Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Podsumowanie

Opisujemy strategię monitorowania dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w odpowiedzi na owalbuminę w warunkach wywołanego owalbuminą alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. Strategię tę można zmodyfikować w celu oceny migracji komórek dendrytycznych płuc w warunkach infekcji.

Streszczenie

Komórki dendrytyczne (DCs) są kluczowymi elementami uczestniczącymi w inicjowaniu adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej poprzez aktywację swoistych dla antygenu limfocytów T. W stanie spoczynku komórki DC występują w tkankach obwodowych; jednak w odpowiedzi na stymulację antygenem, komórki DC pochłaniają antygen i szybko migrują do drenujących węzłów chłonnych, gdzie inicjują odpowiedź limfocytów T przeciwko temu antygenowi^1,2. Ponadto komórki DC odgrywają również kluczową rolę w inicjowaniu odpowiedzi autoimmunologicznej, jak i alergicznej³.

Komórki dendrytyczne (DCs) odgrywają istotną rolę zarówno w inicjacji odpowiedzi immunologicznej, jak i w indukcji tolerancji w środowisku płuc⁴. Środowisko płuc jest w dużej mierze tolerogenne ze względu na ekspozycję na szeroki wachlarz antygenów środowiskowych⁵. Jednak u niektórych osób dochodzi do przełamania tolerancji, co prowadzi do indukcji alergii i astmy. W niniejszym badaniu opisujemy strategię, która może być wykorzystana do monitorowania dojrzewania i migracji DCs w drogach oddechowych w odpowiedzi na antygen użyty do uczulenia. Pomiar dojrzewania i migracji DCs w drogach oddechowych pozwala na ocenę kinetyki odpowiedzi immunologicznej podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych, a także pomaga w zrozumieniu nasilenia następującej po nim odpowiedzi immunologicznej oraz leżących u jej podstaw mechanizmów.

Nasza strategia opiera się na wykorzystaniu owalbuminy jako czynnika uczulającego. Astma alergiczna indukowana owalbuminą jest powszechnie stosowanym modelem służącym do odtworzenia eozynofilii dróg oddechowych, stanu zapalnego płuc oraz podwyższonego poziomu IgE występujących podczas astmy^6,7. Po uczuleniu myszy poddawane są ekspozycji poprzez donosowe podanie owalbuminy znakowanej FITC, co pozwala na specyficzne znakowanie komórek dendrytycznych (DC) dróg oddechowych, które pochłaniają owalbuminę. Następnie, wykorzystując kilka swoistych markerów DC, możemy ocenić dojrzewanie tych komórek, a także analizować ich migrację do drenujących węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Sensybilizacja myszy owalbumimą

1. Przygotować roztwór OVA (stopień V; Sigma, MO) w sterylnym PBS o stężeniu 1 mg/ml (roztwór można przechowywać w temperaturze -80 °C).
2. W celu przygotowania mieszaniny OVA-Alum, umieścić Alum w probówce i dodać roztwór OVA kropla po kropli, w proporcji 1:1, mieszając zawartość w wirówce typu vortex. Mieszać mieszaninę przez 30 minut i użyć niezwłocznie po wymieszaniu.
3. Za pomocą strzykawki 1 ml wstrzyknąć 0,2 ml mieszaniny do jamy otrzewnej myszy; iniekcję powtórzyć po 2 tygodniach.

2. Donosowe wyzwanie myszy owalbuminą znakowaną FITC

1. 7 dni po drugim wstrzyknięciu OVA-Alum myszy są gotowe do podania wewnątrznosowego OVA-FITC w celu wywołania reakcji.
2. Przygotować roztwór OVA-FITC (Sigma) w sterylnym PBS o stężeniu 1 mg/ml i przechowywać w alikwotach w temperaturze -80 °C.
3. Umieścić sterylną gazę na dnie probówki typu Falcon o pojemności 50 ml i w dygestorium dodać 5 ml Aerrane na gazę. Aby znieczulić myszy, umieścić zwierzę w probówce na około 5-10 sekund.
4. Trzymać znieczulone zwierzę w pozycji pionowej i za pomocą sterylnych końcówek do pipet podawać po kropli 100 μl roztworu OVA-FITC do nozdrzy myszy.
5. Powtarzać podanie wewnątrznosowe OVA-FITC przez kolejne dwa dni.

