Artykuł metodologiczny

Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

DOI:

10.3791/4008

⸱

19 kwietnia 2012

 , 
1Developmental Neurobiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych i czułych na wapń do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego z wykorzystaniem polietylenowej pipety ssącej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retrogradne znakowanie neuronów jest standardową metodą anatomiczną1,2, która była wykorzystywana również do wprowadzania do neuronów barwników wrażliwych na wapń i napięcie3-6. Zazwyczaj barwniki te aplikuje się w postaci stałych kryształów lub poprzez lokalne wstrzyknięcie pod ciśnieniem za pomocą pipet szklanych. Może to jednak prowadzić do rozcieńczenia barwnika i zmniejszenia intensywności znakowania, szczególnie gdy dyfuzja barwnika wymaga kilku godzin. W niniejszej pracy prezentujemy prostą i niedrogą technikę wprowadzania barwników fluorescencyjnych i jonowo-wrażliwych do neuronów z użyciem polietylenowej pipety ssącej wypełnionej roztworem barwnika. Metoda ta stanowi niezawodny sposób utrzymania wysokiego stężenia barwnika w kontakcie z aksonami przez cały czas trwania procedury wprowadzania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dekstrany fluorescencyjne są wykorzystywane jako narzędzia anatomiczne oraz do obrazowania aktywności neuronalnej1-4. Fields i wsp. al., (2009)4 opublikowano protokół dotyczący stosowania barwników czułych na jony i napięcie w obrębie traktów aksonalnych, z uwzględnieniem rdzenia kręgowego jako modelu badawczego. W niniejszym opracowaniu opisujemy bardziej szczegółową procedurę aplikacji barwników fluorescencyjnych i/lub czułych na jony do przeciętych korzeni brzusznych, korzeni grzbietowych lub dowolnego traktu neuronalnego rdzenia kręgowego w celu in vitro badania optofizjologiczne i morfologiczne.

1. Pipety typu I i typu II

Należy rozpocząć od rozciągnięcia dwóch krótkich odcinków rurek polietylenowych (PE90, marka Clay Adams) nad płomieniem lampy alkoholowej7, aby uzyskać pipety z zwężającymi się końcówkami. Pierwsza pipeta (Typ-I) powinna być krótka (3-7 mm) i posiadać małą końcówkę, która może ciasno utrzymać docelowy korzeń lub szlak (średnica zewnętrzna: 0.2-0.4 mm; średnica wewnętrzna: 0.1-0.3 mm). Następnie należy rozciągnąć drugą pipetę (Typ-II) z dłuższą (8-12 cm), cieńszą trzonkiem i bardzo cienką końcówką (średnica zewnętrzna: 0.2-0.3 mm; średnica wewnętrzna: 0.1-0.2 mm), którą można wsunąć do pipety Typ-I aż do jej końcówki. Druga, cieńsza pipeta będzie służyć odpowiednio do aspiracji i wprowadzania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) oraz roztworu barwnika przez pipetę Typ-I.

2. Pozycjonowanie pipety typu I

Przeprowadzić sekcję i wyizolować rdzeń kręgowy8,9, a następnie umieścić go w kąpieli z ciągłym przepływem schłodzonego aCSF (~16 °C) przez cały proces ładowania. Umieścić pipetę typu I w uchwycie do elektrod (uchwyt do elektrod H1/12, Narishige) w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z strzykawką (strzykawka insulinowa U-100 1ml, Becton Dickenson lub odpowiednik) za pomocą elastycznego przewodu (PharMed BPT, Cole-Parmer, #AY242002; 10 cm) (Rys.1A-B).

