Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Podsumowanie

Eukarioty mikrobiologiczne są zarówno źródłem węgla pochodzenia fotosyntetycznego, jak i drapieżnymi gatunkami szczytowymi w stale pokrytych lodem jeziorach Antarktydy. Niniejszy raport opisuje podejście oparte na kulturach wzbogaconych w celu izolacji metabolicznie wszechstronnych eukariotów mikrobiologicznych z antarktycznego jeziora Bonney oraz ocenia potencjał asymilacji węgla nieorganicznego przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy (RubisCO).

Streszczenie

Jezioro Bonney jest jednym z wielu stale pokrytych lodem jezior położonych w suchych dolinach McMurdo na Antarktydzie. Całoroczna pokrywa lodowa utrzymuje chemiczne uwarstwienie kolumny wody i, w przeciwieństwie do innych śródlądowych zbiorników wodnych, w znacznym stopniu zapobiega zewnętrznemu dopływowi węgla i składników odżywczych ze strumieni. Biota jest narażona na liczne stresory środowiskowe, w tym całoroczny silny niedobór składników odżywczych, niskie temperatury, ekstremalny cień, hypersalinity oraz 24-godzinny mrok podczas zimy ¹. Te ekstremalne warunki środowiskowe ograniczają biotę w jeziorze Bonney niemal wyłącznie do mikroorganizmów ².

Jednokomórkowe mikroorganizmy eukariotyczne (nazywane „protistami”) są istotnymi uczestnikami globalnego cyklu biogeochemicznego ³ i pełnią ważne role ekologiczne w obiegu węgla w jeziorach suchych dolin, zajmując zarówno role pierwotne, jak i trzeciorzędowe w wodnej sieci troficznej. W wodnej sieci troficznej suchych dolin protisty wiążące węgiel nieorganiczny (autotrofia) są głównymi producentami węgla organicznego dla organizmów organotroficznych ^{4, 2}. Protisty fagotroficzne lub heterotroficzne, zdolne do pochłaniania bakterii i mniejszych protistów, pełnią rolę drapieżników szczytowych w sieci troficznej ⁵. Ponadto nieznana część populacji protistów jest zdolna do połączonego metabolizmu miksotroficznego ^{6, 7}. Miksotrofia u protistów polega na zdolności do łączenia funkcji fotosyntetycznych z fagotroficznym pochłanianiem mikroorganizmów będących ofiarami. Ta forma miksotrofii różni się od metabolizmu miksotroficznego u gatunków bakterii, który zazwyczaj polega na pobieraniu rozpuszczonych cząsteczek węgla. Obecnie istnieje bardzo niewiele izolatów protistów z polarnych jezior stale pokrytych lodem, a badania nad różnorodnością i ekologią protistów w tym ekstremalnym środowisku były ograniczone ^{8, 4, 9, 10, 5}. Lepsze zrozumienie wszechstronności metabolicznej protistów w prostej sieci troficznej jezior suchych dolin pomoże w opracowaniu modeli dotyczących roli protistów w globalnym cyklu węglowym.

Zastosowano metodę hodowli wzbogaconej w celu wyizolowania potencjalnie fototroficznych i miksotroficznych protistów z jeziora Bonney. Głębie poboru próbek z kolumny wody wybrano w oparciu o lokalizację maksimów produkcji pierwotnej i różnorodność filogenetyczną protistów ^{4, 11}, a także zmienność głównych czynników abiotycznych wpływających na troficzne tryby odżywiania protistów: płytkie głębokości poboru są ograniczone pod względem głównych składników odżywczych, natomiast głębsze są ograniczone przez dostępność światła. Ponadto próbki wody jeziornej uzupełniono różnymi rodzajami pożywek wzrostowych, aby stymulować wzrost różnorodnych organizmów fototroficznych.

RubisCO katalizuje etap limitujący szybkość w cyklu Calvina-Bensona-Basshama (CBB), głównym szlaku, za pomocą którego organizmy autotroficzne wiążą węgiel nieorganiczny i dostarczają węgiel organiczny dla wyższych poziomów troficznych w wodnych i lądowych sieciach pokarmowych ¹². W niniejszej badaniu zastosowano test radioizotopowy zmodyfikowany dla próbek filtrowanych ¹³, aby monitorować maksymalną aktywność karboksylazy jako wskaźnik potencjału wiązania węgla i wszechstronności metabolicznej w kulturach wzbogaconych z jeziora Bonney.

