Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc podczas alergicznego zapalenia dróg oddechowych

Summary

Opisujemy strategię monitorowania dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w odpowiedzi na albuminę jaja kurzego w warunkach alergicznego zapalenia dróg oddechowych wywołanego albuminą jaja kurzego. Strategia ta może być modyfikowana w celu oceny migracji komórek dendrytycznych płuc w warunkach infekcji.

Abstract

Komórki dendrytyczne (DC) są kluczowymi graczami zaangażowanymi w inicjację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej poprzez aktywację limfocytów T specyficznych dla antygenu. DC są obecne w tkankach obwodowych w stanie stacjonarnym; jednak w odpowiedzi na stymulację antygenu DC pobierają antygen i szybko migrują do drenujących węzłów chłonnych, gdzie inicjują odpowiedź limfocytów T przeciwko antygenowi^1,2. Ponadto DC odgrywają również kluczową rolę w inicjowaniu autoimmunologicznej i alergicznej odpowiedzi immunologicznej³.

DC odgrywają istotną rolę zarówno w inicjacji odpowiedzi immunologicznej, jak i indukcji tolerancji w środowisku płuc⁴. Środowisko płuc jest w dużej mierze tolerogenne ze względu na ekspozycję na szeroki wachlarz antygenów środowiskowych⁵. Jednak u niektórych osób dochodzi do przerwy w tolerancji, co prowadzi do indukcji alergii i astmy. W tym badaniu opisujemy strategię, którą można wykorzystać do monitorowania dojrzewania i migracji DC dróg oddechowych w odpowiedzi na antygen używany do uczulenia. Pomiar dojrzewania i migracji DC dróg oddechowych pozwala na ocenę kinetyki odpowiedzi immunologicznej podczas alergicznego zapalenia dróg oddechowych, a także pomaga w zrozumieniu wielkości późniejszej odpowiedzi immunologicznej wraz z mechanizmami leżącymi u jej podstaw.

Nasza strategia opiera się na wykorzystaniu albuminy jaja kurzego jako środka uczulającego. Astma alergiczna wywołana albuminą jaja kurzego jest szeroko stosowanym modelem do odtwarzania eozynofilii dróg oddechowych, zapalenia płuc i podwyższonego poziomu IgE występującego podczas astmy^6,7. Po uczuleniu myszy są prowokowane przez donosowe podawanie albuminy jaja kurzego znakowanej FITC, co pozwala na specyficzne znakowanie DC dróg oddechowych, które wychwytują albuminę jaja kurzego. Następnie, używając kilku markerów specyficznych dla DC, możemy ocenić dojrzewanie tych DC, a także możemy ocenić ich migrację do drenujących węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej.

Protocol

1. Uczulenie myszy na albuminę jaja kurzego

1. Przygotować roztwór OVA (stopień V; Sigma, MO) w sterylnym PBS w stężeniu 1 mg/ml (roztwór może być przechowywany w temperaturze -80 °C).
2. W celu przygotowania mieszaniny OVA-Ałun należy wziąć ałun do probówki i dodawać roztwór OVA kroplami, jednocześnie wirując probówkę w stosunku 1:1. Mieszaj mieszaninę przez 30 minut i użyj od razu po wymieszaniu.
3. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć 0,2 ml mieszaniny do mysiej jamy otrzewnowej i powtórzyć wstrzyknięcie ponownie po 2 tygodniach.

2. Donosowe wyzwanie myszy z albuminą jaja kurzego znakowaną FITC

1. 7 dni po drugim wstrzyknięciu OVA-Alum myszy są gotowe do donosowego prowokacji OVA-FITC.
2. Przygotować roztwór OVA-FITC (Sigma) przy użyciu sterylnego PBS o stężeniu 1 mg/ml i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C.
3. Umieść sterylną gazę na dnie probówki sokoła o pojemności 50 ml i w kapturze chemicznym dodaj 5 ml Aerrane na gazę. W celu znieczulenia myszy należy skierować zwierzę do rurki na około 5-10 sekund.
4. Trzymaj znieczulone zwierzę w pozycji pionowej i za pomocą sterylnych końcówek pipet nanieś 100 μl roztworu OVA-FITC na nozdrza myszy w sposób kroplami.
5. Powtórz prowokację donosową z OVA-FITC przez następne dwa dni.

