w laboratorium terenowym niezwłocznie po pobraniu.

2. Rozwój kultur wzbogaconych

1. W celu hodowli kultur wzbogaconych, skoncentruj 0,5-1 L wody jeziornej na filtrach z polietersulfonu o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 μm, stosując łagodną filtrację (< 0,3 atm). Jeśli pożądane jest określenie różnorodności naturalnej społeczności, przefiltruj drugą próbkę na filtry z polietersulfonu o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 μm, a następnie postępuj zgodnie z protokołami według Bielewicz et al. ⁴ w celu oceny różnorodności filogenetycznej eukariotów.
2. Przenieś filtr do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 mL zawierającej ~20 mL przefiltrowanej wody jeziornej pobranej z tej samej głębokości co próbka na filtrze. Delikatnie wypłucz komórki z filtra za pomocą sterylnej pipety.
3. Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej kolby do hodowli komórkowej o powierzchni 25 cm². Dodaj przefiltrowaną wodę jeziorną pobraną z każdej głębokości próbkowania, aby zwiększyć objętość hodowli do 45 mL. Przygotuj wiele powtórzeń dla każdej głębokości próbkowania, jeśli pożądane jest wzbogacenie na różnych pożywkach.
4. Uzupełnij kolby z hodowlami sterylnymi roztworami 50X do końcowego stężenia 1X następujących pożywek: Bold's Basal Medium, BG11 oraz F/2. Jeśli wymagana jest hodowla organizmów miksotroficznych, przygotuj dwa naczynia uzupełnione pożywką F/2 i dodaj 2-3 ziarna sterylnego ryżu do jednej z kolb.
5. Inkubuj kolby z hodowlami w niskiej temperaturze (4 °C) i przy niskim natężeniu oświetlenia (20 μmol photons m^-2 s^-1) w inkubatorze wzrostowym z kontrolą temperatury przez co najmniej 4 tygodnie w Antarktyce przed wysyłką do laboratorium w USA. Jeśli pożądane są izolaty, po 2 tygodniach inkubacji wysej 250 μL kultury wzbogaconej na płytki z agarem zawierające odpowiednie pożywki wzrostowe.
6. Do transportu do USA przenieś kultury wzbogacone do sterylnych probówek typu Falcon o pojemności 50 mL. W zleceniu wysyłki zaznacz wymagania dotyczące transportu: „nie zamrażać” oraz „przechowywać w chłodzie”. Choć proces wysyłki z Antarktyki jest stosunkowo szybki (2 tygodnie transportem lotniczym komercyjnym) i wysoce niezawodny, istnieje możliwość utraty organizmów wymagających podczas transportu. W związku z tym badacze mogą chcieć zachować podpróbkę przed wysyłką, aby móc ocenić utratę niektórych gatunków podczas procesu transportu.
7. Po dotarciu do USA przenieś 5 mL kultury wzbogaconej do 45 mL odpowiedniej pożywki wzrostowej w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 mL zamkniętej sterylną gąbką. Kultury wzbogacone należy utrzymywać jako kultury stacjonarne w komorze wzrostowej z kontrolą parametrów środowiskowych (Diurnal Growth Chamber, VWR) w temperaturze 4 °C/20 μmol photons m^-2 s^-1. Kultury należy przenosić na świeże pożywki co 30 dni.

3. Ekstrakcja lizatu komórkowego z wzbogaconych frakcji filtrowanych

1. Przefiltruj 5 mL kultury wzbogaconej na filtr Whatman GF/F o średnicy 25 mm, stosując delikatną próżnię (<10 psi). Filtr można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C przed oznaczeniem aktywności RubisCO.
2. Potnij filtr na 4-5 części za pomocą sterylnych stalowych nożyczek i przenieś fragmenty sterylną pęsetą do probówki z nakrętką o pojemności 2 mL, wypełnionej w jednej piątej kuleczkami z cyrkona/krzemionki o średnicy 0,1 mm.
3. Dodaj 1,25 mL buforu do ekstrakcji z filtra (50 mM bicyna, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 5 mg/mL BSA oraz 0,1% triton X-100; dodaj bezpośrednio przed użyciem: 10 mM NaHCO₃, 10 mM DTT, 3,3 mM kwas aminokapronowy, 0,7 mM benzamidyna, pH 7,8) ¹³ i rozbij komórki za pomocą homogenizatora kulowego (Minibead beater) trzykrotnie przez 30 s przy ustawieniu prędkości 48. Aby zapobiec nagrzaniu próbki, przeplataj homogenizację 1-minutową inkubacją w lodzie.
4. Wiruj zawiesinę z filtra przez 2 min przy 3000 x g w temperaturze 4 °C, aby utworzył się luźny osad z włókien filtra GF/F i szczątków ścian komórkowych.
5. Pobierz alikwot 200 μL i zanurz w 800 μL lodowatego 90% acetonu. Zmierz zawartość ekstrahowalnego chlorofilu (chl) a w spektrofotometrze przy długościach fali 664 nm i 647 nm ¹⁴. Przenieś nadsącz do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
6. Wiruj pozostały nadsącz w temperaturze 4 °C przez 2 min przy 15 000 x g i przenieś nadsącz (unikając osadu z nierozpuszczalnych błon komórkowych i pozostałych włókien filtra GF/F) do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Ten rozpuszczalny lizat komórkowy może być teraz wykorzystany w teście aktywności karboksylazy RubisCO.
7. Lizat można przechowywać w temperaturze -80 °C po dodaniu 12,5% glicerolu i szybkim zamrożeniu w ciekłym azocie. W zależności od wrażliwości enzymów w lizacie, po wielokrotnych cyklach zamrażania i rozmrażania może dojść do utraty aktywności. Dlatego przed przeprowadzeniem ekstrakcji lizatu komórkowego na dużą skalę należy przetestować aktywność lizatu świeżego w porównaniu z mrożonym.