Protokół

1. Pozyskiwanie próbek

1. Wybierz i przygotuj miejsce poboru próbek na jeden dzień przed pobraniem próbek z kolumny wody. Pozwoli to na ponowne uformowanie się warstw stratyfikacyjnych kolumny wody po zakłóceniach spowodowanych wierceniem i topnieniem lodu w otworze. Wyznacz lokalizację miejsca wiercenia za pomocą GPS.
2. Aby uzyskać dostęp do kolumny wody, rozpocznij od wywiercenia otworu w lodzie za pomocą świdra lodowego Jiffy z dołączonym 4-calowym przedłużeniem i wiertłem. Aby zapobiec zamarznięciu świdra w otworze, staraj się unikać wiercenia w wodzie ciekłej, przerywając wiercenie około 4-6 cali nad górną powierzchnią kolumny wody.
3. Przed pobraniem próbek średnica otworu wiertniczego musi zostać powiększona z 15 do 60 cm. Jest to realizowane za pomocą urządzenia do topienia otworów (model Hotsy), które tłoczy podgrzany glikol polietylenowy przez miedzianą rurkę. Topnienie otworu trwa zazwyczaj do 18 godzin.
4. Przed pobraniem próbek z kolumny wody upewnij się, że cały wymagany sprzęt i naczynia do przechowywania próbek znajdują się w miejscu poboru. Materiały do pobierania próbek obejmują: butlę Niskin (pojemność 5-10 L), wyciągarkę z kabelkiem skalibrowanym pod kątem głębokości, ciężarek (messenger), odpowiednią liczbę butelek na każdą głębokość poboru oraz chłodnie do transportu próbek.
5. Rozpocznij pobieranie próbek wcześnie rano (~godz. 5:00), ponieważ filtrowanie wody jeziornej powinno zostać zakończone w dniu poboru. Pobierz próbki wody (1-5 L) z wybranych głębokości (w niniejszym badaniu: głębokości 6 m, 15 m i 18 m, mierzone od piezometrycznego poziomu wody w otworze lodowym), używając próbąbnika Niskin przymocowanego do skalibrowanej ręcznej wyciągarki. Aby uniknąć zaburzenia kolumny wody, pobieraj próbki z mniejszych głębokości przed próbkami z głębokości większych.
6. Przechowuj próbki jeziorne w chłodniach i transportuj je z miejsca poboru do laboratorium polowego za pomocą sani przyczepionych do pojazdu ATV (pojazd terenowy). Próbki powinny zostać przetworzone lub ustabilizowane (np. poprzez szybkie zamrażanie w ciekłym azocie) w laboratorium polowym niezwłocznie po pobraniu.