3. Aplikacja barwnika

  1. Za pomocą strzykawki należy najpierw naciągnąć aCSF do pipety typu I (Rys. 1B; 2A), a następnie do wypełnianego pęczka aksonów lub korzenia (Rys. 2B). Następnie należy usunąć elastyczną rurkę z tylnego otworu. Pipetę typu II podłącza się do drugiej strzykawki i wprowadza do pipety typu I utrzymującej pęczek aksonów lub korzeń. Używając strzykawki podłączonej do pipety typu II, należy odessać aCSF w taki sposób, aby pozostały roztwór aCSF ledwo przykrywał pęczek aksonów (Rys. 1C; 2C-D). Następnie należy wyciągnąć pipetę typu II z pipety typu I. Poziom aCSF należy monitorować przez kilka minut, aby zweryfikować szczelność zamknięcia pęczka aksonów lub nerwów (patrz sekcja 3 w Rozwiązywaniu problemów pod hasłem „good seal”).
  2. Barwnik należy rozpuścić w aCSF lub 0,2% triton X-100 w wodzie dwukrotnie destylowanej i naciągnąć do pipety typu II, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pipetę typu II zawierającą barwnik należy wprowadzić do pipety typu I i do pozostałego roztworu aCSF (Rys. 2E). Barwnik należy powoli uwalniać do aCSF, stosując delikatne nadciśnienie (Rys. 2F). Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i nie spowodować przemieszczenia docelowej tkanki z wnętrza końcówki. Pipetę typu II należy wyciągnąć po uwolnieniu odpowiedniej ilości barwnika (3-5 μL roztworu barwnika).

4. Inkubacja

Inkubować tkankę w ciemności od 6 do 20 godzin, w zależności od rodzaju eksperymentu. Po upływie czasu wystarczającego do wypełnienia, ostrożnie wyciągnąć elektrodę z tkanki, pozostawiając ją do obrazowania lub badania histologicznego.

Rozwiązywanie problemów

  1. Jeśli tkanka docelowa nie wchodzi łatwo do końcówki pipety typu I lub jest luźna po wprowadzeniu, oznacza to, że średnica końcówki jest niewłaściwa. W takim przypadku wyciągnij ją i użyj innej pipety.
  2. Przed dodaniem barwnika do aCSF w pipecie typu I upewnij się, że pozostało wystarczająco dużo aCSF, aby można było do niego dotrzeć końcówką pipety typu II (Ryc. 2D). W przeciwnym razie po dodaniu barwnika powstanie przerwa powietrzna. Jeśli tak się stanie, nie dodawaj barwnika, wyjmij wiązkę aksonalną z pipety, a następnie wciągnij ją ponownie z wystarczającą ilością aCSF, aby była dostępna dla pipety typu II.
  3. Jeśli poziom aCSF w pipecie typu I wzrośnie po aspiracji pipetą typu II, oznacza to, że uszczelnienie z tkanką jest niedoskonałe. Użyj innej elektrody, w przeciwnym razie barwnik zostanie rozcieńczony podczas procedury znakowania.
  4. Jeśli podczas wstrzykiwania barwnika do pipety typu I dostanie się pęcherzyk powietrza, usuń go, przesuwając końcówkę pipety typu II blisko pęcherzyka i delikatnie stosując słabe podciśnienie za pomocą dołączonej strzykawki.

5. Reprezentatywne wyniki

Aby zilustrować zastosowanie tej metody, jednocześnie wprowadziliśmy do motoneuronów, aferentnych neuronów czuciowych i interneuronów rdzeniowych trzy różne barwniki fluorescencyjne sprzężone z dekstranem (Rys. 3A). Jak pokazano na Rys. 3B, oznakowano trzy klasy neuronów: aferentne neurony czuciowe (czerwony), interneurony rzutujące do sznura przedniego (zielony) oraz motoneurony (niebieski).

Schemat uchwytu do pipet z pipetami typu I i typu II, elastycznym drenem oraz strzykawką 1 cc do laboratorium.
Rycina 1. Schemat przedstawiający montaż pipety typu I i typu II. (A) Pipeta typu I (jasnoniebieska) jest umieszczona w uchwycie do elektrod w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z elastycznym drenem elastomerowym (B), do którego można wsunąć pipetę typu II (C).

