Opisujemy prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych i czułych na wapń do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego z wykorzystaniem polietylenowej pipety ssącej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Retrogradne znakowanie neuronów jest standardową metodą anatomiczną1,2, która była wykorzystywana również do wprowadzania do neuronów barwników wrażliwych na wapń i napięcie3-6. Zazwyczaj barwniki te aplikuje się w postaci stałych kryształów lub poprzez lokalne wstrzyknięcie pod ciśnieniem za pomocą pipet szklanych. Może to jednak prowadzić do rozcieńczenia barwnika i zmniejszenia intensywności znakowania, szczególnie gdy dyfuzja barwnika wymaga kilku godzin. W niniejszej pracy prezentujemy prostą i niedrogą technikę wprowadzania barwników fluorescencyjnych i jonowo-wrażliwych do neuronów z użyciem polietylenowej pipety ssącej wypełnionej roztworem barwnika. Metoda ta stanowi niezawodny sposób utrzymania wysokiego stężenia barwnika w kontakcie z aksonami przez cały czas trwania procedury wprowadzania.
Protokół
Fluorescencyjne dekstrany były wykorzystywane jako narzędzia anatomiczne oraz do obrazowania aktywności neuronalnej1-4. Fields i in. al., (2009)4 opublikowano protokół dotyczący stosowania barwników czułych na jony i napięcie w obrębie traktów aksonalnych, z uwzględnieniem rdzenia kręgowego jako układu modelowego. Poniżej opisujemy szczegółową procedurę aplikacji barwników fluorescencyjnych i/lub czułych na jony do przeciętych korzeni brzusznych, korzeni grzbietowych lub dowolnego traktu neuronalnego rdzenia kręgowego w celu in vitro badania optofizjologiczne i morfologiczne.
1. Pipety typu I i typu II
Rozpocznij od ogrzania dwóch krótkich odcinków rurek polietylenowych (PE90, marka Clay Adams) nad płomieniem lampy alkoholowej7, aby wytworzyć pipety z zwężającymi się końcówkami. Pierwsza pipeta (typ I) powinna być krótka (3-7 mm) i posiadać małą końcówkę, która może ściśle objąć docelowy korzeń lub szlak (średnica zewnętrzna: 0,2-0,4 mm; średnica wewnętrzna: 0,1-0,3 mm). Następnie wytwór drugą pipetę (typ II) z dłuższą (8-12 cm), cieńszą trzonową częścią i bardzo cienką końcówką (średnica zewnętrzna: 0,2-0,3 mm; średnica wewnętrzna: 0,1-0,2 mm), która może zostać wprowadzona do pipety typu I aż do jej końca. Druga, cieńsza pipeta będzie służyć odpowiednio do aspiracji i wprowadzania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) oraz roztworu barwnika przez pipetę typu I.
2. Pozycjonowanie pipety typu I
Przeprowadzić sekcję i wyizolować rdzeń kręgowy8,9, a następnie umieścić go w kąpieli z ciągłym przepływem schłodzonego aCSF (~16 °C) podczas całego procesu ładowania. Umieścić pipetę typu I w uchwycie do elektrod (uchwyt do elektrod H1/12, Narishige) w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z strzykawką (strzykawka insulinowa 1ml U-100, Becton Dickenson lub odpowiednik) za pomocą elastycznego przewodu (PharMed BPT, Cole-Parmer, #AY242002; 10 cm) (Rys.1A-B).
3. Aplikacja barwnika
- Za pomocą strzykawki należy najpierw nabrać aCSF do pipety typu I (Rys. 1B; 2A), a następnie do wypełnianego traktu aksonalnego lub korzenia (Rys. 2B). Następnie należy usunąć elastyczną rurkę z tylnego otworu. Pipetę typu II podłącza się do drugiej strzykawki i wprowadza do pipety typu I utrzymującej trakt aksonalny lub korzeń. Używając strzykawki podłączonej do pipety typu II, należy odessać aCSF w taki sposób, aby pozostały płyn jedynie pokrywał trakt aksonalny (Rys. 1C; 2C-D). Następnie należy wyciągnąć pipetę typu II z pipety typu I. Poziom aCSF należy monitorować przez kilka minut, aby zweryfikować szczelność zamknięcia traktu aksonalnego lub nerwów (patrz sekcja 3 w Rozwiązywaniu problemów pod hasłem „szczelność”).
- Barwnik należy rozpuścić w aCSF lub 0,2% triton X-100 w wodzie dwukrotnie destylowanej i nabrać go do pipety typu II, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pipetę typu II zawierającą barwnik należy wprowadzić do pipety typu I oraz do pozostałego roztworu aCSF (Rys. 2E). Barwnik należy powoli uwalniać do aCSF, stosując delikatne ciśnienie dodatnie (Rys. 2F). Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i nie spowodować przemieszczenia tkanki docelowej wewnątrz końcówki. Pipetę typu II należy wycofać po uwolnieniu odpowiedniej ilości barwnika (3-5 μL roztworu barwnika).
4. Inkubacja
Inkubuj tkankę w ciemności od 6 do 20 godzin, w zależności od rodzaju eksperymentu. Po upływie czasu wystarczającego do wypełnienia, delikatnie wyciągnij elektrodę z tkanki, pozostawiając ją w stanie gotowym do obrazowania lub analizy histologicznej.