2. Tworzenie kultur wzbogaconych

1. W celu hodowli kultur wzbogaconych, skoncentruj 0,5-1 L wody jeziornej na filtrach z polietersulfonu o średnicy 47 mm i rozmiarze oczek 0,45 μm, stosując łagodną filtrację (< 0,3 atm). Jeśli wymagana jest analiza różnorodności naturalnej społeczności, przefiltruj drugą próbkę na filtry z polietersulfonu o średnicy 47 mm i rozmiarze oczek 0,45 μm, a następnie postępuj zgodnie z protokołami Bielewicz et al. ⁴ w celu oceny różnorodności filogenetycznej eukariotów.
2. Przenieś filtr do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 mL zawierającej ok. 20 mL filtrowanej wody jeziornej, pobranej z tej samej głębokości co próbka do filtracji. Delikatnie wypłucz komórki z filtra za pomocą sterylnej pipety.
3. Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej kolby do hodowli komórkowych o powierzchni 25 cm². Dodaj filtrowaną wodę jeziorną pobraną z każdej głębokości próbkowania, aby zwiększyć objętość hodowli do 45 mL. Przygotuj wiele powtórzeń dla każdej głębokości próbkowania, jeśli planowane jest wzbogacanie na różnych pożywkach.
4. Uzupełnij kolby hodowlane sterylnymi roztworami 50X do końcowego stężenia 1X następujących pożywek: Bold's Basal Medium, BG11 i F/2. Jeśli wymagana jest hodowla organizmów miksotroficznych, przygotuj dwa naczynia z dodatkiem F/2 i do jednej z kolb dodaj 2-3 ziarna sterylnego ryżu.
5. Inkubuj kolby hodowlane w niskiej temperaturze (4 °C) i przy niskim natężeniu promieniowania (20 μmol photons m^-2 s^-1) w inkubatorze wzrostu z kontrolą temperatury przez co najmniej 4 tygodnie w Antarktyce przed wysyłką do laboratorium w USA. Jeśli pożądane są izolaty, po 2 tygodniach inkubacji wysej 250 μL kultury wzbogaconej na płytki z agarem zawierającym odpowiednie pożywki.
6. Do transportu do USA przenieś kultury wzbogacone do sterylnych probówek typu Falcon 50-mL. W zleceniu transportowym zaznacz wymagania „nie zamrażać” (do not freeze) oraz „przechowywać w chłodzie” (keep cool). Chociaż proces transportu z Antarktyki jest stosunkowo szybki (2 tygodnie transportem lotniczym) i wysoce niezawodny, istnieje możliwość utraty organizmów wymagających podczas transportu. Dlatego badacze mogą chcieć zachować podpróbkę przed wysyłką, aby móc ocenić utratę niektórych gatunków w trakcie transportu.
7. Po przybyciu do USA przenieś 5 mL kultury wzbogaconej do 45 mL odpowiedniej pożywki w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 mL, zamkniętej sterylną gąbką. Kultury wzbogacone powinny być utrzymywane jako kultury stojące w komorze wzrostu z kontrolowanym środowiskiem (Diurnal Growth Chamber, VWR) w temperaturze 4 °C i przy natężeniu 20 μmol photons m^-2 s^-1. Kultury należy przelewać do świeżych pożywek co 30 dni.

3. Ekstrakcja lizatu komórkowego z wzbogaconych próbek po filtracji

1. Przefiltrować 5 mL kultury wzbogaconej przez filtr Whatman GF/F o średnicy 25 mm, stosując delikatną próżnię (<10 psi). Filtr można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C przed oznaczeniem aktywności RubisCO.
2. Przeciąć filtr na 4-5 części za pomocą sterylnych stalowych nożyczek i przenieść fragmenty sterylną pęsetą do probówki z nakrętką o pojemności 2 mL, wypełnionej w jednej piątej części kuleczkami z cyrkonii/krzemionki o średnicy 0,1 mm.
3. Dodać 1,25 mL buforu do ekstrakcji filtra (50 mM bicyny, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 5 mg/mL BSA i 0,1% Triton X-100; dodać świeżo: 10 mM NaHCO₃, 10 mM DTT, 3,3 mM kwasu aminokapronowego, 0,7 mM benzamidyny, pH 7,8) ¹³ i rozbić komórki za pomocą homogenizatora kuleczkowego (Minibead beater) trzykrotnie przez 30 s przy ustawieniu prędkości 48. Aby zapobiec nagrzewaniu się próbki, należy przeplatać homogenizację z 1-minutową inkubacją w lodzie.
4. Wirować zawiesinę z filtra przez 2 min przy 3000 x g w temperaturze 4 °C, aby utworzyć luźny osad z włókien filtra GF/F i szczątków ścian komórkowych.
5. Pobrać alikwot 200 μL i zanurzyć w 800 μL lodowatego 90% acetonu. Zmierzyć ilość ekstrahowalnego chlorofilu (chl) a w spektrofotometrze przy długościach fal 664 nm i 647 nm ¹⁴. Przenieść nadsącz do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
6. Wirować pozostały nadsącz w temperaturze 4 °C przez 2 min przy 15 000 x g i przenieść nadsącz (unikając osadu z nierozpuszczalnych błon komórkowych i pozostałych włókien filtra GF/F) do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Ten rozpuszczalny lizat komórkowy może zostać teraz wykorzystany w teście aktywności karboksylazy RubisCO.
7. Lizat można przechowywać w temperaturze -80 °C po dodaniu 12,5% glicerolu i szybkim zamrożeniu w ciekłym azocie. Po wielokrotnych cyklach zamrażania i rozmrażania może nastąpić utrata aktywności, w zależności od wrażliwości enzymów w lizacie. Dlatego przed ekstrakcjami lizatów komórkowych na dużą skalę należy sprawdzić aktywność lizatu świeżego w porównaniu z mrożonym.