3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z płuc i drenujących węzłów chłonnych

1. Poświęć myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia eutanylu.
2. W celu zmniejszenia zanieczyszczenia makrofagami, które może komplikować analizę DC, przeprowadza się płukanie płuc. Aby przepłukać płuca, tchawice myszy są na krótko odsłaniane i kaniulowane za pomocą cewnika i strzykawki; za pomocą lodowatego PBS z 5 mM EDTA, dolne drogi oddechowe są płukane 3 razy w celu usunięcia komórek z przestrzeni pęcherzykowych.
3. Wykonać perfuzję płuc za pomocą 10 ml PBS zawierającego 10 j./ml heparyny przez prawą komorę serca, aby usunąć krwinki z układu naczyniowego płuc. Wykonuj perfuzje, aż płuca staną się białe, co wskazuje na usunięcie większości komórek krwi. Jest to szczególnie ważne w celu usunięcia komórek zanieczyszczających z krwi obwodowej.
4. Wypreparuj płuca i usuń śródpiersiowe węzły chłonne (MLN) i umieść węzły chłonne w osobnym naczyniu. (Staraj się zminimalizować ekspozycję tkanek na światło, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji FITC.)
5. Umieść płuca na szalce Petriego i zmiel nożyczkami. Następnie trawić płuca przez 25 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu 250 U/ml kolagenazy D (Roche) i dodawać EDTA (10 mM stężenie końcowe) przez następne 5 minut, aby zatrzymać aktywność kolagenazy.
6. Przepuść fragmenty strawionych płuc przez sitko do komórek o wielkości 100 μm i wykonaj hipotoniczną lizę w celu usunięcia erytrocytów. Zawiesina jednokomórkowa jest gotowa do dalszej analizy DC.
7. W celu przygotowania zawiesiny jednokomórkowej z MLN, należy drażnić MLN za pomocą cienkich igieł i trawić kolagenazą, jak opisano powyżej, a następnie przecedzić przez sitko komórkowe.

4. Barwienie markerów DC do oceny dojrzewania/migracji

1. W celu zidentyfikowania DC w płucach przeprowadza się barwienie CD11c i CD11b. Ponadto, aby ocenić dojrzałość, przeprowadza się barwienie CD86 i CD80, które są regulowane w górę w miarę dojrzewania DC. Komórki CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺ w MLN są identyfikowane jako płucne DC migrujące z płuc do MLN w odpowiedzi na prowokację dróg oddechowych OVA.
2. Zawiesić komórki w stężeniu 10 x 10⁶ komórek/ml w buforze FACS (PBS z 1% FBS i 1mM EDTA) i podwielokrotnym 150 μl zawiesiny komórek / probówki do barwienia FACS. Do identyfikacji DC płuc potrzebne są następujące barwienia: kontrola niebarwiona (komórki płuc myszy nienarażone na działanie OVA-FITC), OVA-FITC kontrola, CD11c pojedyncza kontrola, CD11b pojedyncza kontrola, CD11b⁺CD11c⁺ podwójna kontrola, CD11b⁺ OVA-FITC⁺ podwójna kontrola, CD11c⁺ OVA-FITC⁺ podwójna kontrola, MHC II pojedyncza kontrola, CD86 pojedyncza kontrola, CD80 pojedyncza kontrola i próbki barwione dla OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺MHCII⁺, OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺CD86⁺ oraz OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺CD80⁺.
3. Aby ocenić migrację prądu stałego, należy przeprowadzić bezwzględną liczbę komórek zawiesiny pojedynczej komórki z MLN, a następnie przygotować następujące probówki: kontrola niebarwiona (komórki MLN od myszy nienarażonych na działanie OVA-FITC), kontrola OVA-FITC, pojedyncza kontrola CD11c⁺, podwójna kontrola CD11b⁺, podwójna kontrola CD11b+OVA-FITC⁺, podwójna kontrola CD11c⁺OVA-FITC⁺ i próbki CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺.