Rozwiązywanie problemów
- Jeśli tkanka docelowa nie wchodzi łatwo do końcówki pipety typu I lub jest luźna po wprowadzeniu, oznacza to, że średnica końcówki jest niewłaściwa. W takim przypadku wyciągnij ją i użyj innej pipety.
- Przed dodaniem barwnika do aCSF w pipecie typu I upewnij się, że pozostało wystarczająco dużo aCSF, aby można go było dosięgnąć końcówką pipety typu II (Rys. 2D). W przeciwnym razie po dodaniu barwnika powstanie przerwa powietrzna. Jeśli tak się stanie, nie dodawaj barwnika, wyjmij wiązkę aksonalną z pipety, a następnie ponownie ją wprowadź z wystarczającą ilością aCSF, aby była dostępna dla pipety typu II.
- Jeśli poziom aCSF w pipecie typu I wzrośnie po aspiracji pipetą typu II, oznacza to, że uszczelnienie z tkanką jest niedostateczne. Użyj innej elektrody, w przeciwnym razie barwnik zostanie rozcieńczony podczas procedury znakowania.
- Jeśli podczas wstrzykiwania barwnika do pipety typu I zostanie wprowadzony pęcherzyk powietrza, usuń go, przesuwając końcówkę pipety typu II blisko pęcherzyka i delikatnie przykładając słabe podciśnienie za pomocą dołączonej strzykawki.
5. Reprezentatywne wyniki
Aby zilustrować zastosowanie tej metody, jednocześnie wprowadziliśmy do neuronów ruchowych, aferentnych neuronów sensorycznych i interneuronów rdzeniowych trzy różne barwniki fluorescencyjne sprzężone z dekstranem (Ryc. 3A). Jak pokazano na Ryc. 3B, oznakowano trzy klasy neuronów: aferentne neurony sensoryczne (czerwone), interneurony rzutujące do sznura brzusznego (zielone) oraz neurony ruchowe (niebieskie).
Rysunek 1. Schemat przedstawiający montaż pipet typu I i typu II. (A) Pipeta typu I (jasnoniebieska) jest umieszczona w uchwycie elektrody w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z elastyczną rurką elastomerową (B), w którą można włożyć pipetę typu II (C).
Rysunek 2. Schemat przedstawiający proces ładowania motoneuronów barwnikami fluorescencyjnymi. (A) Pipeta typu I zostaje umieszczona w pobliżu korzenia brzusznego, który ma zostać wypełniony. (B) Do pipety przyłożone zostaje podciśnienie, aby wciągnąć aCSF do pipety, a następnie korzeń. (C-D) Odłącz elastyczną rurkę elastomerową z tylnej części pipety typu I i zmniejsz ilość aCSF, przykładając podciśnienie do pipety typu II. (E) Wprowadź końcówkę pipety typu II zawierającej rozpuszczony barwnik do pozostałego w pipecie typu I roztworu aCSF. (E-F) Powoli wypełnij pipetę typu I barwnikiem, a następnie wyjmij pipetę typu II.
Rysunek 3. Zastosowanie procedury wypełniania w izolowanym rdzeniu kręgowym myszy. (A) Schemat przedstawiający trzy pipety typu I użyte do wypełnienia różnych klas neuronów w rdzeniu kręgowym. Motoneurony (niebieskie; Cascade Blue dextran) oraz sakralne aferentne neurony sensoryczne (czerwone; Texas-Red dextran) zostały wypełnione metodą wsteczną odpowiednio przez korzenie brzuszne i grzbietowe. Dekstran z fluoresceiną zastosowano do obciążenia interneuronów rdzeniowych (zielone), których aksony biegną wstępująco przez sznur brzuszny (VF). 1 mg każdego barwnika dekstranowego (10 000MW; Molecular Probes) rozpuszczono w 6 μL wody destylowanej zawierającej 0,2% Triton X-100 (B). Obraz konfokalny przekroju rdzenia sakralnego, w którym neurony zostały znakowane wstecznie zgodnie z opisem w punkcie A. Należy zauważyć, że znakowane aferenty sensoryczne są głównie ipsilateralne z nielicznymi projekcjami kontralateralnymi. Znakowane motoneurony znajdują się po stronie ipsilateralnej w stosunku do wypełnionego korzenia brzusznego, natomiast znakowane interneurony znajdują się po stronie kontralateralnej względem strony wypełnienia (grot strzałki). Pasek kalibracyjny 200 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy tutaj prosty i tani protokół wprowadzania barwników do neuronów, nerwów i szlaków rdzeniowych. Metoda ta polega na wystawieniu zidentyfikowanych dróg anatomicznych na działanie wysoce stężonego roztworu barwnika przez cały czas trwania procesu obciążania. Skutkuje to znakowaniem wstecznym miejsca docelowego przy niewielkim poziomie tła w porównaniu do mikroiniekcji, aplikacji kąpielowej oraz technik elektroporacji. Metoda ta jest jednak ograniczona do miejsc w układzie nerwowym, w których można wyizolować pęcz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez program wewnętrzny Narodowych Instytutów Zaburzeń Neurologicznych i Udaru w ramach Narodowych Instytutów Zdrowia. Chcielibyśmy również podziękować dr. George'owi Mentisowi za jego wcześniejszy wkład w opracowanie metody oraz dane przedstawione na Rysunku 3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3(2009).
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580(2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660(2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