4. Analiza aktywności karboksylazy RubisCO z wykorzystaniem filtracji

1. Przenieś 125 μL rozpuszczalnego lizatu do schłodzonej na lodzie probówki do mikrowirówki o pojemności 15 mL z nakrętką (nakrętka nie jest wymagana). W przypadku próbek kontroli negatywnej dodaj 125 μL rozpuszczalnego lizatu do probówki do mikrowirówki o pojemności 15 mL z nakrętką, ale nie dodawaj substratu (w kroku 4.7). Przeprowadź reakcje w dubletach dla wszystkich próbek i kontroli negatywnych.
2. Przygotuj świeżą porcję 10 mL buforu do analizy (50 mM Bicine-NaOH, pH 8.0, 50 mM NaHCO₃, 25 mM MgCl₂) i schłodź na lodzie. Odmierz wystarczającą ilość buforu do analizy dla wszystkich próbek i kontroli negatywnych (100 μL na próbkę/kontrolę plus dodatkowe 100 μL) do probówki o pojemności 5 mL. Wszystkie kolejne kroki wykonuj pod dygestorium.
3. Dodaj 40 μL NaH¹⁴CO₃ (500 μCi/mL) na każdy 1 mL buforu do analizy do odmierzonego buforu i utrzymuj go na lodzie.
4. Pobierz 10 μL buforu do analizy zawierającego ¹⁴C i rozcieńcz w 1 mL buforu do analizy. Po wymieszaniu poprzez odwrócenie probówki, dodaj 100 μL rozcieńczonej mieszaniny (1:100) do 3 mL koktajlu do zliczania scyntylacyjnego Bio-Safe II w fiolce scyntylacyjnej. Wymieszaj poprzez odwrócenie. Przed kontynuacją analizy liczba zliczeń scyntylacyjnych (Beckman LS6500) powinna przekraczać 18 000 cpm.
5. Po dodaniu odpowiedniej ilości NaH¹⁴CO₃ do buforu do analizy, przenieś probówki z reakcją do blokowej grzałki ustawionej na 25 °C i inkubuj przez 3-5 min.
6. Dodaj 100 μL buforu do analizy do lizatów i inkubuj przez 5 min w temperaturze 25 °C.
7. Dodaj 20 μL 15 mM rybulozobisfosforanu do próbek i pozwól reakcji przebiegać przez 5-10 min w temperaturze 25 °C.
8. Dodaj 100 μL kwasu propionowego (100%) (Fisher), aby zatrzymać reakcję. Wiruj przez 1 godzinę przy 2 000 x g, aby usunąć niewprowadzony do związku ¹⁴C.
9. Przenieś całkowitą objętość próbek do fiolek scyntylacyjnych zawierających 3 mL koktajlu do zliczania scyntylacyjnego Bio-Safe II. Wyznacz cpm kwasostabilnych produktów końcowych za pomocą zliczania scyntylacyjnego (B. Witte, R. Tabita komunikacja osobista).
10. Oblicz tempo aktywności RubisCO w przeliczeniu na zawartość chl a ¹⁴.

5. Reprezentatywne wyniki

Wykorzystaliśmy hodowle wzbogacone do wyizolowania zimnolubnych protist fototroficznych i miksotroficznych zamieszkujących antarktyczne jezioro Bonney. Aby uchwycić większą różnorodność organizmów, przetestowano trzy rodzaje pożywek wzrostowych: Bold's Basal Medium (BBM) ¹⁵, F/2-Si Marine Medium ^{16, 17} oraz pożywkę BG11 ¹⁸. Inspekcja wizualna kultur wzbogaconych za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała, że w kulturach dominowały protisty fototroficzne (o czym świadczyła obecność pigmentu chlorofilu w większości komórek), a dodatkowo występowała różnorodność morfologii komórek w zależności od głębokości pobrania inokulum oraz rodzaju pożywki zastosowanej w hodowli (Rys. 1).