5. Reprezentatywne wyniki

Punkty czasowe wymagane do wywołania alergicznego zapalenia dróg oddechowych są ważne i powinny być przeprowadzone tak, jak pokazano na rysunku 1. Po uczuleniu dootrzewnowym i prowokacji OVA dróg oddechowych, w celu potwierdzenia indukcji alergicznego zapalenia dróg oddechowych, niektóre myszy można poświęcić i przeprowadzić analizy histologiczne na odcinkach płuc, jak pokazano na rycinie 2. Obecność komórek zapalnych można potwierdzić za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (ryc. 2A), a obecność produkcji śluzu można ocenić za pomocą barwienia kwasem okresowym Schiffa (ryc. 2B). W sumie potwierdzi to indukcję alergicznego zapalenia dróg oddechowych po prowokacji OVA myszy uczulonych na OVA⁸. W przeciwieństwie do tego, oczekuje się, że skrawki płuc myszy leczonych solą fizjologiczną będą wolne od jakiegokolwiek stanu zapalnego wraz z brakiem produkcji śluzu. Co więcej, po prowokacji OVA płucne DC ulegają dojrzewaniu, a następnie migracji do drenujących węzłów chłonnych. Oczekuje się, że analiza komórek CD11c ⁺ w węzłach chłonnych śródpiersia (MLN) od myszy uczulonych i prowokowanych OVA wykaże wyższy odsetek komórek CD11c ⁺ w porównaniu z myszami leczonymi solą fizjologiczną (Figura 3A). Co więcej, oczekuje się, że analiza bezwzględnej liczby komórek CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ w MLN myszy uwrażliwionych na OVA i prowokowanych wykaże znacznie wyższą (tj. kilkakrotnie wyższą) liczbę niż odpowiedniki myszy leczonych solą fizjologiczną (Figura 3B).

Rysunek 1. Eksperymentalny protokół indukcji albuminy jaja kurzego (OVA) wywołanego alergicznym zapaleniem dróg oddechowych u myszy wraz z prowokacją dróg oddechowych albuminą jaja kurzego znakowaną FITC (OVA-FITC).

Rysunek 2. Uczulenie na OVA, a następnie prowokacja dróg oddechowych OVA, prowadzi do indukcji alergicznego zapalenia dróg oddechowych, jak zidentyfikowano przez barwienie hematoksyliną i eozyną odcinków płuc pokazanych w (A), a także prowadzi do produkcji śluzu w drogach oddechowych, jak zidentyfikowano w wyniku okresowego barwienia kwasem Schiffa odcinków płuc, jak pokazano w (B).

Rysunek 3. Prowokacja OVA-FITC indukuje migrację prądu stałego z płuc do węzłów chłonnych śródpiersia (MLN). (A) Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające proporcje komórek CD11c ⁺ w MLN myszy kontrolnych lub uwrażliwionych na OVA. (B) Bezwzględna liczba komórek CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC⁺ w MLN myszy z solą fizjologiczną lub uczulonymi na OVA. *p<0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Discussion

Przedstawiona tutaj metoda oferuje podejście oparte na cytometrii przepływowej do analizy płucnych DC, oparte na dostarczaniu OVA-FITC do prowokacji dróg oddechowych. Pozwala to na selektywne monitorowanie płucnych DC które pobierają OVA-FITC, a zatem populacje DC, które są monitorowane, są w rzeczywistości tymi, które uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej dróg oddechowych w przebiegu alergicznego zapalenia dróg oddechowych wywołanego przez OVA. U myszy kontrolnych, przy braku alergicznego zapalenia dróg oddechowych, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina jaja kurzego	Sigma-Aldrich	A5503
Ałun	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Kolagenaza D	Roche	11088858001
Przeciwciała	e-Bioscience