Schemat zestawu rurek korzenia rdzeniowego do aplikacji aCSF za pomocą elastycznego elastomeru, proces wstrzykiwania barwnika.
Rycina 2. Schemat przedstawiający proces obciążania motoneuronów barwnikami fluorescencyjnymi. (A) Pipetę typu I umieszcza się w pobliżu korzenia brzusznego, który ma zostać wypełniony. (B) Do pipety przykłada się ssanie, aby zaciągnąć aCSF do pipety, a następnie do korzenia. (C-D) Odłącz elastyczną rurkę elastomerową z tylnej części pipety typu I i zmniejsz ilość aCSF, stosując ssanie w pipecie typu II. (E) Wprowadź końcówkę pipety typu II zawierającej rozpuszczony barwnik do pozostałego aCSF w pipecie typu I. (E-F) Powoli wypełnij pipetę typu I barwnikiem, a następnie wyjmij pipetę typu II.

Znakowanie fluorescencyjne w rdzeniu kręgowym: wypełnienie barwnikiem dekstranowym, drogi neuronalne, schemat przekroju poprzecznego.
Rysunek 3. Zastosowanie procedury wypełniania w izolowanym rdzeniu kręgowym myszy. (A) Schemat przedstawiający trzy pipety typu I użyte do wypełnienia różnych klas neuronów w rdzeniu kręgowym. Motoneurony (niebieski; dekstran Cascade Blue) oraz sakralne aferenty czuciowe (czerwony; dekstran Texas-Red) zostały wypełnione wstecznie odpowiednio przez korzenie brzuszne i grzbietowe. Dekstran z fluoresceiną został użyty do obciążenia interneuronów rdzeniowych (zielony), których aksony biegną wstępująco przez sznur brzuszny (VF). 1 mg każdego barwnika dekstranowego (10,000MW; Molecular Probes) rozpuszczono w 6 μL wody destylowanej zawierającej 0.2% Triton X-100 (B). Obraz konfokalny przekroju przez rdzeń sakralny, w którym neurony zostały oznakowane wstecznie zgodnie z opisem w punkcie A. Należy zauważyć, że oznakowane aferenty czuciowe są głównie ipsilateralne z kilkoma projekcjami kontralateralnymi. Oznakowane motoneurony znajdują się ipsilateralnie względem wypełnionego korzenia brzusznego, natomiast oznakowane interneurony znajdują się kontralateralnie względem strony wypełnienia (grot strzałki). Pasek kalibracyjny 200 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj prosty i tani protokół wprowadzania barwników do neuronów, nerwów i szlaków rdzeniowych. Metoda ta polega na wystawieniu zidentyfikowanych dróg anatomicznych na działanie wysoce stężonego roztworu barwnika przez cały czas trwania procesu obciążania. Skutkuje to znakowaniem wstecznym miejsca docelowego przy niewielkim poziomie tła w porównaniu do mikroiniekcji, aplikacji kąpielowej oraz technik elektroporacji. Metoda ta jest jednak ograniczona do miejsc w układzie nerwowym, w których można wyizolować pęcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez program wewnętrzny Narodowych Instytutów Zaburzeń Neurologicznych i Udaru w ramach Narodowych Instytutów Zdrowia. Chcielibyśmy również podziękować dr. George'owi Mentisowi za jego wcześniejszy wkład w opracowanie metody oraz dane przedstawione na Rysunku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
  2. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  3. McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
  4. Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3(2009).
  5. O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
  6. Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
  7. Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580(2011).
  8. Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
  9. Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660(2010).
  10. Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
  11. Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
  12. Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
  13. O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

szlaki neuronalnepipeta polietylenowadyfuzja barwnikaszlak aksonalnybarwnik jonoselektywnyobrazowanie konfokalnebadania elektrofizjologiczne

Powiązane artykuły