Maksymalne tempo aktywności karboksylazy katalizowanej przez enzym RubisCO zmierzono jako wskaźnik potencjału wiązania węgla. Monitorowano również zawartość chl a jako szacunek biomasy protistów fototroficznych (Fig. 2). Pomimo hodowli wszystkich kultur w tym samym reżimie temperatury i oświetlenia (tj. 4 °C/20 μmol m^-2 s^-1), potencjał wiązania węgla i biomasa fototroficzna różniły się drastycznie pomiędzy kulturami wzbogaconymi. Maksymalną aktywność RubisCO zaobserwowano w kulturach wzbogaconych rosnących w pożywkach BBM (wzbogacenia 4 i 6) lub BG11 (wzbogacenia 13 i 14), podczas gdy kultury wzbogacone na pożywce F/2 (wzbogacenia 19, 21, 23) wykazały od 4 do 34 razy niższą maksymalną aktywność karboksylazy. Różnice te nie wynikały z niższego poziomu biomasy w kulturach F/2, ponieważ aktywność karboksylazy wyrażono w przeliczeniu na chl a. Co więcej, aktywność RubisCO nie korelowała z koncentracją chl a (r = -0,023, p>0,1; Fig. 2, wstawka). Kultury BBM zaszczepione wodą jeziorną z głębokości 6 m i 15 m (wzbogacenia 4 i 5) miały najwyższe poziomy chl a, podczas gdy wszystkie pozostałe kultury wykazały stosunkowo niską zawartość chl a, niezależnie od aktywności enzymu RubisCO (Fig. 2).

Rysunek 1. Reprezentatywne kultury wzbogacone mikroorganizmów eukariotycznych, w których wyselekcjonowano wzrost różnych organizmów. Tożsamość kultury podano w lewym dolnym rogu paneli. Wszystkie obrazy to mikrofotografie świetlne wykonane z użyciem imersji olejowej przy powiększeniu 1000X.

Rycina 2. Potencjalna zdolność do fiksacji węgla oraz poziomy ekstrahowalnego chlorofilu a w kulturach wzbogaconych antarktycznych eukariotycznych mikroorganizmów izolowanych z jeziora Bonney i hodowanych na różnych podłożach kulturacyjnych. Szczegóły dotyczące kultur znajdują się w Tabeli 1. Wstawka: Korelacja Pearsona między zawartością chlorofilu a a potencjałem fiksacji węgla w kulturach wzbogaconych antarktycznych eukariotycznych mikroorganizmów.

Dyskusja

Niedawne badania molekularne wykazały wysoką różnorodność jednokomórkowych eukariotów w różnych środowiskach ^{3, 19, 20}; jednak ze względu na brak izolatów z pełnego zakresu siedlisk protistów, funkcjonalne role tych poszczególnych gatunków w sieciach troficznych pozostają w dużej mierze nieznane. W niniejszym badaniu opisaliśmy metodologie wzbogacania gatunków mikrobiologicznych eukariotów wykazujących wszechstronność metaboliczną ze środowiska stosunkowo słabo przebadanego – stale pokrytego lodem jeziora anta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BBM	Sigma-Aldrich	B5282
BG11	Sigma-Aldrich	C3061
F/2	Sigma-Aldrich	G9903
filtr GF/F, 25 mm	Fisher Scientific	09-874-64
filtr GF/F, 47 mm	Fisher Scientific	09-874-71
Filtr z polietersulfonu, 0,45 μpore m, 47 mm	Pall Corporation	61854
Sterylna k flask do hodowli komórkowej, 25 cm²2	Corning	430639
Komora wzrostowa z cyklem dobowym	VWR International	35960-076
Kuleczki z cyrkonii/krzemionki, średnica 0,1 mm	Produkty Biospec	Niestety, przesłany przez Ciebie tekst składa się jedynie z ciągu cyfr i liter (11079101z), który nie zawiera treści merytorycznej do tłumaczenia. Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego w języku angielskim, aby możliwe było przygotowanie profesjonalnego tłumaczenia naukowego.
Miniaturowy homogenizator kuleczkowy	Produkty Biospec	3110BX
probówka do mikrowirówki z nakrętką (1,5 μL)	USA Scientific, Inc.	1415-8700
NaH14Tlenek węgla3	ViTrax	VC 194	Przechowywać w aliquotach po 400 μL przy -20°C
RuBP	Sigma-Aldrich	R0878-100mg	Rozpuścić w 10 mM buforze Tris-kwas propionowy (pH 6,5)