3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z płuc i drenujących węzłów chłonnych

1. Uśmierć myszy poprzez wstrzyknięcie Euthanylu drogą dosytnieniową.
2. W celu ograniczenia zanieczyszczenia makrofagami, które może utrudnić analizę DC, przeprowadza się przemywanie płuc. Aby wypłukać płuca, krótko odsłania się tchawice myszy i kaniuluje je za pomocą cewnika i strzykawki; przy użyciu lodowatego PBS z 5 mM EDTA dolne drogi oddechowe płucze się 3 razy, aby usunąć komórki z przestrzeni pęcherzykowych.
3. Przepłucz płuca 10 ml PBS zawierającego 10 U/ml heparyny poprzez prawą komorę serca, aby usunąć komórki krwi z naczyń krwionośnych płuc. Wykonuj perfuzję do momentu, aż płuca staną się białe, co wskazuje na usunięcie większości komórek krwi. Jest to szczególnie istotne w celu usunięcia zanieczyszczających komórek z krwi obwodowej.
4. Wypreparuj płuca, usuń węzły chłonne śródpiersiowe (MLN) i umieść je w osobnej szalce. (Staraj się zminimalizować ekspozycję tkanek na światło, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji FITC).
5. Umieść płuca na płytce Petriego i posiekaj je nożyczkami. Następnie traw płuca przez 25 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu 250 U/ml kolagenazy D (Roche), a po kolejnych 5 minutach dodaj EDTA (stężenie końcowe 10 mM), aby zatrzymać aktywność kolagenazy.
6. Przepuść fragmenty strawionych płuc przez sito komórkowe o oczkach 100 μm i przeprowadź lizę hipotoniczną w celu usunięcia erytrocytów. Jednokomórkowa zawiesina jest gotowa do dalszej analizy DC.
7. W celu przygotowania jednokomórkowej zawiesiny z MLN, rozdrobnij MLN za pomocą cienkich igieł i traw kolagenazą zgodnie z opisem powyżej, a następnie przefiltruj przez sito komórkowe.

4. Barwienie markerów DC w celu oceny dojrzewania/migracji

1. W celu identyfikacji komórek dendrytycznych (DCs) w płucach wykonuje się barwienie na CD11c oraz CD11b. Ponadto, aby ocenić stopień dojrzewania, wykonuje się barwienie na CD86 i CD80, których ekspresja wzrasta w miarę dojrzewania komórek dendrytycznych. Komórki CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺ w węzłach chłonnych środowiskowych (MLN) są identyfikowane jako płucne DCs migrujące z płuc do MLN w odpowiedzi na podanie OVA w drogach oddechowych.
2. Resuspender komórki do stężenia 10 x 10⁶ komórek/ml w buforze FACS (PBS z 1% FBS i 1mM EDTA) i odmierzyć 150 μl zawiesiny komórkowej na probówkę do barwienia FACS. Do identyfikacji płucnych DCs wymagane są następujące barwienia: kontrola niebarwiona (komórki płuc myszy nieeksponowanych na OVA-FITC), kontrola OVA-FITC, kontrola pojedyncza CD11c, kontrola pojedyncza CD11b, kontrola podwójna CD11b⁺CD11c⁺, kontrola podwójna CD11b⁺OVA-FITC⁺, kontrola podwójna CD11c⁺OVA-FITC⁺, kontrola pojedyncza MHC II, kontrola pojedyncza CD86, kontrola pojedyncza CD80 oraz próbki barwione na OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺MHCII⁺, OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺CD86⁺ oraz OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺CD80⁺.
3. Aby ocenić migrację DCs, należy przeprowadzić absolutne liczenie komórek w zawiesinie pojedynczych komórek z MLN, a następnie przygotować następujące probówki: kontrola niebarwiona (komórki MLN od myszy nieeksponowanych na OVA-FITC), kontrola OVA-FITC, kontrola pojedyncza CD11c⁺, kontrola podwójna CD11b⁺, kontrola podwójna CD11b⁺OVA-FITC⁺, kontrola podwójna CD11c⁺OVA-FITC⁺ oraz próbki CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺.