4. Test filtracyjny aktywności karboksylazy RubisCO

1. Przenieś 125 μL rozpuszczalnego lizatu do schłodzonej na lodzie probówki do mikrocentrifugi o pojemności 15 mL z nakrętką (nakrętka nie jest wymagana). W przypadku próbek kontrolnych ujemnych przenieś 125 μL rozpuszczalnego lizatu do probówki do mikrocentrifugi o pojemności 15 mL z nakrętką, ale nie dodawaj substratu (w kroku 4.7). Przeprowadź reakcje w dubletach dla wszystkich próbek i kontroli ujemnych.
2. Przygotuj świeżą porcję 10 mL buforu do testu (50 mM Bicine-NaOH, pH 8.0, 50 mM NaHCO₃, 25 mM MgCl₂) i schłodź na lodzie. Odmierz odpowiednią ilość buforu do testu dla wszystkich próbek i kontroli ujemnych (100 μL na próbkę/kontrolę plus dodatkowe 100 μL) do probówki o pojemności 5 mL. Wszystkie kolejne kroki wykonuj pod dygestorium.
3. Do odmierzonego buforu dodaj 40 μL NaH¹⁴CO₃ (500 μCi/mL) na każdy 1 mL buforu do testu i przechowuj bufor na lodzie.
4. Pobierz 10 μL buforu do testu zawierającego ¹⁴C i rozcieńcz w 1 mL buforu do testu. Po wymieszaniu przez odwrócenie, dodaj 100 μL mieszaniny rozcieńczonej w stosunku 1:100 do 3 mL koktajlu do zliczania scyntylacyjnego Bio-Safe II w fiolce scyntylacyjnej. Wymieszaj przez odwrócenie. Przed kontynuacją testu liczba zliczeń scyntylacyjnych (Beckman LS6500) powinna przekraczać 18 000 cpm.
5. Po dodaniu odpowiedniej ilości NaH¹⁴CO₃ do buforu do testu, przenieś probówki z reakcją do suchego bloku ustawionego na 25 °C i inkubuj przez 3-5 min.
6. Dodaj 100 μL buforu do testu do lizatów i inkubuj przez 5 min w temperaturze 25 °C.
7. Dodaj do próbek 20 μL 15 mM rybulozobisfosforanu i pozwól reakcji przebiegać przez 5-10 min w temperaturze 25 °C.
8. Dodaj 100 μL kwasu propionowego (100%) (Fisher), aby zatrzymać reakcję. Wirować przez 1 godzinę przy 2 000 ×g w celu usunięcia niewłączonego ¹⁴C.
9. Przenieś całkowitą objętość próbek do fiolek scyntylacyjnych zawierających 3 mL koktajlu do zliczania scyntylacyjnego Bio-Safe II. Wyznacz cpm kwasostabilnych produktów końcowych za pomocą zliczania scyntylacyjnego (komunikacja osobista B. Witte, R. Tabita).
10. Oblicz szybkość aktywności RubisCO w przeliczeniu na chl a ¹⁴.

5. Reprezentatywne wyniki

Wykorzystaliśmy hodowlę wzbogacającą do izolacji przystosowanych do zimna protistów fototroficznych i miksotroficznych zamieszkujących antarktyczne jezioro Bonney. Aby uchwycić większą różnorodność organizmów, przetestowaliśmy trzy rodzaje pożywek wzrostowych: pożywkę Bold's Basal Medium (BBM) ¹⁵, pożywkę morską F/2-Si ^{16, 17} oraz pożywkę BG11 ¹⁸. Wizualna inspekcja kultur wzbogaconych za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała, że w kulturach dominowały protisty fototroficzne (o czym świadczyła obecność pigmentu chlorofilu w większości komórek) oraz że występowała w nich różnorodność morfologii komórek, zależna od głębokości poboru próbki, z której pobrano inokulum, oraz rodzaju pożywki zastosowanej w hodowli (Rys. 1).

Maksymalne szybkości aktywności karboksylazy katalizowanej przez enzym RubisCO zmierzyliśmy jako wskaźnik potencjału wiązania węgla. Monitorowano również zawartość Chl a jako szacunek biomasy protistów fototroficznych (Rys. 2). Pomimo hodowli wszystkich kultur w tym samym reżimie temperatury i oświetlenia (tj. 4 °C/20 μmol m^-2 s^-1), potencjał wiązania węgla i biomasa fototroficzna znacząco różniły się pomiędzy kulturami wzbogaconymi. Maksymalną aktywność RubisCO zaobserwowano w kulturach wzbogaconych rosnących w pożywkach BBM (Wzbogacenia 4 i 6) lub BG11 (Wzbogacenia 13 i 14), podczas gdy kultury wzbogacane na pożywce F/2 (Wzbogacenia 19, 21, 23) wykazały od 4 do 34 razy niższą maksymalną aktywność karboksylazy. Różnice te nie wynikały z niższego poziomu biomasy w kulturach F/2, ponieważ aktywność karboksylazy wyrażono w przeliczeniu na Chl a. Ponadto aktywność RubisCO nie korelowała z stężeniem chl a (r = -0,023, p>0,1; Rys. 2, wstawka). Kultury BBM zaszczepione wodą jeziorną z głębokości 6 m i 15 m (Wzbogacenia 4 i 5) miały najwyższe poziomy chl a, podczas gdy wszystkie pozostałe kultury wykazały stosunkowo niską zawartość chl a, niezależnie od aktywności enzymu RubisCO (Rys. 2).

Rysunek 1. Reprezentatywne kultury wzbogacone mikroorganizmów eukariotycznych, w których wyselekcjonowano wzrost różnych organizmów. Tożsamość kultury podano w lewym dolnym rogu paneli. Wszystkie obrazy przedstawiają mikrografie świetlne wykonane z użyciem imersji olejowej przy powiększeniu 1000X.

Rycina 2. Potencjalna zdolność do wiązania węgla i poziomy ekstrahowalnego chlorofilu a w kulturach wzbogaconych antarktycznych eukariotów mikrobowych wyizolowanych z jeziora Bonney i hodowanych na różnych pożywkach. Szczegóły dotyczące kultur znajdują się w Tabeli 1. Wstawka: Korelacja Persona między zawartością chlorofilu a a potencjałem wiązania węgla w kulturach wzbogaconych antarktycznych eukariotów mikrobowych.

Dyskusja

Niedawne badania molekularne wykazały wysoką różnorodność jednokomórkowych eukariotów w różnych środowiskach ^{3, 19, 20}; jednak ze względu na brak izolatów z pełnego zakresu siedlisk protistów, funkcjonalne role tych poszczególnych gatunków w sieciach troficznych pozostają w dużej mierze nieznane. W niniejszym badaniu opisaliśmy metodologie wzbogacania gatunków mikrobiologicznych eukariotów wykazujących wszechstronność metaboliczną ze środowiska stosunkowo słabo przebadanego – stale pokrytego lodem jeziora anta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BBM	Sigma-Aldrich	B5282
BG11	Sigma-Aldrich	C3061
F/2	Sigma-Aldrich	G9903
filtr GF/F, 25 mm	Fisher Scientific	09-874-64
filtr GF/F, 47 mm	Fisher Scientific	09-874-71
Filtr z polietersulfonu, 0,45 μpore m, 47 mm	Pall Corporation	61854
Sterylna k flask do hodowli komórkowej, 25 cm²2	Corning	430639
Komora wzrostowa z cyklem dobowym	VWR International	35960-076
Kuleczki z cyrkonii/krzemionki, średnica 0,1 mm	Produkty Biospec	Niestety, przesłany przez Ciebie tekst składa się jedynie z ciągu cyfr i liter (11079101z), który nie zawiera treści merytorycznej do tłumaczenia. Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego w języku angielskim, aby możliwe było przygotowanie profesjonalnego tłumaczenia naukowego.
Miniaturowy homogenizator kuleczkowy	Produkty Biospec	3110BX
probówka do mikrowirówki z nakrętką (1,5 μL)	USA Scientific, Inc.	1415-8700
NaH14Tlenek węgla3	ViTrax	VC 194	Przechowywać w aliquotach po 400 μL przy -20°C
RuBP	Sigma-Aldrich	R0878-100mg	Rozpuścić w 10 mM buforze Tris-kwas propionowy (pH 6,5)