5. Reprezentatywne wyniki

Punkty czasowe wymagane do sensytyzacji domięśniowej w celu wywołania alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych są istotne i powinny być realizowane zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1. Po sensytyzacji domięśniowej i prowokacji OVA w drogach oddechowych, w celu potwierdzenia indukcji alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych, można poświęcić część myszy i przeprowadzić analizy histologiczne przekrojów płuc, jak pokazano na Rysunku 2. Obecność komórek zapalnych można potwierdzić za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (Rysunek 2A), a produkcję śluzu można ocenić za pomocą barwienia kwasem okresowym i Schiffem (Rysunek 2B). Łącznie potwierdzi to indukcję alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych po prowokacji OVA u myszy sensytyzowanych OVA⁸. W przeciwieństwie do nich, w przekrojach płuc myszy traktowanych solą fizjologiczną oczekuje się braku jakiegokolwiek stanu zapalnego oraz braku produkcji śluzu. Ponadto, po prowokacji OVA, płucne komórki DC ulegają dojrzewaniu i następującej po nim migracji do drenujących węzłów chłonnych. Analiza komórek CD11c⁺ w węzłach chłonnych śródpiersia (MLN) myszy sensytyzowanych i prowokowanych OVA powinna wykazać wyższą proporcję komórek CD11c⁺ w porównaniu do myszy traktowanych solą fizjologiczną (Rysunek 3A). Ponadto analiza absolutnej liczby komórek CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺ w MLN myszy sensytyzowanych i prowokowanych OVA powinna wykazać liczbę znacząco wyższą (tzn. kilkukrotnie wyższą) niż w przypadku myszy traktowanych solą fizjologiczną (Rysunek 3B).

Rycina 1. Protokół eksperymentalny indukcji alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych indukowanego owalbuminą (OVA) u myszy wraz z prowokacją dróg oddechowych owalbuminą znakowaną FITC (OVA-FITC).

Rycina 2. Sensybilizacja OVA, a następnie wyzwalanie dróg oddechowych OVA prowadzi do indukcji alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych, co zidentyfikowano w barwieniu hematoksyliną i eozyną przekrojów płuc pokazanych w (A), a także prowadzi do produkcji śluzu w drogach oddechowych, co zidentyfikowano w barwieniu kwasem okresowym i Schiffem przekrojów płuc pokazanych w (B).

Rycina 3. Wyzwanie OVA-FITC indukuje migrację komórek DC z płuc do węzłów chłonnych śródpiersia (MLN). (A) Wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiające proporcje komórek CD11c⁺ w MLN myszy kontrolnych lub uczulonych na OVA. (B) Bezwzględna liczba komórek CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺ w MLN myszy poddanych działaniu soli fizjologicznej lub uczulonych na OVA. *p<0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną figurę.

Dyskusja

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu oferuje podejście oparte na cytometrii przepływowej do analizy komórek dendrytycznych (DC) płuc, wykorzystujące podanie OVA-FITC w celu wywołania reakcji w drogach oddechowych. Pozwala to na selektywne monitorowanie DC płuc, które pobierają OVA-FITC, dzięki czemu monitorowane populacje DC są de facto tymi, które uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej dróg oddechowych podczas przebiegu indukowanego przez OVA alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. U myszy kontrolnych,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ovalbumina	Sigma-Aldrich	A5503
Ałun	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Kolagenaza D	Roche	11088858001
Przeciwciała	e-Bioscience